Isosteviol Has Beneficial Effects on Palmitate-Induced α-Cell Dysfunction and Gene Expression

BACKGROUND: Long-term exposure to high levels of fatty acids impairs insulin secretion and exaggerates glucagon secretion. The aim of this study was to explore if the antihyperglycemic agent, Isosteviol (ISV), is able to counteract palmitate-induced α-cell dysfunction and to influence α-cell gene expression. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Long-term incubation studies with clonal α-TC1-6 cells were performed in the presence of 0.5 mM palmitate with or without ISV. We investigated effects on glucagon secretion, glucagon content, cellular triglyceride (TG) content, cell proliferation, and expression of genes involved in controlling glucagon synthesis, fatty acid metabolism, and insulin signal transduction. Furthermore, we studied effects of ISV on palmitate-induced glucagon secretion from isolated mouse islets. Culturing α-cells for 72-h with 0.5 mM palmitate in the presence of 18 mM glucose resulted in a 56% (p<0.01) increase in glucagon secretion. Concomitantly, the TG content of α-cells increased by 78% (p<0.01) and cell proliferation decreased by 19% (p<0.05). At 18 mM glucose, ISV (10(-8) and 10(-6) M) reduced palmitate-stimulated glucagon release by 27% (p<0.05) and 27% (p<0.05), respectively. ISV (10(-6) M) also counteracted the palmitate-induced hypersecretion of glucagon in mouse islets. ISV (10(-6) M) reduced α-TC1-6 cell proliferation rate by 25% (p<0.05), but ISV (10(-8) and 10(-6) M) had no effect on TG content in the presence of palmitate. Palmitate (0.5 mM) increased Pcsk2 (p<0.001), Irs2 (p<0.001), Fasn (p<0.001), Srebf2 (p<0.001), Acaca (p<0.01), Pax6 (p<0.05) and Gcg mRNA expression (p<0.05). ISV significantly (p<0.05) up-regulated Insr, Irs1, Irs2, Pik3r1 and Akt1 gene expression in the presence of palmitate. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: ISV counteracts α-cell hypersecretion and apparently contributes to changes in expression of key genes resulting from long-term exposure to palmitate. ISV apparently acts as a glucagonostatic drug with potential as a new anti-diabetic drug for the treatment of type 2 diabetes

The role of cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) in colorectal cancer

[cat] El càncer colorectal (CCR) és el tercer càncer més freqüent en homes i el segon en dones a nivell mundial. Tot i que les taxes de supervivència a 5 anys en els primers estadis superen el 90%, la situació canvia dràsticament en pacients metastàtics. S’han vist pocs avenços en el tractament del CCR en les darreres dècades, el qual encara consisteix en diferents règims de quimioteràpia, amb la possibilitat de ser combinats amb una de les poques teràpies dirigides que són efectives. Per tant, es necessita trobar noves dianes terapèutiques, juntament amb biomarcadors pronòstics i predictius per optimitzar l’eficiència dels tractaments actuals i futurs. La cinasa dependent de la ciclina 5 (Cdk5) és més coneguda per les seves funcions en el sistema nerviós, però en l'última dècada s'ha demostrat que també està involucrada en molts processos propis del càncer. En aquest estudi, hem investigat l’expressió de Cdk5 en línies cel·lulars de CCR i en un gran nombre de mostres tumorals per tal d’avaluar la seva rellevància en aquesta patogènesi. Vam trobar que Cdk5 s’expressa i està molt activa en les línies cel·lulars de CCR i tot i que no afecta la proliferació, el seu silenciament gènic disminueix la invasió i la migració cel·lular, particularment en les línies cel·lulars amb mutacions activadores per sota del receptor del factor de creixement epitelial. Els anàlisis d’enriquiment funcional i els efectes transcripcionals com a conseqüència de l’eliminació del gen CDK5, també van confirmar la participació d’aquesta proteïna en la motilitat del càncer. En els teixits tumorals, Cdk5 es troba sobre-expressada en comparació amb els teixits normals a causa d’un guany en el nombre de còpies. En pacients amb malaltia localitzada, vam trobar que els nivells alts de Cdk5 es correlacionen amb un pitjor pronòstic, especialment en pacients que tenen mutacions en KRAS. En el context metastàtic, Cdk5 prediu la resposta en pacients tractats amb oxaliplatí, essent aquest fet corroborat per estudis in vitro amb línies cel·lulars resistents a l’oxaliplatí i no donant-se en el cas de l’irinotecan. En explorar els nivells de Cdk5 en els subtipus moleculars consensuats, vam trobar els nivells més baixos en el subtipus 1, on uns nivells elevats de Cdk5 es va tornar a associar amb un pitjor pronòstic, tot i que els estudis in vitro, in vivo i ex vivo no indiquen un paper per a la Cdk5 en infiltració immunitària o resposta al bloqueig del punt de control immunitari en CCR. Els resultats d’aquesta tesi doctoral confirmen la rellevància de Cdk5 en CCR, i tot i que es necessiten estudis addicionals, suggerim que la Cdk5 es podria utilitzar com a biomarcador per a la teràpia adjuvant en CCR en estadis inicials o per predir la resposta a quimioteràpies. Alternativament, la inhibició de la Cdk5 es podria utilitzar en la adjuvancia per evitar la recaiguda de la malaltia o en un entorn metastàtic en combinació amb oxaliplatí

The role of cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) in colorectal cancer

Programa de Doctorat en Biomedicina / Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Germans Trias i Pujol[cat] El càncer colorectal (CCR) és el tercer càncer més freqüent en homes i el segon en dones a nivell mundial. Tot i que les taxes de supervivència a 5 anys en els primers estadis superen el 90%, la situació canvia dràsticament en pacients metastàtics. S’han vist pocs avenços en el tractament del CCR en les darreres dècades, el qual encara consisteix en diferents règims de quimioteràpia, amb la possibilitat de ser combinats amb una de les poques teràpies dirigides que són efectives. Per tant, es necessita trobar noves dianes terapèutiques, juntament amb biomarcadors pronòstics i predictius per optimitzar l’eficiència dels tractaments actuals i futurs. La cinasa dependent de la ciclina 5 (Cdk5) és més coneguda per les seves funcions en el sistema nerviós, però en l'última dècada s'ha demostrat que també està involucrada en molts processos propis del càncer. En aquest estudi, hem investigat l’expressió de Cdk5 en línies cel·lulars de CCR i en un gran nombre de mostres tumorals per tal d’avaluar la seva rellevància en aquesta patogènesi. Vam trobar que Cdk5 s’expressa i està molt activa en les línies cel·lulars de CCR i tot i que no afecta la proliferació, el seu silenciament gènic disminueix la invasió i la migració cel·lular, particularment en les línies cel·lulars amb mutacions activadores per sota del receptor del factor de creixement epitelial. Els anàlisis d’enriquiment funcional i els efectes transcripcionals com a conseqüència de l’eliminació del gen CDK5, també van confirmar la participació d’aquesta proteïna en la motilitat del càncer. En els teixits tumorals, Cdk5 es troba sobre-expressada en comparació amb els teixits normals a causa d’un guany en el nombre de còpies. En pacients amb malaltia localitzada, vam trobar que els nivells alts de Cdk5 es correlacionen amb un pitjor pronòstic, especialment en pacients que tenen mutacions en KRAS. En el context metastàtic, Cdk5 prediu la resposta en pacients tractats amb oxaliplatí, essent aquest fet corroborat per estudis in vitro amb línies cel·lulars resistents a l’oxaliplatí i no donant-se en el cas de l’irinotecan. En explorar els nivells de Cdk5 en els subtipus moleculars consensuats, vam trobar els nivells més baixos en el subtipus 1, on uns nivells elevats de Cdk5 es va tornar a associar amb un pitjor pronòstic, tot i que els estudis in vitro, in vivo i ex vivo no indiquen un paper per a la Cdk5 en infiltració immunitària o resposta al bloqueig del punt de control immunitari en CCR. Els resultats d’aquesta tesi doctoral confirmen la rellevància de Cdk5 en CCR, i tot i que es necessiten estudis addicionals, suggerim que la Cdk5 es podria utilitzar com a biomarcador per a la teràpia adjuvant en CCR en estadis inicials o per predir la resposta a quimioteràpies. Alternativament, la inhibició de la Cdk5 es podria utilitzar en la adjuvància per evitar la recaiguda de la malaltia o en un entorn metastàtic en combinació amb oxaliplatí

Effects of short-term pretreatment with 10⁻⁸ M and 10⁻⁶ M ISV on glucagon secretion from palmitate-treated α-TC1–6 cells.

<p>We studied glucagon secretion following 2-hour incubation with or without 0.5 mM palmitate in the presence or absence of 10⁻⁸ M and 10⁻⁶ M ISV in medium containing 18.0 mM glucose. Data is presented as mean ± SEM of 24 samples per group from three independent experiments. One-way ANOVA post hoc analyses: **P<0.01 vs. 18 mM glucose alone.</p

Effects of α-TC1–6 cells and or MIN6 cells on gene expression.

<p>Ins1 (<b>A</b>) and Ins2 (<b>B</b>) expression in MIN6 cells when cultured, for 72 hours, alone or in combination with α-TC1–6 cells. Gcg (<b>C</b>) expression in α-TC1–6 cells cultured, for 72 hours, alone or in combination with MIN6 cells. All data are expressed as relative level to control (n = 6 samples per group). **P<0.01, ***P<0.001.</p

Impact of ISV on glucagon content, TG content, and ³H-thymidine incorporation in α-TC1–6 cells.

<p>After 72 h pre-treatment with or without 0.5 mM palmitate (Pal) in the presence or absence of ISV 10⁻⁸ M and 10⁻⁶ M; illustrating glucagon content, TG content and ³H-thymidine incorporation in α-TC1–6 cells. Data is presented as mean ± SEM; n = 10–12 per group in glucagon content (<b>A</b>) and n = 21–24 per group in TG content (<b>B</b>), whereas data in ³H-thymidine incorporation (<b>C</b>) are expressed as a relative ratio compare to control group of n = 30 per group from three independent experiments. *P<0.05, **P<0.01 vs. control. ^#P<0.05 vs. Pal.</p

Effects of palmitate and ISV on gene expression.

<p>After 72 h of treatment with or without 0.5 mM palmitate (Pal) in the presence or absence of ISV 10⁻⁸ M and 10⁻⁶ M, gene expression levels in α-TC1–6 cells were determined and normalized to Hprt. Data is expressed as relative level to control (n = 10–12 samples in each group, RNA extracted from three independent experiments). *P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001 vs. control. ^#P<0.05, ^##P<0.01 vs. 0.5 mM Pal.</p

Anti-lipotoxicity and anti-glucotoxicity effects of isosteviol (ISV) in isolated mice islets.

<p>Islets were incubated at 11.1 mM glucose in the presence of 0 mM, 0.5 mM palmitate (Pal) and 0.5 mM Pal with 10⁻⁶ M ISV for 72 h. Glucagon (<b>A</b>) and insulin (<b>B</b>) secretion were measured by incubation of 5 islets with medium containing 18 mM glucose for 2 h. Data is presented as mean ± SEM (n = 18 samples each group from 3 separate experiments). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. control. ^#P<0.05 vs. 0.5 mM Pal.</p