Salmonella enterica DNA adenine methyltransferase mutant: ideal strains for vaccine development?

La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el gen dam se ha propuesto como método de atenuación para una gran variedad de especies bacterianas. Dado nuestro interés en el estudio y prevención de las infecciones por Salmonella Enteritidis (serovariedad que con mayor frecuencia causa enterocolitis en humanos) generamos mutantes dam de dicha serovariedad, mediante mutagénesis por transposición y por mutagénesis dirigida por reemplazo. Curiosamente, los estudios en ratones Balb/c mostraron que las mutantes dam de S. Enteritidis, son sólo moderadas en su atenuación, ya que un 30 % de los animales inoculados por la vía intragástrica con la mutante muere dentro de las 3 semanas. Por otro lado, la protección de los animales inmunizados, contra el desafío con la cepa virulenta de Salmonella Enteritidis #5694, no alcanzó niveles aceptables. Dado el papel crítico que los macrófagos desempeñan en la inmunidad innata contra Salmonella, analizamos la interacción entre la mutante SEΔdam y la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Mediante ensayos de Western blot pudo determinarse que la expresión de moléculas proinflamatorias en los macrófagos infectados con SEΔdam está atenuada. Como en parte, la activación de la respuesta inflamatoria del macrófago se genera a través de antígenos bacterianos, nos preguntamos si la carencia de Dam podría estar afectando la estructura o función de ciertas proteínas efectoras o del lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Enteritidis. Estudiamos entonces la participación de la proteína Dam sobre la síntesis y secreción de dos proteínas efectoras dependientes del Sistema de Secreción Tipo Tres (SSTT-1). A este fin debieron construirse y caracterizarse mutantes dam de Salmonella portadoras de genes sopA y sopB marcados con el epítope FLAG. Los resultados obtenidos mostraron que la mutante dam posee una reducida expresión y secreción de las proteínas de invasión SopA y SopB, dependientes de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI- 1). Este hallazgo indica que la metilación por Dam participa en la regulación de la síntesis y secreción de SopA y SopB en Salmonella como un activador de estos genes. Investigamos también la participación de la enzima Dam en la síntesis del LPS de S. Enteritidis. Encontramos que la mutante SEΔdam sintetiza LPS con un antígeno polisacárido O de cadenas más cortas que el de la cepa parental. Dado que Wzz es responsable en la distribución del largo de cadena del antígeno O, analizamos si la metilación por Dam está involucrada en la regulación de la expresión del gen wzz. El análisis densitométrico de Western Blot con muestras de extractos proteicos mostró que la cantidad relativa de proteína Wzz producida por SEΔdam, es tres veces menor que la producida por la cepa parental. Concomitantemente, la actividad del promotor de wzz en SEΔdam medida con fusión transcripcional cromosómica con un gen reportero y la cantidad de ARNm medido por RT-PCR cuantitativa a tiempo real se vieron reducidas. También se redujo la expresión de los genes pmrA y rcsB (dos reguladores de wzz) en la mutante dam. Sin embargo, el defecto de SEΔdam en la distribución del largo de cadena del antígeno O, sólo se asoció con RcsB. Nuestros resultados demuestran que la metilación por Dam regula la síntesis del LPS en Salmonella. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la metilación por Dam en Salmonella regula funciones relacionadas íntimamente con la interacción huésped-bacteria. Por lo tanto, la deleción del gen dam como método de atenuación en cepas vacunales debe ser analizada críticamente

Salmonella enterica DNA adenine methyltransferase mutant: ideal strains for vaccine development?

La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el gen dam se ha propuesto como método de atenuación para una gran variedad de especies bacterianas. Dado nuestro interés en el estudio y prevención de las infecciones por Salmonella Enteritidis (serovariedad que con mayor frecuencia causa enterocolitis en humanos) generamos mutantes dam de dicha serovariedad, mediante mutagénesis por transposición y por mutagénesis dirigida por reemplazo. Curiosamente, los estudios en ratones Balb/c mostraron que las mutantes dam de S. Enteritidis, son sólo moderadas en su atenuación, ya que un 30 % de los animales inoculados por la vía intragástrica con la mutante muere dentro de las 3 semanas. Por otro lado, la protección de los animales inmunizados, contra el desafío con la cepa virulenta de Salmonella Enteritidis #5694, no alcanzó niveles aceptables. Dado el papel crítico que los macrófagos desempeñan en la inmunidad innata contra Salmonella, analizamos la interacción entre la mutante SEΔdam y la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Mediante ensayos de Western blot pudo determinarse que la expresión de moléculas proinflamatorias en los macrófagos infectados con SEΔdam está atenuada. Como en parte, la activación de la respuesta inflamatoria del macrófago se genera a través de antígenos bacterianos, nos preguntamos si la carencia de Dam podría estar afectando la estructura o función de ciertas proteínas efectoras o del lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Enteritidis. Estudiamos entonces la participación de la proteína Dam sobre la síntesis y secreción de dos proteínas efectoras dependientes del Sistema de Secreción Tipo Tres (SSTT-1). A este fin debieron construirse y caracterizarse mutantes dam de Salmonella portadoras de genes sopA y sopB marcados con el epítope FLAG. Los resultados obtenidos mostraron que la mutante dam posee una reducida expresión y secreción de las proteínas de invasión SopA y SopB, dependientes de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI- 1). Este hallazgo indica que la metilación por Dam participa en la regulación de la síntesis y secreción de SopA y SopB en Salmonella como un activador de estos genes. Investigamos también la participación de la enzima Dam en la síntesis del LPS de S. Enteritidis. Encontramos que la mutante SEΔdam sintetiza LPS con un antígeno polisacárido O de cadenas más cortas que el de la cepa parental. Dado que Wzz es responsable en la distribución del largo de cadena del antígeno O, analizamos si la metilación por Dam está involucrada en la regulación de la expresión del gen wzz. El análisis densitométrico de Western Blot con muestras de extractos proteicos mostró que la cantidad relativa de proteína Wzz producida por SEΔdam, es tres veces menor que la producida por la cepa parental. Concomitantemente, la actividad del promotor de wzz en SEΔdam medida con fusión transcripcional cromosómica con un gen reportero y la cantidad de ARNm medido por RT-PCR cuantitativa a tiempo real se vieron reducidas. También se redujo la expresión de los genes pmrA y rcsB (dos reguladores de wzz) en la mutante dam. Sin embargo, el defecto de SEΔdam en la distribución del largo de cadena del antígeno O, sólo se asoció con RcsB. Nuestros resultados demuestran que la metilación por Dam regula la síntesis del LPS en Salmonella. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la metilación por Dam en Salmonella regula funciones relacionadas íntimamente con la interacción huésped-bacteria. Por lo tanto, la deleción del gen dam como método de atenuación en cepas vacunales debe ser analizada críticamente.DNA adenine methyltransferase (Dam) enzyme is a global regulator of bacterial gene expression. In previous studies, Salmonella Typhimurium dam mutants have been proposed as excellent vaccines strains because of their characteristic of attenuation and protective capabilities. By extension, dam gene mutation has been proposed as a method for attenuating a variety of bacterial species. Given our interest in the study and prevention of infections with Salmonella Enteritidis, a serotype that most commonly causes enterocolitis in humans, we generate S. Enteritidis dam mutants by transposition and site-directed mutagenesis by replacement. Interestingly, studies in Balb/c mice showed that the S. Enteritidis dam mutants, are only moderate in their attenuation. Thirty percent (30%) of animals inoculated by the intragastric route with the mutant died within 3 weeks. Moreover, the protection of immunized animals challenge with the virulent strain of Salmonella Enteritidis # 5694, did not reach acceptable levels. Given the critical role that macrophages play in innate immunity against Salmonella, we analyzed the interaction between SEΔdam mutant and macrophage cell line RAW 264.7. By Western blot, we found that the expression of inflammatory molecules in macrophages infected with SEΔdam is attenuated. As activation of the inflammatory response of macrophages is generated in part by bacterial antigens, we wondered whether the lack of Dam might be affecting the structure or function of certain effector proteins or lipopolysaccharide (LPS) of Salmonella Enteritidis. Therefore, we studied the involvement of Dam on protein synthesis and secretion of two effector proteins both dependent on type 3 secretion systems. To this purpose, we constructed and characterized Salmonella dam mutants carrying sopA and sopB genes tagged with the FLAG epitope. The results showed that the dam mutant has a reduced expression and secretion of SopA and SopB invasion proteins, which are Salmonella pathogenicity island (SPI-1)-dependent. This finding indicates that Dam methylation is involved in the regulation of the synthesis and secretion of SopA and SopB proteins in Salmonella as an upregulator of these genes. We also investigated the involvement of the Dam enzyme in S. Enteritidis LPS synthesis. We found that compared to the parental strain, a SEΔdam mutant synthesized LPS with shorter O-antigen polysaccharide chain lengths. Since Wzz is responsible for the chain length distribution of O-antigen, we investigated whether Dam methylation is involved in regulating wzz gene expression. Densitometric analysis of Western blot with samples of protein extracts showed that the relative amount of Wzz protein produced by SEΔdam is three-fold lower than that of the parental strain. Concomitantly, wzz gene promoter activity in SEΔdam was reduced, as measured by chromosomal transcriptional fusion with a reporter gene, and this result was further confirmed by the amount of mRNA as measured by RT-PCR quantitative real-time analysis. Also, the expression of pmrA and rcsB genes (two wzz gene regulators) in the dam mutant was reduced. However, the defect in the chain length distribution of O-antigen of the SEΔdam, was associated only with RcsB. Our results show that Dam methylation regulates the LPS synthesis of Salmonella. Overall, these results indicate that Dam methylation in Salmonella regulates functions related intimately to the host-bacteria interaction. Therefore, the dam gene deletion as a method of attenuation of vaccine strains must be analyzed critically.Fil:Sarnacki, Sebastián Hernán. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Mutantes de Salmonella enterica en el gen de ADN adenina metil transferasa (dam). ¿Cepas ideales para la construccion de vacunas?

La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el gen dam se ha propuesto como método de atenuación para una gran variedad de especies bacterianas. Dado nuestro interés en el estudio y prevención de las infecciones por Salmonella Enteritidis (serovariedad que con mayor frecuencia causa enterocolitis en humanos) generamos mutantes dam de dicha serovariedad, mediante mutagénesis por transposición y por mutagénesis dirigida por reemplazo. Curiosamente, los estudios en ratones Balb/c mostraron que las mutantes dam de S. Enteritidis, son sólo moderadas en su atenuación, ya que un 30 % de los animales inoculados por la vía intragástrica con la mutante muere dentro de las 3 semanas. Por otro lado, la protección de los animales inmunizados, contra el desafío con la cepa virulenta de Salmonella Enteritidis #5694, no alcanzó niveles aceptables. Dado el papel crítico que los macrófagos desempeñan en la inmunidad innata contra Salmonella, analizamos la interacción entre la mutante SEΔdam y la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Mediante ensayos de Western blot pudo determinarse que la expresión de moléculas proinflamatorias en los macrófagos infectados con SEΔdam está atenuada. Como en parte, la activación de la respuesta inflamatoria del macrófago se genera a través de antígenos bacterianos, nos preguntamos si la carencia de Dam podría estar afectando la estructura o función de ciertas proteínas efectoras o del lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Enteritidis. Estudiamos entonces la participación de la proteína Dam sobre la síntesis y secreción de dos proteínas efectoras dependientes del Sistema de Secreción Tipo Tres (SSTT-1). A este fin debieron construirse y caracterizarse mutantes dam de Salmonella portadoras de genes sopA y sopB marcados con el epítope FLAG. Los resultados obtenidos mostraron que la mutante dam posee una reducida expresión y secreción de las proteínas de invasión SopA y SopB, dependientes de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI- 1). Este hallazgo indica que la metilación por Dam participa en la regulación de la síntesis y secreción de SopA y SopB en Salmonella como un activador de estos genes. Investigamos también la participación de la enzima Dam en la síntesis del LPS de S. Enteritidis. Encontramos que la mutante SEΔdam sintetiza LPS con un antígeno polisacárido O de cadenas más cortas que el de la cepa parental. Dado que Wzz es responsable en la distribución del largo de cadena del antígeno O, analizamos si la metilación por Dam está involucrada en la regulación de la expresión del gen wzz. El análisis densitométrico de Western Blot con muestras de extractos proteicos mostró que la cantidad relativa de proteína Wzz producida por SEΔdam, es tres veces menor que la producida por la cepa parental. Concomitantemente, la actividad del promotor de wzz en SEΔdam medida con fusión transcripcional cromosómica con un gen reportero y la cantidad de ARNm medido por RT-PCR cuantitativa a tiempo real se vieron reducidas. También se redujo la expresión de los genes pmrA y rcsB (dos reguladores de wzz) en la mutante dam. Sin embargo, el defecto de SEΔdam en la distribución del largo de cadena del antígeno O, sólo se asoció con RcsB. Nuestros resultados demuestran que la metilación por Dam regula la síntesis del LPS en Salmonella. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la metilación por Dam en Salmonella regula funciones relacionadas íntimamente con la interacción huésped-bacteria. Por lo tanto, la deleción del gen dam como método de atenuación en cepas vacunales debe ser analizada críticamente

Salmonella enterica serovar Enteritidis enterocolitis during late stages of gestation induces an adverse pregnancy outcome in the murine model.

Foodborne diseases caused by Salmonella enterica serovar Enteritidis (S. Enteritidis) are a significant health problem. Pregnancy, state of immunological tolerance, is a predisposing condition for the development of infections with intracellular pathogens. Salmonella species can cause pregnancy complications such as chorioamnionitis, transplacental fetal infection, pre term labor, abortions, neonatal and maternal septicemia. However, the specific mechanisms by which Salmonella infections trigger these alterations are not clear. In the present work, using a self-limiting enterocolitis murine model, we show that the ingestion of a low dose of S. Enteritidis at late stages of pregnancy (day 15 of gestation) is sufficient to induce massive maternal infection. We found that Salmonella infection leads to 40% of pre term delivery, 33% of abortion and fetal growth restriction. Placental dysfunction during S. Enteritidis enterocolitis was confirmed through cellular infiltration and hypoxia markers (MPO activity and COX-1 and COX-2 expression, respectively). Apoptosis in placental tissue due to Salmonella infection was also evident at day 18 of gestation when investigated by morphometric procedure, DNA fragmentation and Fas/FasL expression. Also, the expression of IFN-γ, TNF-α, IL-17 and IL-10 was up regulated in response to Salmonella not only in placenta, but also in amniotic fluid and maternal serum. Altogether, our results demonstrate that S. Enteritidis enterocolitis during late stages of gestation causes detrimental effect on pregnancy outcome

Effect of LCFM consumption on intestinal pathology during <i>Salmonella</i> enterocolitis.

<p>A to C: Histology of the intestine 2 days after oral infection with the pathogen. D: Intestinal inflammation scores. EC group: mice received 20 mg of streptomycin 24 h before intragastric infection with 3-4 x 10³ CFU of <i>S</i>. Enteritidis. <i>L. casei</i> + EC group: mice received the probiotic for a week before enterocolitis onset. Control group: untreated mice. (A) EC group: moderate enterocolitis, loss of normal villus architecture and height. (B) <i>L. casei</i> + EC group: regular display of intestinal villus, undistinguishable from Control group (C). HE; 40x. (NS): no significant differences. Data were collected from 3 independent experiments. </p

Schematic diagram of the proposed regulatory network of <i>wzz</i> gene expression in <i>S.</i> Enteritidis.

<p>The regulatory cascade for <i>wzz</i> gene expression involves Dam methylation, PmrB/PmrA and RcsC/RcsD/RcsB two-component regulatory system and a putative third regulator (X). Proteins are indicated by ovals, whereas genes are symbolized by block arrows. Black dots indicate methylation sites (5′-GATC-3′ sequences). Dashed lines indicate direct interactions demonstrated in <i>S.</i> Typhimurium. Positive regulation (induction) is labeled with ↑ and (+), whereas negative regulation (repression) is labeled with ⊥ and (−). The question mark indicates a putative regulation.</p

Effect of LCFM on intestinal IL-10 and TGF-β.

<p>Cytokines expression was analyzed by qPCR. <i>L. casei</i> only group: mice fed for a week with LCFM. EC group: mice received 20 mg of streptomycin 24 h before intragastric infection with 3-4 x 10³ CFU of <i>S</i>. Enteritidis. <i>L. casei</i> + EC group: mice received the probiotic for a week before enterocolitis onset. Control group: untreated mice. <i>L. casei</i> + Strep group: animals were fed with the probiotic for a week and then received streptomycin. Results are expressed as mean +/- SD. Four animals per group were analyzed. (NS): no significant differences. Representative data from 3 independent experiments.</p

Effect of LCFM on mesenteric cytokines after <i>Salmonella</i> enterocolitis.

<p>Cytokine expression was analyzed by qPCR 5 days after oral inoculation with 3-4 x 10³ UFC of the pathogen. EC group: mice received 20 mg of streptomycin 24 h before intragastric infection with 3-4 x 10³ CFU of <i>S</i>. Enteritidis. <i>L. casei</i> + EC group: mice received the probiotic for a week before enterocolitis onset. Control group: untreated mice. <i>L. casei</i> + Strep group: animals were fed with the probiotic for a week and then received streptomycin. Results are expressed as mean +/- SD. Seven animals per group were analyzed. (NS): no significant differences. Representative data from 3 independent experiments. </p

Bacterial strains and plasmids used in this study.

<p>Bacterial strains and plasmids used in this study.</p

Effect of LCFM consumption on joint during <i>Salmonella</i> enterocolitis.

<p><b>A</b>. TNF-α was measured in joint homogenates by ELISA 5 days after oral infection with the pathogen. Five animals per group were analyzed. <b>B</b>. IL-17 expression was analyzed by qPCR at day 5 post infection in joint draining lymph nodes. Seven animals per group were analyzed. EC group: mice received 20 mg of streptomycin 24 h before intragastric infection with 3-4 x 10³ CFU of <i>S</i>. Enteritidis. <i>L. casei</i> + EC group: mice received the probiotic for a week before enterocolitis onset. Control group: untreated mice. <i>L. casei</i> + Strep group: animals were fed with the probiotic for a week and then received streptomycin. Results are expressed as mean +/- SD. (NS): no significant differences. Data were collected from 3 independent experiments. </p