Genetische Determinanten von kompartimenteller Inkompatibilität in Genom/Plastom-Artbastarden

Die Pflanzenzelle enthält ein integriertes, kompartimentiertes genetisches System, mit den Subgenomen im Zellkern, in den Mitochondrien und den Plastiden, das aus Endocytobioseereignissen mit prokaryotischen Zellen hervorgegangen ist. Im Laufe der Evolution der eukaryotischen Zelle wurden die genetischen Potentiale der symbiontischen Partnerzellen vermischt. Dabei ging ein Teil genetischer Information verloren, ein anderer wurde aus den Organellen in den Kern transferiert, und außerdem wurde neue Information hinzugewonnen. Dies ging einher mit der Einbettung von Mitochondrien und Plastiden in die Signaltransduktionsketten und Regelkreise der Wirtszelle. Heute interagieren die Subgenome auf vielen Ebenen; ihre Expression wird in der Pflanzenzelle koordiniert in Raum, Zeit und Quantität reguliert. Die Interdependenz der Subgenome hatte ihre Koevolution zur Folge, so daß die genetischen Kompartimente der Zelle nicht mehr ohne weiteres zwischen Arten ausgetauscht werden können. Kombinationen von artfremden Organellen können zu Entwicklungsstörungen führen, wie sie sowohl von "kompartimentellen" (Genom/Plastom-) Hybriden als auch von Cybriden beschrieben worden sind (Bastardbleichheit, Bastardscheckung). In dieser Arbeit wurden reziproke Cybriden der Arten Atropa belladonna und Nicotiana tabacum auf molekulare Determinanten von Genom/Plastom-Inkompatibilität untersucht. Die Cybriden sind je nach Kombination elterlicher Organellen entweder albinotisch [Kern von Atropa, Plastide vom Tabak; Ab(Nt)-Cybride] oder gleichen dem Wildtyp [Kern von Tabak; Plastide von Atropa, Nt(Ab)-Cybride]. 1. Als Voraussetzung für einen Sequenzvergleich der plastidären Chromosomen beider Solanaceen-Arten wurde das Plastidenchromosom von Atropa komplett sequenziert. Der Vergleich der (Atropa)-Sequenz mit der bekannten des Chromosoms aus dem Tabak und anschließende molekularbiologische Untersuchungen führten zur Identifizierung von zwei potenziellen Ursachen für die Defekte im albinotischen Material. 2. Die Ab(Nt)-Cybride zeigt eine gestörte Akkumulation von Transkripten für eine Reihe von Operonen. Das resultierende aberrante Transkriptmuster ähnelte verblüffend dem von Tabakpflanzen mit Defizienz der plastidenkodierten RNA-Polymerase (PEP). Möglicherweise ist in der Cybride die Interaktion des PEP-Apoenzyms mit einem oder mehreren der kernkodierten Sigmafaktoren gestört. Tatsächlich unterscheiden sich die für eine Untereinheit der PEP kodierenden (plastidären) rpoC2-Gene von Tabak und Atropa durch eine Insertion/Deletion an einer Stelle im Molekül, die mit Sigmafaktoren interagieren kann. Transformation der Plastiden der Ab(Nt)-Cybride mit dem rpoC2-Gen aus Tabak führte in der Tat zu einer partiellen Reversion zum WT und macht Transkriptionsdefekte als eines von offenbar mehreren Determinanten für die Genom/Plastom-Inkompatibilität in Artbastarden wahrscheinlich. 3. Neben der Transkription ist im albinotischen Material auch die RNA-Edierung gestört. Die plastidären Editotypen beider Solanaceen ähneln einander, doch gibt es für beide Arten spezifische Edierungsstellen. Von den fünf tabakspezifischen Stellen in der Ab(Nt)-Cybride werden vier nicht ediert. Offensichtlich besitzt der Atropa-Kern nicht die notwendigen Kernfaktoren zur Prozessierung dieser Stellen. Da Edierung generell hochkonservierte und funktionell wichtige Aminosäurepositionen betrifft, trägt der Ausfall der Edierung sehr wahrscheinlich ebenfalls zum beobachteten Defekt in der Plastidenentwicklung bei. 4. Auf der anderen Seite werden die Stellen der grünen Nt(Ab)-Cybride, bemerkenswerterweise auch Atropa-spezifische, heterolog vom Tabakkern ediert. Der erstmalige Befund von heterologem Edieren stellte sich als Folge der Allotetraploidie von Tabak heraus. Untersuchungen dieser Stellen in den diploiden Eltern des allotetraploiden Tabaks, N. tomentosiformis als Nachkomme des Vaters und N. sylvestris als Nachkomme der Mutter, zeigten, daß der Tabak die Fähigkeit zur heterologen Edierung von Atropa-spezifischen Stellen wohl vom Vater ererbt hat. Dies wurde auch durch einen transplastomischen Ansatz bestätigt. In diesen Experimenten wurde die intronnahe ndhA-Edierungsstelle aus Spinat, die es auch in N. tomentosiformis gibt, nicht aber in N. sylvestris, in Tabak über ballistische Transformation eingebracht. 5. Über Konstruktionen, die entweder der gespleißen oder ungespleißten ndhA-mRNA inklusive der Edierungsstelle entsprachen, konnte gezeigt werden, daß die Edierung an dieser Stelle immer erst nach dem Spleißen erfolgt. Dies ist der erste Nachweis einer strikten kinetischen Verknüpfung von RNA-Edierung mit einem anderen mRNA-Reifungsschritt in Plastiden. Er zeigt an, daß das ndhA-Intron phylogenetisch älter als die ndhA-Edierungsstelle ist. Mechanistische Implikationen dieses Befundes werden diskutiert

Systematic analysis of plant mitochondrial and chloroplast small RNAs suggests organelle-specific mRNA stabilization mechanisms

Land plant organellar genomes encode a small number of genes, many of which are essential for respiration and photosynthesis. Organellar gene expression is characterized by a multitude of RNA processing events that lead to stable, translatable transcripts. RNA binding proteins (RBPs), have been shown to generate and protect transcript termini and eventually induce the accumulation of short RNA footprints. We applied knowledge of such RBP-derived footprints to develop software (sRNA miner) that enables identification of RBP footprints, or other clusters of small RNAs, in organelles. We used this tool to determine mitochondrial and chloroplast cosRNAs (clustered organellar sRNAs) in Arabidopsis. We found that in mitochondria, cosRNAs coincide with transcript 3′-ends, but are largely absent from 5′-ends. In chloroplasts this bias is absent, suggesting a different mode of 5′ processing, possibly owing to different sets of RNases. Furthermore, we identified a large number of cosRNAs that represent silenced insertions of mitochondrial DNA in the nuclear genome of Arabidopsis. Steady-state RNA analyses demonstrate that cosRNAs display differential accumulation during development. Finally, we demonstrate that the chloroplast RBP PPR10 associates in vivo with its cognate cosRNA. A hypothetical role of cosRNAs as competitors of mRNAs for PPR proteins is discussed

Arabidopsis chloroplast quantitative editotype

AbstractChloroplast C-to-U RNA editing is an essential post-transcriptional process. Here we analyzed RNA editing in Arabidopsis thaliana using strand-specific deep sequencing datasets from the wild-type and a mutant defective in RNA 3′ end maturation. We demonstrate that editing at all sites is partial, with an average of 5–6% of RNAs remaining unedited. Furthermore, we identified nine novel sites with a low extent of editing. Of these, three sites are absent from the WT transcriptome because they are removed by 3′ end RNA processing, but these regions accumulate, and are edited, in a mutant lacking polynucleotide phosphorylase

A CRR2-Dependent sRNA Sequence Supports Papillomavirus Vaccine Expression in Tobacco Chloroplasts

Introduction: Human papillomavirus (HPV) infection is the leading cause of cervical cancer, and vaccination with HPV L1 capsid proteins has been successful in controlling it. However, vaccination coverage is not universal, particularly in developing countries, where 80% of all cervical cancer cases occur. Cost-effective vaccination could be achieved by expressing the L1 protein in plants. Various efforts have been made to produce the L1 protein in plants, including attempts to express it in chloroplasts for high-yield performance. However, manipulating chloroplast gene expression requires complex and difficult-to-control expression elements. In recent years, a family of nuclear-encoded, chloroplast-targeted RNA-binding proteins, the pentatricopeptide repeat (PPR) proteins, were described as key regulators of chloroplast gene expression. For example, PPR proteins are used by plants to stabilize and translate chloroplast mRNAs. Objectives: To demonstrate that a PPR target site can be used to drive HPV L1 expression in chloroplasts. Methods: To test our hypothesis, we used biolistic chloroplast transformation to establish tobacco lines that express two variants of the HPV L1 protein under the control of the target site of the PPR protein CHLORORESPIRATORY REDUCTION2 (CRR2). The transgenes were inserted into a dicistronic operon driven by the plastid rRNA promoter. To determine the effectiveness of the PPR target site for the expression of the HPV L1 protein in the chloroplasts, we analyzed the accumulation of the transgenic mRNA and its processing, as well as the accumulation of the L1 protein in the transgenic lines. Results: We established homoplastomic lines carrying either the HPV18 L1 protein or an HPV16B Enterotoxin::L1 fusion protein. The latter line showed severe growth retardation and pigment loss, suggesting that the fusion protein is toxic to the chloroplasts. Despite the presence of dicistronic mRNAs, we observed very little accumulation of monocistronic transgenic mRNA and no significant increase in CRR2-associated small RNAs. Although both lines expressed the L1 protein, quantification using an external standard suggested that the amounts were low. Conclusions: Our results suggest that PPR binding sites can be used to drive vaccine expression in plant chloroplasts; however, the factors that modulate the effectiveness of target gene expression remain unclear. The identification of dozens of PPR binding sites through small RNA sequencing expands the set of expression elements available for high-value protein production in chloroplasts.German Research Foundation, DFGPeer Reviewe

Plant organellar RNA maturation

Plant organellar RNA metabolism is run by a multitude of nucleus-encoded RNA-binding proteins (RBPs) that control RNA stability, processing, and degradation. In chloroplasts and mitochondria, these post-transcriptional processes are vital for the production of a small number of essential components of the photosynthetic and respiratory machinery—and consequently for organellar biogenesis and plant survival. Many organellar RBPs have been functionally assigned to individual steps in RNA maturation, often specific to selected transcripts. While the catalog of factors identified is ever-growing, our knowledge of how they achieve their functions mechanistically is far from complete. This review summarizes the current knowledge of plant organellar RNA metabolism taking an RBP-centric approach and focusing on mechanistic aspects of RBP functions and the kinetics of the processes they are involved in.Peer Reviewe

Chloroplast cold-resistance is mediated by the acidic domain of the RNA binding protein CP31A

Chloroplast RNA metabolism is characterized by long-lived mRNAs that undergo a multitude of post-transcriptional processing events. Chloroplast RNA accumulation responds to environmental cues, foremost light and temperature. A large number of nuclear-encoded RNA-binding proteins (RBPs) are required for chloroplast RNA metabolism, but we do not yet know how chloroplast RBPs convert abiotic signals into gene expression changes. Previous studies showed that the chloroplast ribonucleoprotein 31A (CP31A) is required for the stabilization of multiple chloroplast mRNAs in the cold, and that the phosphorylation of CP31A at various residues within its N-terminal acidic domain (AD) can alter its affinity for RNA in vitro. Loss of CP31A leads to cold sensitive plants that exhibit bleached tissue at the center of the vegetative rosette. Here, by applying RIP-Seq, we demonstrated that CP31A shows increased affinity for a large number of chloroplast RNAs in vivo in the cold. Among the main targets of CP31A were RNAs encoding subunits of the NDH complex and loss of CP31A lead to reduced accumulation of ndh transcripts. Deletion analyses revealed that cold-dependent RNA binding and cold resistance of chloroplast development both depend on the AD of CP31A. Together, our analysis established the AD of CP31A as a key mediator of cold acclimation of the chloroplast transcriptome

Small RNAs reveal two target sites of the RNA-maturation factor Mbb1 in the chloroplast of Chlamydomonas

Many chloroplast transcripts are protected against exonucleolytic degradation by RNA-binding proteins. Such interactions can lead to the accumulation of short RNAs (sRNAs) that represent footprints of the protein partner. By mining existing data sets of Chlamydomonas reinhardtii small RNAs, we identify chloroplast sRNAs. Two of these correspond to the 5′-ends of the mature psbB and psbH messenger RNAs (mRNAs), which are both stabilized by the nucleus-encoded protein Mbb1, a member of the tetratricopeptide repeat family. Accordingly, we find that the two sRNAs are absent from the mbb1 mutant. Using chloroplast transformation and site-directed mutagenesis to survey the psbB 5′ UTR, we identify a cis-acting element that is essential for mRNA accumulation. This sequence is also found in the 5′ UTR of psbH, where it plays a role in RNA processing. The two sRNAs are centered on these cis-acting elements. Furthermore, RNA binding assays in vitro show that Mbb1 associates with the two elements specifically. Taken together, our data identify a conserved cis-acting element at the extremity of the psbH and psbB 5′ UTRs that plays a role in the processing and stability of the respective mRNAs through interactions with the tetratricopeptide repeat protein Mbb1 and leads to the accumulation of protected sRNA