膵液中遺伝子分析による膵癌診断法の開発

金沢大学がん研究所内視鏡下経乳頭的に採取した膵液中のK-ras,p53の変異を検索し,膵癌(PC)におけるその診断的有用性を明らかにしようとした.得られた成績は以下のように要約される.1.K-rasコドン12に対応したプロープにacridinium esterを標識し,膵液より抽出したDNAのPCR産物を反応させ,生じる化学発光値よりK-ras変異の有無と変異型を定量的に測定できるHybridization Protection Assay(HPA)法を開発した.本法は分離・洗浄という操作が不要であり,PCR後30分余りでK-rasの変異型まで判定可能である.2.HPA法で内視鏡下経乳頭的に採取した膵液中K-rasコドンの変異を検討すると,PCの約2/3は10,000RLUs以上を示したが,慢性膵炎(CP)の大部分は5,000RLUs以下であり,10,000RLUsをカットオフ値にとると,膵液中K-ras変異の陽性率はPCで66%(19/29),CPで4%(1/26)であった.一方,従来報告しているPCR-RFLP法ではK-rasコドン12変異の陽性率はPCで81%(26/32)であり,CPでは19%(5/26)であった.しかし,PCR-RFLP法で陽性とされたCP5例中4例はHPA法にて陰性であり,HPA法による定量的測定法は膵癌診断の特異性を高めることが可能である.膵液中K-ras変異のHPA法による陽性率を腫瘍径別にみると,TS_1 57%(4/7),TS_2 60%(6/10),TS_3 78%(7/9),TS_4 67%(2/3)であり,腫瘍径による明らかな差異はなく,TS_1症例でも比較的高い陽性率を示すことから,小膵癌の診断にも有用である.3.p53のエクソン5,6,7,8に対応するプライマーを用いてPCR-SSCP法で分析し,直接塩基配列法にて塩基配列を決定した.膵液中p53変異はPCで42%(10/24)に陽性であったが,膵管内乳頭腺腫2例とCP20例ではいずれも陰性であり,p53変異の癌特異性は優れていた.同時に検索したK-rasと対比すると両者ともに変異陽性は8例で,いずれか一方のみ変異陽性はp53で2例,K-rasで11例に認められた.結局,いずれかに変異を認めたものは24例中21例(88%)であり,K-rasの補完にも有用である.研究課題/領域番号:08266221, 研究期間(年度):1996出典：研究課題「膵液中遺伝子分析による膵癌診断法の開発」課題番号08266221（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-08266221/）を加工して作

膵液γ-glutamyl transpeptidase 測定の膵疾患診断への応用に関する基礎的検討

金沢大学医学部研究課題/領域番号:X00210----077154, 研究期間(年度):1975出典：「膵液γ-glutamyl transpeptidase 測定の膵疾患診断への応用に関する基礎的検討」研究成果報告書　課題番号：X00210----077154（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-X00210----077154/）を加工して作

膵液中の癌関連遺伝子異常を指標とした膵癌の早期診断に関する研究

ERCP下に採取した膵液とPTCなどで採取した胆汁において沈渣のみでなく上清からDNAを抽出して、p53分析を行い、その膵癌(PCa)診断における有用性を検討した。Pca患者におけるp53変異の陽性率は膵液上清で43%(9/21)であるのに対し、沈渣では29%(6/21)であり、いずれかでの陽性率は57%(12/12)に達した。一方、慢性膵炎(CP)25例では総て陰性であった。また、膵液細胞診陰性の膵癌でも47%(7/15)にp53変異が陽性であった。さらに、胆道癌患者におけるp53変異は胆汁上清で50%(15/30)、沈渣で33%(10/30)に検出されたが、胆石症20例では総て陰性であった。膵液、胆汁いずれでもp53変異の検出率は沈渣よりも上清で高く、p53変異の癌特異性は非常に優れていた。膵液中mesothein mRNAの発現を検討するとPCaで52%(11/21)、膵管内乳頭粘液性腫瘍(IPMN)で45%(5/11)、CPで14%(3/22)に陽性であり、PCaでCPに比して有意に高率であった。h-TERT mRNAの高感度な定量的測定法を開発し、血清と膵液で測定したが、良性疾患でもリンパ球由来のかTERTが検出され、癌特異性は高くなかった。膵液中各種癌関連遺伝子のメチル化を検討すると、pp ENKのメチル化はPCaで50%(14/28)、IPMNで27%(4/15)、CPで5%(1/20)に認められ、PCaでCPに比して有意に高率であった。SARP2のメチル化はPCaで74%(24/35)、IPMNで94%(15/16)、CPで11%(2/19)でPCaやIPMNではCPに比して明らかに高率であった。さらに、NPTX2のメチル化はPCaで77%(24/35)、IPMNで63%(10/16)、CPで46%(6/13)であり、PCaでCPに比して有意に高率であった。これら遺伝子のメチル化の検出率をIPMNの良・悪性群で比較しても明らかな差異はなく、これらの癌関連遺伝子のメチル化はPCaの発癌過程におけるearly eventであると推察され、現在、定量的測定により癌特異性を向上させようとしている。We analyzed mutations of p53 in DNA extract not only from the sediment(Sed) but also from the supernatant(sup) of aspirated pancreatic juice(PJ) by ERCP and bile obtained by PTC or ERBD. The incidence of p53 mutations was 43%(9 of 21) and 29%(6 of 21) in the Sup and the Sed of PJ from patients with pancreatic cancer(PCa), respectively, and nurse to 52%(11 of 21) in the combination assay with Sup and Sed. Moreover, p53 mutations were detected in 47%(7 of 15) of PCa cases in which the cyto logic diagnosis was negative. Among 25 patients with chronic pancreatitis(CP), none harbored mutant p53. In bile abtained from patients with biliary tract cancer, the positive rate of p53 mutations was 50%(15 of 30) in the Sup and 33%(10 of 30) in the Sed. On the other hand, there were no pantients with cholelithiasis harboring mutant p53. These results could indicate that the incidence of p53 mutation was higher in the Sup than in the Sed, and the specificity of p53 mutation was higher in the Sup than in the Sed, and the specificity of p53 mutation for cancer was very high. Mesothlin mRNA expression in the PJ was discovered in 11(52%) of 21 patients with PCa,5(45%) of 11 with intraductal papillary mucinous neoplasm(IPMN) and 3(14%) of 22 with CP. There was significant difference between PCa and CP for mesothelin mRNA. We developed an highly sensitive quantitative analysis for h-TERT mRNA using real-time RT-PCR and measured the amount of h-TERT mRNA in serum and PJ. The levels of h-TERT mRNA were elevated in almost all cases with PCa but also in considerable cases with benign lesions, suggesting low specificity of h-TERT mRNA for cancer. h-TERT mRNA in body fluids from benign lesions originates from lymphocyte.Using methylation-specific PCR, we nextly analyzed the methylation status of 3 CpG islands of ppENK, SARP2 and NPTX2 in PJ samples. Aberrant methylation of ppENK in the PJ was detected in 14(50%) of 28 patients with PCa, 4(27%) of 15 with IPMN and 1(15%) of 20 with CP, and that of NPTX2 was detected in 24(77%) of 35 patients with PCa, 10(63%) of 16 with IPMN and 6(43%) of 13 with CP. The incidence of aberrant methylation of ppENK or NPTX2 was significantly higher in PCa than in CP. Furthermore, we found aberrant methylation of SARP2 in PJ in 24(74%) of 35 patients with PCa, 15(94%) of 16 with IPMN and 2(11%) of 19 with CP. The incidence of aberrant methylation of SARP2 was significantly higher in PCa or IPMN than in CP. Although the prevalence of aberrant methylation of the tumor-related genes in PJ from PCa was strikingly high, its specificity for cancer was not sufficient. There was no significant difference between benign and malignant groups of IPMN, suggesting that aberrant menthylation of these genes is a early event in PCa development, and quantitative detection of aberrant methylation in PJ may have potential diagnostic implication for PCa.研究課題/領域番号:14370177, 研究期間(年度):2002-200

原発性肝癌に特異的に出現するγ-GTP isoenzyme に関する実験的・臨床的研究

金沢大学医学部研究課題/領域番号:X00095----167107, 研究期間(年度):1976出典：「原発性肝癌に特異的に出現するγ-GTP isoenzyme に関する実験的・臨床的研究」研究成果報告書　課題番号X00095----167107（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-X00095----167107/）を加工して作

膵液中γ-glutamyl transpeptidase測定の膵疾患診断の応用

金沢大学医学部研究課題/領域番号:X00210----977157, 研究期間(年度):1974出典：「膵液中γ-glutamyl transpeptidase測定の膵疾患診断の応用」研究成果報告書　課題番号：X00210----977157（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-X00210----977157/）を加工して作

Sjogren 症候群における唾液中 Lactoferrin 測定の臨床的意義

金沢大学医学部研究課題/領域番号:58570285, 研究期間(年度):1983出典：研究課題「Sjogren 症候群における唾液中 Lactoferrin 測定の臨床的意義」課題番号58570285（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-58570285/）を加工して作

レクチンの親和性を利用した肝細胞癌に特異な r-GTP の定量法とその臨床的意義

金沢大学がん研究所研究課題/領域番号59570297, 研究期間(年度):1984出典：研究課題「レクチンの親和性を利用した肝細胞癌に特異な r-GTP の定量法とその臨床的意義」課題番号59570297（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-59570297/）を加工して作

膵炎に関連する特異蛋白の病理生理的および臨床的意義の解明

金沢大学がん研究所PSP/reg蛋白に対する特異抗体を用いて確立したEIA法を用いて,血清および膵液中の本蛋白を測定し,その臨床的意義を検討した.血清中本蛋白は急性膵炎100%,慢性再発性膵炎59%に上昇がみられ,通常の慢性膵炎30%に比べて有意の高率であり,その異常率はelastase1よりも高率であった.膵炎発作後およびERCP後の血清中の本蛋白の推移はamylaseに比して,上昇の遷廷する傾向がみられた.また,膵癌54%,胃癌33%,肝細胞癌38%,胆道癌50%と癌患者血清でも上昇がみられ,癌切除後にいずれも明らかに低下した,同様の抗体を用いた免疫組織学的検討で軽度から中等度障害の慢性膵炎で本蛋白の発現は増加するが,高度障害では低下する傾向がみられた.また,胃癌,大腸癌,膵癌,胆道癌の組織でも本蛋白は50〜60%に発現していた.以上より,血清PSP/reg蛋白は膵炎で高頻度に上昇し,鋭敏な膵障害の指標にもなるものと考えられた.一方,膵液中のPSP/reg蛋白値は対照群、非石灰化慢性膵炎,石灰化慢性膵炎,膵癌の各群で明らからな差異はみられず,膵液中の本蛋白の測定には臨床的意義は認められなかった.消化器疾患でin situ hybridizationとRT-PCRにより,pancreatitis-associated protein (PAP) mRNAの検討を行った.PAPは小腸以外に正常では発現はみられないが,消化器系の癌ではかなりの頻度で発現していた.これは癌細胞の脱分化現象を反映した異所性発現と考えられた.ラットの自然発症慢性膵炎においてPAPの発現を検討したところ、慢性膵炎の病像を呈する前に本蛋白の発現がみられ,柴胡桂枝湯投与群では膵炎の変化は軽度で,PAPの発現は認められず,PAPの動態は慢性膵炎の早期発見や治療効果の指標になると思われた.PAPcDNAを組み込んだプラスミッドを大腸菌に導入し,PAPのりコンビナント蛋白の作製に成功した.今後,抗体を作製し,その臨床的応用をすすめる予定である.We developed an enzyme-immunoassay using monoclonal antibody specific for pancreatic stone protein/reg-protein (PSP/reg), and determined levels of this protein in sera to elucidate the clinical significances of PSP/reg. Frequencies of elevated levels of serum PSP/reg were 100% in acute pancreatitis (AP) and 59% in chronic relapsing pancreatitis (CRP), and were significantly higher in active pancreatic injury such as AP or CRP than those in chronic pancreatitis (CP). Elevated serum levels of this protein after attack of pancreatitis of ERCP tended to be more prolonged than those of amylase. Furthermore, the serum PSP/reg levels were also significantly increased in various cancers of the digestive system (54% in pancreatic cancer (PC), 33% in gastric cancer, 38% in hepatocellular carcinoma and 50% in biliary cancer), and decreased into the normal range after tumor resection in all cases with cancers. The immunohistochemical study demonstrated increased amounts of PSP/reg in pancreatic tissues from patients with CP associated with mild-to-moderate pancreatic damage, and decreased expression in CP associated with severe pancreatic damage. Moreover, 50 to 60% of cancer tissues from the digestive system expressed the PSP/reg-protein in malignant cells, although this protein was absent from almost all of the adjacent non-cancerous tissues. These results indicate that the serum PSP/reg levels may reflect pancreatic damage, espcially in AP or presence of digestive cancer, and may be as sensitive a marker for such lesions. On the other hand, there was no significant differences in levels of PSP/reg in pancreatic juice among the groups of control, non-calcitying CP,calcifying CP and PC.The expression of pancreatitis-associated protein (PAP) belonging to reg-gene family was investigated in tissues from various digestive diseases, using in situ hybridization and RT-PCR.Although PAP-mRNA was not detected in normal tissues except for small intestine, PAP-mRNA was expressed in some cases of digestive cancers, suggesting an ectopic or oncofetal induction of PAP in differentiated cancer cells. The expression of PAP was observed in spontaneous occurring CP model (male WBN/Kob rat) before a characteristic picture of the CP appeared, and was not detectable in the rats treated by sho-saiko-to (TJ-9) which showed mild changes of pancreatitis. Therefore, the expression of PAP may be a marker for early detection or therapeutic effect in CP Moreover, we have succeeded in preparing recombinant of human PAP,and are producing monoclonal antibody to PAP to apply it to clinical applications.研究課題/領域番号:07670578, 研究期間(年度):1995 – 1996出典：研究課題「膵炎に関連する特異蛋白の病理生理的および臨床的意義の解明」課題番号07670578（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07670578/）を加工して作

純膵液分析による膵疾患診断法の開発とその臨床的意義に関する研究

金沢大学がん研究所内視鏡下至乳頭的に採取した純膵液において, 通常のパラメーターに加えて, 我々の開発したEIA法によりlactoferrin(LF)を測定し, protein plug(PP)の有無との関連など多方面より分析した. さらに, 最近開発された各種癌関連粘液糖鎖抗原を膵液で測定し, また, 膵疾患においてこれらの免疫組織化学的検討を行った. 得られた成績は, 以下のように要約される.1)膵液中LF濃度は慢性膵炎(CP)で46%に異常上昇がみられ, 石灰化の有無で検討すると, 非石灰化群で37%であるのに対し, 石灰化群で82%と明らかにLFの陽性率は高かった. 膵管像の異常度との関連では, 膵管像の変化が高度になるにつれ, LF値も上昇した. 以上より, 膵液LF値はCPの重症度を反映することが示唆される.2)膵液中PPはCPで55%にみられたが, 膵癌(PC)8%に認められる以外, 他疾患ではみられず, CPに比較的特異性が高い.3)PPは非石灰化CPで48%に対し, 石灰化群で82%と高率にみられた. しかし, PPの有無で膵管像や外分泌機能の異常度には明らかな差異は認められなかった.4)LF濃度とPPの有無との関係では, LFの平均値とその異常上昇率はPP(-)群に比して, PP(+)群で高い傾向にあった.5)膵液中CA19-9値はPCのみならずCPでも著明に高く, その異常率はPCで92%, CPで85%であり, 腫瘍マーカーとしての有用性は乏しいが, 膵障害を反映する鋭敏なマーカーになりえると考えられる.6)膵液中ST-489とSLXはPCのみで明らかな上昇がみられ, 前者で57%, 後者で40%が陽性であり, 陽性率はそう高くないが, 特異性は非常に高い.7)I型糖鎖に属すCA19-9とCA-50はPCで強く発現するが, 特異性が乏しい. II型糖鎖のCSLEX-1とSLXは特異性は高いが, PCでの発現は弱い. ST-439とDU-PAN-2はPCでの発現が強く, 特異性も比較的優れている.8)CPでは小膵管の増生部を中心にCA19-9の発現が高度となり, CPでの膵液中CA19-9の上昇として反映されるのであろう.We determined lactoferrin (LF) levels by EIA, as well as conventional parameters in endoscopically aspirated pancreatic juice (PJ), and evaluated the protein plug (PP) in PJ. Furthermore, cancer-associated carbohydrate antigens in PJ were measured, and immunohistochemical staining of pancreatic specimens was performed using antibodies. The results are summerzied as follows.Abnormaly high levels of LF in PJ were observed in 46% of the patients with chronic pancreatitis (CP), with the prevalence being significantly higher in calcified CP 82%) than in non-calcified CP (37%). Moreover, LF levels in PJ rose with the severity of CP. As PP in PJ was found in 55% of the patients with CP,but not in those with other diseases except for pancreatic cancer (8%), PP was considered to be relatively specific for CP. PP in PJ was observed more frequently in calcified CP (82%) than in non-calcified CP (55%). However, significant differences of abnormalires in pancreatogam and pancreatic function were not observed between presence and absence of PP. Mean value and pevalence of abnormal LF in PJ in CP were higher in the PP positive group than in the PP-negative group. Concentration of CA 19-9 in PJ was significantly higher not only in pancreatic cancer (PC) but also in CP, and its prevalence was 92% in PC and 85% in CP. CA 19-9 in PJ in pj was considered to be a sensitive marker for non-specific pancreatic injury, but not for tumors. Concentrations of ST-439 and SLX in PJ were significantly increased only in PC, and their prevalences were 57% and 40%, respectively. They have high tumor-specificity, but their incidence was relatively low. CA 19-9 and CA-50, which are the type 1 chain carbohydrate antigens, were strongly expressed in pancreatic cancer, but were low in cancerspecificity. However, type 2 chain carbohydrate antigens such as CSLEX-1 and SLX showed highest tumor-secificity among the antigens, whereas their incidences were lower than other antigens. On the other hand, ST-439 and DU-PAN-2 exhibited high positivity and specificity. CA 19-9 was strongly and widely distributed mainly in the proliferative small pancreatic duct of CP. This may reflect the increased levels of CA 19-19 in PJ of patients with CP.研究課題/領域番号:61480188, 研究期間(年度):1986 – 1987出典：研究課題「純膵液分析による膵疾患診断法の開発とその臨床的意義に関する研究」課題番号61480188（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-61480188/614801881988kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

DU-PAN-2抗原に対する抗イディオタイプ抗体の免疫応答の解析と癌診断治療への応用

DU-PAN-2(D-2)に対する単クローン抗体を免疫原とし、ラットにてポリクローナル抗イディオタイプ抗体(PId)、マウスのハイブリドーマ法にて単クローン抗イディオタイプ抗体(mId)を作製した。得られた抗体はいずれもD-2抗体と特異的に結合し、D-2抗原抗体反応を阻害することより、D-2抗原の内部イメージを有すると考えられた。このmIdをマウスに免疫するとD-2抗原と反応する抗体(Ab-3)誘導され、これはD-2の抗原抗体の結合反応を濃度依存的に阻害した。さらにAb-3はCDC活性やCTLを誘導し得なかったが、ADCC活性を誘導し得た。PIdとMIdのそれぞれをD-2抗原の代用として用いたEIA法を作製し、血清中の抗D-2抗体価を測定した。癌患者血清の抗体価の陽性率はPId法で42%、mId法で33%であった。一方、良性疫患での偽陽性率はpId法で42%、mId法で20%と後者で特異性は良好であった。癌患者血清におけるD-2抗原値と抗体価との間には相関性はみられず、抗原陰性群中pId法で44%、mId法で30%に抗体価が陽性であった。次に、抗体価と胃・大腸癌の進行度との関係を検討すると、I期(早期癌)でもpI法で33%(4/12)、mId法で8%(1/12)に陽性例が認められた。さらに、進行度別に抗原値と抗体価との関係をみると、抗原陽性は13%(4/32)にみられたが、いずれもIV期であった。一方、抗体価のみ陽性例はpId法で34%(11/34)に認められ、しかもI期例が4例含まれていた。pIdを用いた親和性クロマトグラフィーにて癌患者血清より精製された抗D-2抗体はmIdとD-2抗原の双方に反応することが、免疫化学的分析により確かめられた。以上のように、癌患者血中にはD-2抗原に対する抗体の存在することが確認され、その抗体価の測定法は血中抗原陰性あるいは早期癌の診断にも有用な場合がかなりみられ、新たな血清癌診断法として期待できる。Using monoclonal antibody (mAb) DU-PAN-2 as immunogen, we prepared polyclonal anti-idiotypic antibody (pId) in a rat and syngeneic monoclonal anti-idiotypic antibody (mId) by hybridoma technique. Since pId and mId reacted specifically with mAb DU-PAN-2 and inhibited the specific binding of DU-PAN-2 (D-2) antigen and mAb DU-PAN-2, mId and a certain portion of pId were considered to possess the mirror image of the determinant on the antigen defined by mAb DU-PAN-2. Immunization of syngeneic mice with mId induced anti-anti-Id antibodies (Ab3) which inhibited the binding of mAb DU-PAN-2 to the D-2 antigen. Moreover, Ab3 could not induced CDC activity and CTL, but ADCC activity.An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) utilizing these anti-idiotypic antibodies was developed and was used to examine the clinical significance of levels of circulating antibody against D-2 antigen in sera of cancers. With the mean + 2 SD of healthy controls regarded as the cutoff value, levels exceeded this value in 42% of cancer patients by pId assay, and in 33% by mId assay. The falsepositive rate of mId assay in benign diseases was 21% which was significantly lower than that of the pId assay (45%). No significant correlation between serum D-2 antigen and anti D-2 antibody was observed in the sera of cancer patients. 43% (pId assay), and 31% (mId assay) of the antigen negative cancer patients showed antibody levels exceeding the cutoff values. All of 12 patients with gastric or colonic cancer classified as histological stage I were negative for D-2 antigen, while 4 patients (33%) were antibody positive by pId assay. Anti-D-2 antibody fraction which was purified from the serum of a cancer patient by pId immunoaffinity chromatography, reacted with both D-2 antigen and mId as determined by various immunochemical techniques. Measurement of serum levels of anti-D-2 antibody may be useful in detecting malignancies including early of antigen-negative cancers.研究課題/領域番号:03454226, 研究期間(年度):1991-1992出典：「DU-PAN-2抗原に対する抗イディオタイプ抗体の免疫応答の解析と癌診断治療への応用」研究成果報告書　課題番号03454226(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作