Protocol: methodology for chromatin immunoprecipitation (ChIP) in Chlamydomonas reinhardtii

We report on a detailed chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. The protocol is suitable for the analysis of nucleosome occupancy, histone modifications and transcription factor binding sites at the level of mononucleosomes for targeted and genome-wide studies. We describe the optimization of conditions for crosslinking, chromatin fragmentation and antibody titer determination and provide recommendations and an example for the normalization of ChIP results as determined by real-time PCR

Heat shock factor 1 counteracts epigenetic silencing of nuclear transgenes in Chlamydomonas reinhardtii

We found previously that the Chlamydomonas HSP70A promoter counteracts transcriptional silencing of downstream promoters in a transgene setting. To elucidate the underlying mechanisms, we analyzed chromatin state and transgene expression in transformants containing HSP70A-RBCS2-ble (AR-ble) constructs harboring deletions/mutations in the A promoter. We identified histone modifications at transgenic R promoters indicative for repressive chromatin, i.e. low levels of histone H3/4 acetylation and H3-lysine 4 trimethylation and high levels of H3-lysine 9 monomethylation. Transgenic A promoters also harbor lower levels of active chromatin marks than the native A promoter, but levels were higher than those at transgenic R promoters. Strikingly, in AR promoter fusions, the chromatin state at the A promoter was transferred to R. This effect required intact HSE4, HSE1/2 and TATA-box in the A promoter and was mediated by heat shock factor (HSF1). However, time-course analyses in strains inducibly depleted of HSF1 revealed that a transcriptionally competent chromatin state alone was not sufficient for activating the R promoter, but required constitutive HSF1 occupancy at transgenic A. We propose that HSF1 constitutively forms a scaffold at the transgenic A promoter, presumably containing mediator and TFIID, from which local chromatin remodeling and polymerase II recruitment to downstream promoters is realized

Synthese 1,2,3-triazol-verknüpfter Kohlenhydrat-Übergangsmetallkomplexe

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines modularen Systems zur Synthese von Kohlenhydrat-Übergansmetallkomplexen unter Verwendung der kupferkatalysierten 1,3-dipolaren-Cycloaddition als Methode zur Verknüpfung der Kohlenhydrate (Glucose und Galactose) mit dem Komplexrückgrat. Dabei wurde zunächst aus den drei Rückgratsystemen Dicarboxamid, Bisimino und Pyridin-Triazol eine Kohlenhydratkomplex-Bibliothek aufgebaut. Bei der Umsetzung der Liganden mit Phthalsäurerückgrat konnte keine Komplexierung mit unterschiedlichen Übergangsmetallsalzen erreicht werden. Stattdessen wurden die entsprechenden Phthalimide erhalten. Die systematische Umsetzung der anderen Dicarboxamidligaenden mit verschiedenen Übergangsmetallsalzen konnte zeigen, dass sich durch die Wahl eines geeigneten Metalls zum einen die Anzahl an Zuckerresten des Clusters steuern lässt, und zum anderen eine definierte räumliche Ausrichtung der Zuckerreste erreicht werden kann. Keine der Umsetzungsversuche der Bisimino-Liganden mit Übergangsmetallsalzen führten zur erhofften Komplexierung sondern zum Zersetzung der Verbindungen. Aufgrund dieser Beobachtungen hat sich dieses Rückgrat als ungeeignet erwiesen. Die dargestellten Pyridin-Triazol-Liganden wurden mit Rutheniumsalzen als Vertreter der Übergangsmetalle umgesetzt

DIALIGN P: Fast pair-wise and multiple sequence alignment using parallel processors

BACKGROUND: Parallel computing is frequently used to speed up computationally expensive tasks in Bioinformatics. RESULTS: Herein, a parallel version of the multi-alignment program DIALIGN is introduced. We propose two ways of dividing the program into independent sub-routines that can be run on different processors: (a) pair-wise sequence alignments that are used as a first step to multiple alignment account for most of the CPU time in DIALIGN. Since alignments of different sequence pairs are completely independent of each other, they can be distributed to multiple processors without any effect on the resulting output alignments. (b) For alignments of large genomic sequences, we use a heuristics by splitting up sequences into sub-sequences based on a previously introduced anchored alignment procedure. For our test sequences, this combined approach reduces the program running time of DIALIGN by up to 97%. CONCLUSIONS: By distributing sub-routines to multiple processors, the running time of DIALIGN can be crucially improved. With these improvements, it is possible to apply the program in large-scale genomics and proteomics projects that were previously beyond its scope

Wirtschaftlichkeit und Patientenwohl

Ökonomische Zielsetzungen und die Verwirklichung des Patientenwohls erscheinen schwer vereinbar. Und tatsächlich zeitigen Anreize zum wirtschaftlichen Umgang mit den knappen Ressourcen und Kapazitäten des Gesundheitssystems Fehlentwicklungen, die sowohl für Patienten als auch für das medizinische und nicht-medizinische Personal problematisch sind: So setzen bspw. Fallpauschalen (diagnosis related groups) und sog. Chefarztverträge im Krankenhaus den Anreiz, Diagnose- und Behandlungsentscheidungen aus betriebswirtschaftlichen und nicht nur medizinischen Gründen zu treffen. Das konfligiert mit dem ärztlichen Ethos, dem Fundament der Arzt-Patienten-Beziehung. Eine effiziente Gesundheitsversorgung und daher auch Rationalisierungen sind zwar schon aus Gründen der Zugangs- und Verteilungsgerechtigkeit unabdingbar, doch wird auf Rationalisierungsanreize häufig mit Rationierungen reagiert. Ausgehend von einer Analyse des Ökonomisierungsprozesses der Gesundheitsversorgung und seiner Folgen entwickelt der Beitrag Kriterien zur Beurteilung wirtschaftlichkeitssteigernder Maßnahmen, die den gesetzgeberischen Gestaltungsspielraum nicht einschränken. Sie sind vielmehr notwendige Bedingung, um die politischen und medizinischen Ziele der Gesundheitsversorgung zu verwirklichen und das ihr patientenseitig entgegengebrachte Systemvertrauen zu schützen

Bundestagswahlen und soziale Basis politischer Parteien in der Bundesrepublik (I)

Die Analyse der Klassenbewegung in der Bundesrepublik und die Strategiedebatte der Linken orientiert sich in erster Linie, und das gilt insbesondere für die Prokla, an den veränderten Akkumulationsbedingungen des Kapitals und deren Folgen für die Lage der Arbeiterklasse. Dabei wird angenommen, die Notwendigkeit, die Ausbeutungsrate zu erhöhen, führe zu einer Verschärfung der Klassenkämpfe. Als Belege dieser Annahme dienen etwa die Streiks der Jahre 1969, 1971, 1974 und zuletzt der Druckerstreik dieses Jahres.Eine analytische und strategische Orientierung an ausschließlich ökonomischen Entwicklungstendenzen verleitet möglicherweise zu vorschnellen und ungerechtfertigt optimistischen Einschätzungen der politischen Stoßrichtung akuter oder prognostizierter Klassenauseinandersetzungen. Dieser Optimismus ( 1) dominierte immer dann, wen.n in der Diskussion die politische Ebene der Auseinandersetzungen ausgespart wurde, wenn die Möglichkeit außer Betracht blieb, daß ökonomische Krisenerscheinungen vorübergehend und gar für längere Zeit politisch aufgefangen werden können, daß eine ökonomische Krise nicht zwangsläufig zur politischen Krise führen muß. In diesem Sinne scheint uns das Verhältnis von ökonomischer und politischer Krise innerhalb der westdeutschen Linken - gerade angesichts der Diskussion im übrigen Westeuropa und insbesondere in Italien - noch zu wenig thematisiert zu sein

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available(1). Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment(2). Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice(3). Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown(4), employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)(5) and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate(5,6). Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants. Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for (15)N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein(7) (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state(8). We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE1(9)

Bundestagswahlen und soziale Basis politischer Parteien in der Bundesrepublik: II: Vom Zerfall des Bürgerblocks in den 60er Jahren bis zum „Rechtsputsch" der CSU 1976

Im ersten Teil des Aufsatzes haben wir dargestellt, daß das Parteiensystem der Bundesrepublik bis zum Ende der fünfziger Jahre durch einen Blockgegensatz zwischen bürgerlichenParteien(CDU/CSU, FDP, DP und teilweise BHE (2)) einerseits und Sozialdemokratie andererseits geprägt war. Die politische Macht im Staat der Bundesrepublik lag in den Händen des zunehmend von den Unionsparteien dominierten Bürgerblocks. Die außerordentliche politische Stabilität des CDU-Staates zeigte sich im Zuwachs des Zweitstimmenanteils der Bürgerblock-Parteien bei den Bundestagswahlen zwischen 1949 und 1957 von 46,9 % auf 60,7 % und in der Stagnation der Sozialdemokratie bei der 30 %-Marke. Diese Stabilität basierte auf einem breiten bürgerlich-antisozialistischen respektive -antikommunistischen Intraklassenkonsens, der sowohl die Legitimationsbasis für die autoritäre Kanzler-Demokratie bildete als auch die Wählerbasis des Bürgerblocks gegenüber der der Sozialdemokratie isolierte: Zwischen 1949 und 1957 fanden weder Wählerbewegungen zwischen beiden Blöcken statt, noch konnte die SPD ihre Massenbasis verbreitern

The Alternative for Germany’s radicalization in historical-comparative perspective

This article chronicles the AfD’s rightward repositioning and compares it with the programmatic development of three postwar German parties on the ideological wings. By highlighting factors that tilt the balance of power away from moderate reformers towards hardliners, this comparative analysis sheds light on the conditions that lead a relatively successful party on the ideological wings, such as the AfD, to radicalize its programme. Four variables stand out: whether party hardliners take the blame for the recent election loss; whether they offer a convincing programmatic and strategic alternative to the reformers; whether changes in party composition strengthen hardliners; and whether external factors enhance their weight within the party. The essay concludes that the AfD’s radicalization was unusual, but not exceptional. It is however too early to conclude that the Federal Republic’s distinctive institutions and political culture no longer impose significant costs on parties that shift their programmes away from the centre

Chlamydomonas cells transition through distinct Fe nutrition stages within 48 h of transfer to Fe-free medium

Low iron (Fe) bioavailability can limit the biosynthesis of Fe-containing proteins, which are especially abundant in photosynthetic organisms, thus negatively affecting global primary productivity. Understanding cellular coping mechanisms under Fe limitation is therefore of great interest. We surveyed the temporal responses of Chlamydomonas (Chlamydomonas reinhardtii) cells transitioning from an Fe-rich to an Fe-free medium to document their short and long-term adjustments. While slower growth, chlorosis and lower photosynthetic parameters are evident only after one or more days in Fe-free medium, the abundance of some transcripts, such as those for genes encoding transporters and enzymes involved in Fe assimilation, change within minutes, before changes in intracellular Fe content are noticeable, suggestive of a sensitive mechanism for sensing Fe. Promoter reporter constructs indicate a transcriptional component to this immediate primary response. With acetate provided as a source of reduced carbon, transcripts encoding respiratory components are maintained relative to transcripts encoding components of photosynthesis and tetrapyrrole biosynthesis, indicating metabolic prioritization of respiration over photosynthesis. In contrast to the loss of chlorophyll, carotenoid content is maintained under Fe limitation despite a decrease in the transcripts for carotenoid biosynthesis genes, indicating carotenoid stability. These changes occur more slowly, only after the intracellular Fe quota responds, indicating a phased response in Chlamydomonas, involving both primary and secondary responses during acclimation to poor Fe nutrition