Charakterisierung eines Ustilago maydis Genclusters, das für drei neuartige sekretierte Effektoren kodiert

Der biotrophe Brandpilz U. maydis benötigt für seine Interaktion mit Maispflanzen eine Vielzahl neuartiger, vorhergesagt sekretierter Proteine, sogenannter Effektoren. Ein signifikanter Anteil der entsprechenden Gene liegt in Clustern vor, deren Expression erst während der biotrophen Phase erfolgt (Kämper et al., 2006). Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Cluster 5B charakterisiert, dessen Deletion zum Verlust der Pathogenität führt (Kämper et al., 2006). Cluster 5B codiert für drei Proteine, die ein N-terminales Signalpeptid besitzen. Es konnte gezeigt werden, dass ausschließlich eines der Gene im Cluster 5B, stp1, für den Phänotyp verantwortlich ist. stp1 findet sich auch in anderen verwandten Brandpilzen und stellt damit möglicherweise einen essentiellen Pathogenitätsfaktor von Brandpilzen dar. Mikroskopische Untersuchungen ergaben, dass stp1 Deletionsmutanten im Gegensatz zu Infektionen mit Wildtypstämmen direkt nach Penetration der Maisepidermis arretieren und in infizierten Pflanzenzellen eine verstärkte Abwehrreaktion auslösen. Diese Abwehrreaktion war durch Papillenbildung, H2O2 Akkumulation und verstärkte Synthese von PR-Proteinen gekennzeichnet und führte letztlich zum Absterben der infizierten Zellen. Dies zeigt, dass Stp1 diese Pfanzenabwehrreaktionen erfolgreich unterdrückt. Mit Hilfe von Promotor:gfp Fusionen wurde nachgewiesen, dass die Expression von Stp1 während der Pentration beginnt und vor allem auf in der Epidermis proliferierende Hyphen beschränkt ist. In Stp1 konnten bioinformatisch keinerlei bekannte Proteindomänen gefunden werden, die auf die Funktion des Proteins hindeuten könnten. Durch Deletionsanalysen konnte gezeigt werden, dass die zentrale, Glycin-reiche Region des Proteins keine Funktion während der pathogenen Entwicklung hat, die N- und C-terminalen Bereiche hingegen essentiell sind. Durch die Analyse von Kulturüberständen konnte nachgewiesen werden, dass Stp1 von U. maydis Hyphen in glykosylierter Form sekretiert wird. Nach Expression in haploiden Zellen wurde hingegen eine Prozessierung des Proteins durch die Kex2 Protease beobachtet. Die Ergebnisse deuten an, dass die Sekretion des Effektors einer genauen Kontrolle unterliegt, die sowohl transkriptionell als auch post-translational erfolgt. Durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass Stp1- Fusionsproteine während der biotrophen Wachstumsphase von U. maydis in den Apoplasten gelangen. In einer Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse wurden ausschließlich intrazelluläre pflanzliche Interaktionspartner identifiziert. Stp1-Fusionsproteine, denen das N-terminale Signalpeptid fehlte, lokalisierten nach transienter Expression in Nicotiana benthamiana spezifisch in Subkompartimenten des Nukleus. Für einen der identifizierten Interaktionspartner konnte nach Co-Expression in N. benthamiana eine Colokalisierung mit Stp1 ohne Signalpeptid im Zellkern nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse könnten andeuten, dass Stp1 nach Sekretion in Pflanzenzellen transloziert wird und dort in die Regulation von Abwehrreaktionen eingreift

Transport and kinase activities of CbrA of Pseudomonas putida KT2440

The CbrA/CbrB system is a two-component signal transduction system known to participate in the regulation of the cellular carbon/nitrogen balance and to play a central role in carbon catabolite repression in Pseudomonas species. CbrA is composed of a domain with similarity to proteins of the solute/sodium symporter family (SLC5) and domains typically found in bacterial sensor kinases. Here, the functional properties of the sensor kinase CbrA and its domains are analyzed at the molecular level using the system of the soil bacterium P. putida KT2440 as a model. It is demonstrated that CbrA can bind and transport L-histidine. Transport is specific for L-histidine and probably driven by an electrochemical proton gradient. The kinase domain is not required for L-histidine uptake by the SLC5 domain of CbrA, and has no significant impact on transport kinetics. Furthermore, it is shown that the histidine kinase can autophosphorylate and transfer the phosphoryl group to the response regulator CbrB. The SLC5 domain is not essential for these activities but appears to modulate the autokinase activity. A phosphatase activity of CbrA is not detected. None of the activities is significantly affected by L-histidine. The results demonstrate that CbrA functions as a L-histidine transporter and sensor kinase

A Novel Factor Essential for Unconventional Secretion of Chitinase Cts1

Subcellular targeting of proteins is essential to orchestrate cytokinesis in eukaryotic cells. During cell division ofUstilago maydis, for example, chitinases must be specifically targeted to the fragmentation zone at the site of cell division to degrade remnant chitin and thus separate mother and daughter cells. Chitinase Cts1 is exported to this location via an unconventional secretion pathway putatively operating in a lock-type manner. The underlying mechanism is largely unexplored. Here, we applied a forward genetic screen based on UV mutagenesis to identify components essential for Cts1 export. The screen revealed a novel factor termed Jps1 lacking known protein domains. Deletion of the corresponding gene confirmed its essential role for Cts1 secretion. Localization studies demonstrated that Jps1 colocalizes with Cts1 in the fragmentation zone of dividing yeast cells. While loss of Jps1 leads to exclusion of Cts1 from the fragmentation zone and strongly reduced unconventional secretion, deletion of the chitinase does not disturb Jps1 localization. Yeast-two hybrid experiments indicate that the two proteins might interact. In essence, we identified a novel component of unconventional secretion that functions in the fragmentation zone to enable export of Cts1. We hypothesize that Jps1 acts as an anchoring factor for Cts1

Unconventional Transport Routes of Soluble and Membrane Proteins and Their Role in Developmental Biology

Many proteins and cargoes in eukaryotic cells are secreted through the conventional secretory pathway that brings proteins and membranes from the endoplasmic reticulum to the plasma membrane, passing through various cell compartments, and then the extracellular space. The recent identification of an increasing number of leaderless secreted proteins bypassing the Golgi apparatus unveiled the existence of alternative protein secretion pathways. Moreover, other unconventional routes for secretion of soluble or transmembrane proteins with initial endoplasmic reticulum localization were identified. Furthermore, other proteins normally functioning in conventional membrane traffic or in the biogenesis of unique plant/fungi organelles or in plasmodesmata transport seem to be involved in unconventional secretory pathways. These alternative pathways are functionally related to biotic stress and development, and are becoming more and more important in cell biology studies in yeast, mammalian cells and in plants. The city of Lecce hosted specialists working on mammals, plants and microorganisms for the inaugural meeting on "Unconventional Protein and Membrane Traffic" (UPMT) during 4-7 October 2016. The main aim of the meeting was to include the highest number of topics, summarized in this report, related to the unconventional transport routes of protein and membranes.The UPMT committee is grateful to the sponsors supporting the meeting: The Company of Biologists, Fondazione Puglia, the American Society of Plant Biologists, the Biochemical Society, University of Salento, CNR-Nanotec, MDPI-International Journal of Molecular Science and Merck

Charakterisierung eines Ustilago maydis Genclusters, das für drei neuartige sekretierte Effektoren kodiert

Der biotrophe Brandpilz U. maydis benötigt für seine Interaktion mit Maispflanzen eine Vielzahl neuartiger, vorhergesagt sekretierter Proteine, sogenannter Effektoren. Ein signifikanter Anteil der entsprechenden Gene liegt in Clustern vor, deren Expression erst während der biotrophen Phase erfolgt (Kämper et al., 2006). Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Cluster 5B charakterisiert, dessen Deletion zum Verlust der Pathogenität führt (Kämper et al., 2006). Cluster 5B codiert für drei Proteine, die ein N-terminales Signalpeptid besitzen. Es konnte gezeigt werden, dass ausschließlich eines der Gene im Cluster 5B, stp1, für den Phänotyp verantwortlich ist. stp1 findet sich auch in anderen verwandten Brandpilzen und stellt damit möglicherweise einen essentiellen Pathogenitätsfaktor von Brandpilzen dar. Mikroskopische Untersuchungen ergaben, dass stp1 Deletionsmutanten im Gegensatz zu Infektionen mit Wildtypstämmen direkt nach Penetration der Maisepidermis arretieren und in infizierten Pflanzenzellen eine verstärkte Abwehrreaktion auslösen. Diese Abwehrreaktion war durch Papillenbildung, H2O2 Akkumulation und verstärkte Synthese von PR-Proteinen gekennzeichnet und führte letztlich zum Absterben der infizierten Zellen. Dies zeigt, dass Stp1 diese Pfanzenabwehrreaktionen erfolgreich unterdrückt. Mit Hilfe von Promotor:gfp Fusionen wurde nachgewiesen, dass die Expression von Stp1 während der Pentration beginnt und vor allem auf in der Epidermis proliferierende Hyphen beschränkt ist. In Stp1 konnten bioinformatisch keinerlei bekannte Proteindomänen gefunden werden, die auf die Funktion des Proteins hindeuten könnten. Durch Deletionsanalysen konnte gezeigt werden, dass die zentrale, Glycin-reiche Region des Proteins keine Funktion während der pathogenen Entwicklung hat, die N- und C-terminalen Bereiche hingegen essentiell sind. Durch die Analyse von Kulturüberständen konnte nachgewiesen werden, dass Stp1 von U. maydis Hyphen in glykosylierter Form sekretiert wird. Nach Expression in haploiden Zellen wurde hingegen eine Prozessierung des Proteins durch die Kex2 Protease beobachtet. Die Ergebnisse deuten an, dass die Sekretion des Effektors einer genauen Kontrolle unterliegt, die sowohl transkriptionell als auch post-translational erfolgt. Durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass Stp1- Fusionsproteine während der biotrophen Wachstumsphase von U. maydis in den Apoplasten gelangen. In einer Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse wurden ausschließlich intrazelluläre pflanzliche Interaktionspartner identifiziert. Stp1-Fusionsproteine, denen das N-terminale Signalpeptid fehlte, lokalisierten nach transienter Expression in Nicotiana benthamiana spezifisch in Subkompartimenten des Nukleus. Für einen der identifizierten Interaktionspartner konnte nach Co-Expression in N. benthamiana eine Colokalisierung mit Stp1 ohne Signalpeptid im Zellkern nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse könnten andeuten, dass Stp1 nach Sekretion in Pflanzenzellen transloziert wird und dort in die Regulation von Abwehrreaktionen eingreift

Fungal Genomics

In the past two decades, genomics has developed into a formidable tool to study various aspects of fungi. New sequencing technologies have considerably driven down the costs, making genome sequencing available to a large group of researchers. However, gene prediction, functional analysis, and comparative genomics remain challenging. This chapter will describe advances in technologies underlying fungal genome sequencing, annotation, and analysis. Furthermore, the impact of fungal genome sequencing is illustrated using examples from biotechnology: natural products, carbohydrate-active enzymes, mushroom development, and plant interactions

A Potential Lock-Type Mechanism for Unconventional Secretion in Fungi

Protein export in eukaryotes can either occur via the classical pathway traversing the endomembrane system or exploit alternative routes summarized as unconventional secretion. Besides multiple examples in higher eukaryotes, unconventional secretion has also been described for fungal proteins with diverse functions in important processes such as development or virulence. Accumulating molecular insights into the different export pathways suggest that unconventional secretion in fungal microorganisms does not follow a common scheme but has evolved multiple times independently. In this study, we review the most prominent examples with a focus on the chitinase Cts1 from the corn smut Ustilago maydis. Cts1 participates in cell separation during budding growth. Recent evidence indicates that the enzyme might be actively translocated into the fragmentation zone connecting dividing mother and daughter cells, where it supports cell division by the degradation of remnant chitin. Importantly, a functional fragmentation zone is prerequisite for Cts1 release. We summarize in detail what is currently known about this potential lock-type mechanism of Cts1 secretion and its connection to the complex regulation of fragmentation zone assembly and cell separation