Estudio estructural y funcional de perivitelinas de Pomacea canaliculata (Lamarck, 1822) y P. scalaris (d'Orbigny, 1835) (Architaenioglossa: ampullariidae)

En el presente trabajo se buscó ampliar el conocimiento acerca de la biología reproductiva de los gasterópodos, estudiando las proteínas del perivitelo de dos especies de Ampullariidae: Pomacea canaliculata (Lamarck, 1822) y Pomacea scalaris (d’Orbigny, 1835). Los ampuláridos son gasterópodos dulceacuícolas de América, Islas del Caribe, África y Asia, alcanzando su mayor diversidad de especies en América del Sur; en nuestro país son integrantes característicos de la malacofauna continental. Esta familia presenta dos tipos de desoves: algunas especies desovan dentro del agua, adhiriendo masas gelatinosas de huevos a macrófitas u otros sustratos sumergidos. En la otra estrategia los desoves son realizados frecuentemente varios centímetros por encima del nivel del agua y los huevos se depositan en masas presentando una cáscara calcárea. La mayoría de estos huevos aéreos presentan una coloración muy llamativa y registran muy pocos casos de depredación en condiciones naturales. Al menos en una especie, Pomacea paludosa (Say, 1829), esta coloración se ha vinculado con la no palatabilidad de los huevos, y se ha sugerido que sería una coloración de advertencia (coloración aposemática). La estrategia de oviposición aérea parece ser una sinapomorfía de las especies más derivadas de Ampullariidae, principalmente del llamado “grupo Pomacea”; las especies del Viejo Mundo y los grupos basales del Nuevo Mundo en cambio, retienen la oviposición dentro del agua o cerca de su superficie. Esta nueva estrategia de oviposición aérea podría representar un hecho clave en la evolución reciente de los Ampullariidae, cuyo carácter ventajoso desde el punto de vista selectivo queda puesto de manifiesto por el hecho de que los grupos derivados son los que incluyen mayor número de especies y exhiben una mayor distribución geográfica. Este cambio en la estrategia reproductiva fue acompañado de cambios anatómicos y fisiológicos en los adultos que les permitieron salir fuera del agua durante el desove, pero también debe haber incluido cambios drásticos en la bioquímica de los huevos para soportar las condiciones de insolación, desecación y depredadores permitiendo así el desarrollo embrionario fuera del agua. Este tipo de adaptaciones bioquímicas han sido muy poco estudiadas. Los huevos en esta familia, como en la mayoría de los gasterópodos, presentan un limitado contenido de vitelo, cuyas funciones son provistas por una envoltura secretada por la glándula del albumen de la hembra denominada fluido perivitelino (FPV) compuesto principalmente por polisacáridos y proteínas. Las proteínas del FPV, denominadas perivitelinas, eran consideradas tradicionalmente como reserva nutricia para el embrión, representando una fuente de aminoácidos que servirían eventualmente para sintetizar proteínas o como fuentes de energía. A medida que se ha avanzado en el conocimiento de las perivitelinas en un mayor número de especies, se ha encontrado que estas presentan múltiples funciones. Esto es, cumplen funciones biológicas específicas durante el desarrollo, antes de ser finalmente consumidas por el embrión. Las pocas perivitelinas que han sido estudiadas presentan funciones asociadas a factores de crecimiento, actividad antimicrobiana y actividad inhibitoria de proteasas. La especie cuyas perivitelinas han sido más ampliamente estudiadas es P. canaliculata, una especie de estrategia de oviposición aérea. La principal perivitelina en esta especie es la ovorubina (OR), una glicoproteína cuyo principal cofactor es el carotenoide astaxantina. Dentro de las funciones adicionales a su rol nutricio, la OR cumple las funciones de transportar y estabilizar las moléculas antioxidantes que serán utilizadas por el embrión, de otorgar coloración al huevo, que como dijimos sería una alarma aposemática, y al mismo tiempo de fotoproteger al embrión en sus primeras etapas de desarrollo. También se ha demostrado que la OR tiene la capacidad de inhibir serínproteasas, y dado que algunas de las proteasas inhibidas son de origen bacteriano y fúngico, se interpretó que esta perivitelina cumpliría una función antimicrobiana en el huevo, aunque esto no fue nunca demostrado. En el presente trabajo, se estudió el FPV de otra especie con la misma estrategia de oviposición, P. scalaris, ya que se desconocían las perivitelinas en otras especies de esta familia. También se avanzó en la caracterización estructural y funcional de la OR de P. canaliculata, explorando si presentaba actividad antimicrobiana, y estudiándose su estabilidad en diferentes condiciones de pH y su susceptibilidad frente a proteasas.Facultad de Ciencias Naturales y Muse

The role of the proteinase inhibitor ovorubin in apple snail eggs resembles plant embryo defense against predation

Background: Fieldwork has thoroughly established that most eggs are intensely predated. Among the few exceptions are the aerial egg clutches from the aquatic snail Pomacea canaliculata which have virtually no predators. Its defenses are advertised by the pigmented ovorubin perivitellin providing a conspicuous reddish coloration. The nature of the defense however, was not clear, except for a screening for defenses that identified a neurotoxic perivitellin with lethal effect on rodents. Ovorubin is a proteinase inhibitor (PI) whose role to protect against pathogens was taken for granted, according to the prevailing assumption. Through biochemical, biophysical and feeding experiments we studied the proteinase inhibitor function of ovorubin in egg defenses. Methodology/Principal Findings: Mass spectrometry sequencing indicated ovorubin belongs to the Kunitz-type serine proteinase inhibitor family. It specifically binds trypsin as determined by small angle X-ray scattering (SAXS) and crosslinking studies but, in contrast to the classical assumption, it does not prevent bacterial growth. Ovorubin was found extremely resistant to in vitro gastrointestinal proteolysis. Moreover feeding studies showed that ovorubin ingestion diminishes growth rate in rats indicating that this highly stable PI is capable of surviving passage through the gastrointestinal tract in a biologically active form. Conclusions: To our knowledge, this is the first direct evidence of the interaction of an egg PI with a digestive protease of potential predators, limiting predator's ability to digest egg nutrients. This role has not been reported in the animal kingdom but it is similar to plant defenses against herbivory. Further, this would be the only defense model with no tradeoffs between conspicuousness and noxiousness by encoding into the same molecule both the aposematic warning signal and an antinutritive/antidigestive defense. These defenses, combined with a neurotoxin and probably unpalatable factors would explain the near absence of predators, opening new perspectives in the study of the evolution and ecology of egg defensive strategies.Facultad de Ciencias Naturales y Muse

Hemocyanin of the caenogastropod Pomacea canaliculata exhibits evolutionary differences among gastropod clades

Structural knowledge of gastropod hemocyanins is scarce. To better understand their evolution and diversity we studied the hemocyanin of a caenogastropod, Pomacea canaliculata (PcH). Through a proteomic and genomic approach, we identified 4 PcH subunit isoforms, in contrast with other gastropods that usually have 2 or 3. Each isoform has the typical Keyhole limpet-type hemocyanin architecture, comprising a string of eight globular functional units (FUs). Correspondingly, genes are organized in eight FUs coding regions. All FUs in the 4 genes are encoded by more than one exon, a feature not found in non- caenogastropods. Transmission electron microscopy images of PcH showed a cylindrical structure organized in di, tri and tetra-decamers with an internal collar structure, being the di and tridecameric cylinders the most abundant ones. PcH is N-glycosylated with high mannose and hybrid-type structures, and complex-type N-linked glycans, with absence of sialic acid. Terminal β-N-GlcNAc residues and nonreducing terminal α-GalNAc are also present. The molecule lacks O-linked glycosylation but presents the T-antigen (Gal-β1,3-GalNAc). Using an anti-PcH polyclonal antibody, no cross-immunoreactivity was observed against other gastropod hemocyanins, highlighting the presence of clade-specific structural differences among gastropod hemocyanins. This is, to the best of our knowledge, the first gene structure study of a Caenogastropoda hemocyanin.Fil: Chiumiento, Ignacio Rafael. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Ituarte, Santiago. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Sun, Jin. Hong Kong University of Science and Technology. Department of Ocean Science; ChinaFil: Qiu, Jian Wen. Hong Kong Baptist University. Department of Biology; ChinaFil: Heras, Horacio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Dreon, Marcos Sebastian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; Argentin

Lectinas como proteínas defensivas del género Pomacea (Caenogastropoda, Ampullaridae) : Características estructurales y funcionales relacionadas con la estrategia de oviposición aérea

En este trabajo caracterizamos por primera vez estructural y funcionalmente a PdPV1, la carotenoproteína de huevos de Pomacea diffusa, una especie cercana a P. scalaris. Su peso molecular y estructura global fueron estudiados por PAGE, cromatografía de exclusión molecular (SEC) y dispersion de rayos X a bajo ángulo (SAXS) y la secuencia de subunidades determinadas por espectrometría de masas y análisis bioinformático del transcriptoma. Asimismo, su estabilidad térmica fue evaluada por espectroscopía de absorción y fluorescencia y por SAXS. La actividad lectina de PdPV1 se estudió mediante ensayos de hemaglutinación.Facultad de Ciencias Médica

Agglutinating activity and structural characterization of Scalarin, the major egg protein of the snail <i>Pomacea scalaris</i> (d'Orbigny, 1832)

Apple snail perivitellins are emerging as ecologically important reproductive proteins. To elucidate if the protective functions of the egg proteins of Pomacea canaliculata (Caenogastropoda, Ampullariidae), involved in embryo defenses, are present in other Pomacea species we studied scalarin (PsSC), the major perivitellin of Pomacea scalaris. Using small angle X-ray scattering, fluorescence and absorption spectroscopy and biochemical methods, we analyzed PsSC structural stability, agglutinating activity, sugar specificity and protease resistance. PsSC aggluttinated rabbit, and, to a lesser extent, human B and A erythrocytes independently of divalent metals Ca2+ and Mg2+ were strongly inhibited by galactosamine and glucosamine. The protein was structurally stable between pH 2.0 to 10.0, though agglutination occurred only between pH 4.0 to 8.0 (maximum activity at pH 7.0). The agglutinating activity was conserved up to 60°C and completely lost above 80°C, in agreement with the structural thermal stability of the protein (up to 60°C). PsSC was able to withstand in vitro gastrointestinal digestion, and showed no trypsin inhibition activity. The presence of lectin activity has been reported in eggs of other Pomacea snails, but here we link for the first time, this activity to an apple snail multifunctional perivitellin. This novel role for a snail egg storage protein is different from closely related P.canaliculata defensive proteins.Facultad de Ciencias Exacta

The eggs of the apple snail <i>Pomacea maculata</i> are defended by indigestible polysaccharides and toxic proteins

The freshwater snails Pomacea lay conspicuous aerial eggs clutches that are ignored by most predators. Egg biochemical defenses in the apple snail P. canaliculata (Lamarck, 1822) are provided by multifunctional proteins. We analyzed the eggs of a sympatric species, P. maculata Perry,1810, studying the gross composition, toxicity, hemagglutinating activity, as well as its antinutritive and antidigestive properties. Eggs are mostly composed of polysaccharides, mainly galactogen, and proteins, followed by lipids and non-soluble calcium. Two perivitellins account for ∼85 % dw of the egg protein. The major lipids are phospholipids and sterols. A suite of potential defenses were determined, including strong lethal neurotoxicity on mice and moderate antidigestive and lectin activities. Remarkably, their polysaccharides were refractive to in vitro digestion by digestive glycosidases. This study characterized ∼99% of egg composition and identified multiple potential defenses, provided not only by proteins but also polysaccharides. This is the first evidence to our knowledge that reserve sugars may be involved in defenses, giving further insight into the unusual reproductive strategy of these well defended snail eggs.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La PlataFacultad de Ciencias Naturales y Muse

Lectinas como proteínas defensivas del género Pomacea (Caenogastropoda, Ampullaridae) : Características estructurales y funcionales relacionadas con la estrategia de oviposición aérea

En este trabajo caracterizamos por primera vez estructural y funcionalmente a PdPV1, la carotenoproteína de huevos de Pomacea diffusa, una especie cercana a P. scalaris. Su peso molecular y estructura global fueron estudiados por PAGE, cromatografía de exclusión molecular (SEC) y dispersion de rayos X a bajo ángulo (SAXS) y la secuencia de subunidades determinadas por espectrometría de masas y análisis bioinformático del transcriptoma. Asimismo, su estabilidad térmica fue evaluada por espectroscopía de absorción y fluorescencia y por SAXS. La actividad lectina de PdPV1 se estudió mediante ensayos de hemaglutinación.Facultad de Ciencias Médica

A lectin of a non-invasive apple snail as an egg defense against predation alters the rat gut morphophysiology

The eggs of the freshwater Pomacea apple snails develop above the water level, exposed to varied physical and biological stressors. Their high hatching success seems to be linked to their proteins or perivitellins, which surround the developing embryo providing nutrients, sunscreens and varied defenses. The defensive mechanism has been unveiled in P. canaliculata and P. maculata eggs, where their major perivitellins are pigmented, non-digestible and provide a warning coloration while another perivitellin acts as a toxin. In P. scalaris, a species sympatric to the former, the defense strategy seems different, since no toxin was found and the major perivitellin, PsSC, while also colored and non-digestible, is a carbohydrate-binding protein. In this study we examine the structure and function of PsSC by sequencing its subunits, characterizing its carbohydrate binding profile and evaluating its effect on gut cells. Whereas cDNA sequencing and database search showed no lectin domain, glycan array carbohydrate binding profile revealed a strong specificity for glycosphingolipids and ABO group antigens. Moreover, PsSC agglutinated bacteria in a dose-dependent manner. Inspired on the defensive properties of seed lectins we evaluated the effects of PsSC on intestinal cells both in vitro (Caco-2 and IEC-6 cells) and in the gastrointestinal tract of rats. PsSC binds to Caco-2 cell membranes without reducing its viability, while a PsSC-containing diet temporarily induces large epithelium alterations and an increased absorptive surface. Based on these results, we propose that PsSC is involved in embryo defenses by altering the gut morphophysiology of potential predators, a convergent role to plant defensive lectins.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La PlataFacultad de Ciencias VeterinariasFacultad de Ciencias Naturales y MuseoFacultad de Ciencias Médica

Lectinas como proteínas defensivas del género Pomacea (Caenogastropoda, Ampullaridae) : Características estructurales y funcionales relacionadas con la estrategia de oviposición aérea

En este trabajo caracterizamos por primera vez estructural y funcionalmente a PdPV1, la carotenoproteína de huevos de Pomacea diffusa, una especie cercana a P. scalaris. Su peso molecular y estructura global fueron estudiados por PAGE, cromatografía de exclusión molecular (SEC) y dispersion de rayos X a bajo ángulo (SAXS) y la secuencia de subunidades determinadas por espectrometría de masas y análisis bioinformático del transcriptoma. Asimismo, su estabilidad térmica fue evaluada por espectroscopía de absorción y fluorescencia y por SAXS. La actividad lectina de PdPV1 se estudió mediante ensayos de hemaglutinación.Facultad de Ciencias Médica

Novel role for animal innate immune molecules: Enterotoxic activity of a snail egg MACPF-Toxin

Gastropod Molluscs rely exclusively on the innate immune system to protect from pathogens, defending their embryos through maternally transferred effectors. In this regard, Pomacea snail eggs, in addition to immune defenses, have evolved the perivitellin-2 or PV2 combining two immune proteins into a neurotoxin: a lectin and a pore-forming protein from the Membrane Attack Complex/Perforin (MACPF) family. This binary structure resembles AB-toxins, a group of toxins otherwise restricted to bacteria and plants. Many of these are enterotoxins, leading us to explore this activity in PV2. Enterotoxins found in bacteria and plants act mainly as pore-forming toxins and toxic lectins, respectively. In animals, although both pore-forming proteins and lectins are ubiquitous, no enterotoxins have been reported. Considering that Pomacea snail eggs ingestion induce morpho-physiological changes in the intestinal mucosa of rodents and is cytotoxic to intestinal cells in culture, we seek for the factor causing these effects and identified PmPV2 from Pomacea maculata eggs. We characterized the enterotoxic activity of PmPV2 through in vitro and in vivo assays. We determined that it withstands the gastrointestinal environment and resisted a wide pH range and enzymatic proteolysis. After binding to Caco-2 cells it promoted changes in surface morphology and an increase in membrane roughness. It was also cytotoxic to both epithelial and immune cells from the digestive system of mammals. It induced enterocyte death by a lytic mechanism and disrupted enterocyte monolayers in a dose-dependent manner. Further, after oral administration to mice PmPV2 attached to enterocytes and induced large dose-dependent morphological changes on their small intestine mucosa, reducing the absorptive surface. Additionally, PmPV2 was detected in the Peyer's patches where it activated lymphoid follicles and triggered apoptosis. We also provide evidence that the toxin can traverse the intestinal barrier and induce oral adaptive immunity with evidence of circulating antibody response. As a whole, these results indicate that PmPV2 is a true enterotoxin, a role that has never been reported to lectins or perforin in animals. This extends by convergent evolution the presence of plant- and bacteria-like enterotoxins to animals, thus expanding the diversity of functions of MACPF proteins in nature.Fil: Giglio, Matías Leonel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Ituarte, Santiago. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Ibañez, Esteban Andrés. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo; ArgentinaFil: Dreon, Marcos Sebastian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Prieto, Eduardo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas; ArgentinaFil: Fernández, Patricia Ester. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias; ArgentinaFil: Heras, Horacio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; Argentin