Aspartilendopeptidasas de Silybum marianum (L) Gaertn con potencial aplicación en la industria láctea

El objetivo general de este trabajo fue aislar, purificar y caracterizar peptidasas aspárticas presentes en flores de Silybum marianum (L.) Gaertn. (Asteraceae) y estudiar su potencial aplicación como “cuajo vegetal”. A partir de este objetivo general se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Obtener preparaciones enzimáticas crudas de flores de Silybum marianum (L.) Gaertn. y caracterizar los extractivos obtenidos. 2. Purificar parcialmente los extractos crudos y caracterizar las preparaciones parcialmente purificadas. 3. Determinar la actividad coagulante de leche bovina de las preparaciones parcialmente purificadas. 4. Obtener hidrolizados parciales de proteínas de leche bovina, caprina y ovina y realizar el análisis electroforético de los mismos. 5. Purificar la enzima de interés a partir de los extractivos de Silybum marianum (L.) Gaertn. y caracterizar la enzima purificada.Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la colaboración del Instituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM).Facultad de Ciencias Exacta

DEFENSINAS DE FLORES DE CARDOS CON POTENCIAL APLICACIÓN BIOTECNOLÓGICA

Frente al ataque de un patógeno, las plantas pueden producir una gran diversidad de factores de defensa tales como metabolitos secundarios y una amplia gama de proteínas y péptidos antimicrobianos (AMPs), entre los que se encuentran las defensinas. Estas son pequeñas proteínas catiónicas ricas en cisteína cuya principal actividad reportada es la antifúngica, pero se han descripto también muchas otras acciones para estas proteínas. En vista su alto grado de conservación estructural, las diferencias en las especificidades y las múltiples actividades de estas proteínas pueden ser atribuidas a la variación en la secuencia aminoacídica y a la distribución de cargas de los loops expuestos al solvente que modulan su función biológica. En estos loops se localizan dos motivos importantes su actividad, el g-core, un motivo de relevancia para los AMPs en general, y el a-core que no ha sido estudiado en profundidad. Mi plan de tesis está orientado hacia la obtención y el estudio de nuevas proteínas de defensa de una especie vegetal silvestre de la flora argentina, que puedan resultar moléculas atractivas para su potencial aplicación agronómica o médica. Las especies silvestres constituyen una valiosa fuente de AMPs por su notable adaptación al medio ambiente, lo que resulta en una mayor resistencia a enfermedades en comparación con los cultivos agrícolas. En el transcurso de mi tesis, a partir de ARNm de flores de Silybum marianum se clonaron dos defensinas (DefSm1-D y DefSm2-D), se realizó el análisis de las secuencias, la predicción de la estructura terciaria a través del modelado molecular por homología y su análisis funcional. Con el fin de profundizar el conocimiento de las relaciones estructura-función e identificar regiones relacionadas con la actividad antifúngica, a partir del estudio estructural de las defensinas se realizó el diseño racional péptidos derivados de las regiones a- y g-core. Se realizó la síntesis química de péptidos en fase sólida utilizando la estrategia Fmoc y se purificaron y analizaron por HPLC-RP, ESI-MS y CD. Se evaluó y caracterizó la acción de los péptidos sobre dos hongos fitopatógenos del género Fusarium. Los péptidos derivados de DefSm2-D resultaron ser activos en concentraciones micromolares frente a F. graminearum, un fitopatógeno que afecta al cultivo de trigo produciendo no sólo mermas significativas en el rendimiento sino también micotoxinas que permanecen en los granos. Se evaluó el tiempo necesario para que los péptidos más activos produzcan muerte celular; la capacidad permeabilizadora de membrana por microscopía de fluorescencia, y el efecto sobre la ultraestructura por TEM. Los péptidos derivados del α-core produjeron agregación de los conidios del hongo y un efecto diferencial sobre la morfología de la pared celular. Nuestra investigación sugiere que las regiones a- y g-core estarían implicadas en la actividad antifúngica de la defensina de origen actuando mediante mecanismos diferenciales.   &nbsp

DISEÑO DE PÉPTIDOS ANTIFÚNGICOS A PARTIR DE DOS DEFENSINAS DE FLORES DE CARDO. SÍNTESIS Y ACTIVIDAD CONTRA Fusarium graminearum

Las defensinas vegetales son péptidos básicos ricos en cisteína de 45 a 54 aminoácidos y estructura conservada. A pesar de su similitud estructural presentan diversidad de secuencias, lo cual puede dar cuenta de las diferentes funciones atribuidas (actividad antibacteriana, antifúngica, etc). Se han identificado dos regiones muy conservadas entre las defensinas vegetales, las cuales son importantes en relación con la actividad que exhiben: el gamma-core ubicado en la región C-terminal y el alpha-core localizado en la región N-terminal. 63 En este trabajo se diseñaron péptidos potecialmente antifúngicos a partir de estas regiones, a través del uso de herramientas bioinformáticas y empleando como plantilla la secuencia de dos defensinas de Silybum marianum. previamente clonadas (DefSm1D y DefSm2). Cinco péptidos fueron sintetizados, purificados y caracterizados: tres derivados de DefSm1D, llamados 3243, 3245 y 3246; y dos a partir de la secuencia de DefSm2, denominados 3248 y 3250. Se evaluó su actividad contra el hongo fitopatógeno Fusarium graminearum y dos de ellos, 3248 y 3250, resultaron activos en concentraciones micromolares. Se ensayó también la capacidad de los péptidos de permeabilizar la membrana de conidios de F. graminearum evaluando la captación de ioduro de propidio (IP) a través de microscopía de fluorescencia. Los conidios tratados tanto con 3248 como con 3250 produjeron la permeabilización de las membranas de los conidios. El presente trabajo contribuye al conocimiento de las defensinas, las cuales son proteínas de defensa ricas en cisteína presentes en la especie en estudio, que crece en forma silvestre en Argentina y que naturalmente presenta una significativa resistencia a patógenos fúngicos

Diseño de péptidos antifúngicos a partir de dos defensinas de flores de cardo : síntesis y actividad contra fusarium graminearum

Las defensinas vegetales son péptidos básicos ricos en cisteína de 45 a 54 aminoácidos y estructura conservada. A pesar de su similitud estructural presentan diversidad de secuencias, lo cual puede dar cuenta de las diferentes funciones atribuidas (actividad antibacteriana, antifúngica, etc). Se han identificado dos regiones muy conservadas entre las defensinas vegetales, las cuales son importantes en relación con la actividad que exhiben: el -core ubicado en la región C-terminal y el α-core localizado en la región N-terminal. En este trabajo se diseñaron péptidos potecialmente antifúngicos a partir de estas regiones, a través del uso de herramientas bioinformáticas y empleando como plantilla la secuencia de dos defensinas de Silybum marianum (L.) Gaertn. previamente clonadas (DefSm1D y DefSm2). Cinco péptidos fueron sintetizados, purificados y caracterizados: tres derivados de DefSm1D, llamados 3243, 3245 y 3246; y dos a partir de la secuencia de DefSm2, denominados 3248 y 3250. Se evaluó su actividad contra el hongo fitopatógeno Fusarium graminearum Schwabe y dos de ellos, 3248 y 3250, resultaron activos en concentraciones micromolares. El presente trabajo contribuye al conocimiento de las defensinas, las cuales son proteínas de defensa ricas en cisteína presentes en la especie en estudio, que crece en forma silvestre en Argentina y que naturalmente presenta una significativa resistencia a patógenos fúngicosFil: Fernandez, Agustina. Universidad Nacional de La PlataFil: Malbrán, Ismael. Universidad Nacional de La PlataFil: Vairo Cavalli, Sandra Elizabeth. Universidad Nacional de La Plat

Hydrolysis of caprine and ovine milk proteins, brought about by aspartic peptidases from Silybum marianum flowers

The flowers of cardoon (Asteraceae) are a rich source of aspartic peptidases which possess milk clotting activity – and are thus used in traditional cheesemaking in the Iberian Peninsula. This study was aimed at characterizing the enzymatic action of the aspartic peptidases present in flowers of Silybum marianum (L.) Gaertn. (Asteraceae), specifically upon degradation of caseins. The proteolytic activities toward Na-caseinates previously prepared from caprine and ovine milks were studied, in a comparative fashion, using urea-PAGE, tricine-SDS-PAGE, densitometry, electroblotting and sequencing. Caprine as1- and b-caseins were degraded up to 68% and 40%, respectively, during 24 h of incubation. Only one important and well-defined band corresponding to a molecular weight of 14.4 kDa – i.e. a fragment of b-casein, was observed by 12 h of hydrolysis. By 24 h of incubation, ovine as- and b-caseins were degraded up to 76% and 19%, respectively. In what concerns specificity, the major cleavage site in ovine caseinate was Leu99-Arg100 in as1-casei

Peptidasas aspárticas de flores de Asteraceae con potencial aplicación biotecnológica

En las últimas décadas el interés por las peptidasas se ha incrementado significativamente. La gran mayoría de las enzimas comerciales que se emplean se obtienen principalmente de microorganismos. Sin embargo, también pueden ser extraídas de especies vegetales que se presentan como una fuente promisoria de estas moléculas. De hecho, las peptidasas vegetales son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria, farmacéutica, biotecnológica y de detergentes, y son candidatas atractivas para el desarrollo de nuevos fármacos y en terapias combinadas. Están ampliamente distribuidas en los organismos vivos. Típicamente presentan un prodominio autoinhibitorio, que debe ser eliminado para activar la enzima. Si bien todas llevan a cabo la misma reacción que consiste en la hidrólisis de los enlaces peptídicos de las proteínas, difieren sin embargo, en la especificidad de sustrato, pH óptimo, la temperatura y otros parámetros que hacen que sus propiedades sean únicas, mostrando una gran diversidad funcional. Dentro de estas moléculas, las peptidasas aspárticas (PAs), constituyen una de las principales clases de peptidasas. Las flores de cardo (familia Asteraceae) son una fuente rica de PAs. Con el fin de asegurar una fuente continua de dichas enzimas, las mismas pueden ser obtenidas de su fuente natural o por métodos recombinantes. Debido a sus propiedades características se emplean en diversos procesos industriales. Ejemplos de aplicaciones tradicionales de estas peptidasas como fabricación de queso así como otras aplicaciones promisorias como la obtención de péptidos bioactivos con actividad antimicrobiana y citotóxica, acción en la remodelación de la matriz extracelular, inmovilización en esponjas de quitosano, catalizadores en medios orgánicos son discutidas en esta revisión.The interest in peptidase has increased significantly in recent decades. The vast majority of commercial enzymes used in industry are mainly obtained from microorganisms. However, they can also be extracted from plant species that are considered as a promising source of these molecules. In fact, plant peptidases are widely used in the food, detergent, pharmaceutical and biotechnological industry, and are attractive candidates for the development of new drugs and in combination therapies. They are widely distributed in living organisms. Typically they have a self-inhibitory prodomain, which must be removed to activate the enzyme. While all peptidases carried out the same reaction, the hydrolysis of protein peptide bonds, they differ in substrate specificity, optimum pH and temperature as well as in other parameters that make their properties unique, showing a great functional diversity. Among these molecules, aspartic peptidases (APs) are one of the major classes of proteolytic enzymes. Thistle flowers (family Asteraceae) are a rich source of APs. In order to ensure a continuous supply of Aps from flowers, they can be obtained from its natural source or by recombinant methods. Because of their distinctive properties Aps from thistle flowers are used in various industrial processes. Cheese-making is an example of traditional use of thistle APs, but also other promising applications such as production of bioactive peptides with antimicrobial and cytotoxic activity, remodelling of bone extracellular matrix, immobilization in chitosan sponges for drug delivery, and catalysis in organic media are discussed in this review

Diseño de péptidos antifúngicos a partir de dos defensinas de flores de cardo : Síntesis y actividad contra Fusarium graminearum

Las defensinas vegetales son péptidos básicos ricos en cisteína de 45 a 54 aminoácidos y estructura conservada. A pesar de su similitud estructural presentan diversidad de secuencias, lo cual puede dar cuenta de las diferentes funciones atribuidas (actividad antibacteriana, antifúngica, etc). Se han identificado dos regiones muy conservadas entre las defensinas vegetales, las cuales son importantes en relación con la actividad que exhiben: el gamma-core ubicado en la región C-terminal y el alpha-core localizado en la región N-terminal. En este trabajo se diseñaron péptidos potecialmente antifúngicos a partir de estas regiones, a través del uso de herramientas bioinformáticas y empleando como plantilla la secuencia de dos defensinas de Silybum marianum. previamente clonadas (DefSm1D y DefSm2). Cinco péptidos fueron sintetizados, purificados y caracterizados: tres derivados de DefSm1D, llamados 3243, 3245 y 3246; y dos a partir de la secuencia de DefSm2, denominados 3248 y 3250. Se evaluó su actividad contra el hongo fitopatógeno Fusarium graminearum y dos de ellos, 3248 y 3250, resultaron activos en concentraciones micromolares. Se ensayó también la capacidad de los péptidos de permeabilizar la membrana de conidios de F. graminearum evaluando la captación de ioduro de propidio (IP) a través de microscopía de fluorescencia. Los conidios tratados tanto con 3248 como con 3250 produjeron la permeabilización de las membranas de los conidios. El presente trabajo contribuye al conocimiento de las defensinas, las cuales son proteínas de defensa ricas en cisteína presentes en la especie en estudio, que crece en forma silvestre en Argentina y que naturalmente presenta una significativa resistencia a patógenos fúngicos.Universidad Nacional de La Plat

Diseño de péptidos antifúngicos a partir de dos defensinas de flores de cardo : Síntesis y actividad contra Fusarium graminearum

Las defensinas vegetales son péptidos básicos ricos en cisteína de 45 a 54 aminoácidos y estructura conservada. A pesar de su similitud estructural presentan diversidad de secuencias, lo cual puede dar cuenta de las diferentes funciones atribuidas (actividad antibacteriana, antifúngica, etc). Se han identificado dos regiones muy conservadas entre las defensinas vegetales, las cuales son importantes en relación con la actividad que exhiben: el gamma-core ubicado en la región C-terminal y el alpha-core localizado en la región N-terminal. En este trabajo se diseñaron péptidos potecialmente antifúngicos a partir de estas regiones, a través del uso de herramientas bioinformáticas y empleando como plantilla la secuencia de dos defensinas de Silybum marianum. previamente clonadas (DefSm1D y DefSm2). Cinco péptidos fueron sintetizados, purificados y caracterizados: tres derivados de DefSm1D, llamados 3243, 3245 y 3246; y dos a partir de la secuencia de DefSm2, denominados 3248 y 3250. Se evaluó su actividad contra el hongo fitopatógeno Fusarium graminearum y dos de ellos, 3248 y 3250, resultaron activos en concentraciones micromolares. Se ensayó también la capacidad de los péptidos de permeabilizar la membrana de conidios de F. graminearum evaluando la captación de ioduro de propidio (IP) a través de microscopía de fluorescencia. Los conidios tratados tanto con 3248 como con 3250 produjeron la permeabilización de las membranas de los conidios. El presente trabajo contribuye al conocimiento de las defensinas, las cuales son proteínas de defensa ricas en cisteína presentes en la especie en estudio, que crece en forma silvestre en Argentina y que naturalmente presenta una significativa resistencia a patógenos fúngicos.Universidad Nacional de La Plat

Aspartic peptidases from flowers of Asteraceae with potential biotechnological application

En las últimas décadas el interés por las peptidasas se ha incrementado significativamente. La gran mayoría de las enzimas comerciales que se emplean se obtienen principalmente de microorganismos. Sin embargo, también pueden ser extraídas de especies vegetales que se presentan como una fuente promisoria de estas moléculas. De hecho, las peptidasas vegetales son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria, farmacéutica, biotecnológica y de detergentes, y son candidatas atractivas para el desarrollo de nuevos fármacos y en terapias combinadas. Están ampliamente distribuidas en los organismos vivos. Típicamente presentan un prodominio autoinhibitorio, que debe ser eliminado para activar la enzima. Si bien todas llevan a cabo la misma reacción que consiste en la hidrólisis de los enlaces peptídicos de las proteínas, difieren sin embargo, en la especificidad de sustrato, pH óptimo, la temperatura y otros parámetros que hacen que sus propiedades sean únicas, mostrando una gran diversidad funcional. Dentro de estas moléculas, las peptidasas aspárticas (PAs), constituyen una de las principales clases de peptidasas. Las flores de cardo (familia Asteraceae) son una fuente rica de PAs. Con el fin de asegurar una fuente continua de dichas enzimas, las mismas pueden ser obtenidas de su fuente natural o por métodos recombinantes. Debido a sus propiedades características se emplean en diversos procesos industriales. Ejemplos de aplicaciones tradicionales de estas peptidasas como fabricación de queso así como otras aplicaciones promisorias como la obtención de péptidos bioactivos con actividad antimicrobiana y citotóxica, acción en la remodelación de la matriz extracelular, inmovilización en esponjas de quitosano, catalizadores en medios orgánicos son discutidas en esta revisión.The interest in peptidase has increased significantly in recent decades. The vast majority of commercial enzymes used in industry are mainly obtained from microorganisms. However, they can also be extracted from plant species that are considered as a promising source of these molecules. In fact, plant peptidases are widely used in the food, detergent, pharmaceutical and biotechnological industry, and are attractive candidates for the development of new drugs and in combination therapies. They are widely distributed in living organisms. Typically they have a self-inhibitory prodomain, which must be removed to activate the enzyme. While all peptidases carried out the same reaction, the hydrolysis of protein peptide bonds, they differ in substrate specificity, optimum pH and temperature as well as in other parameters that make their properties unique, showing a great functional diversity. Among these molecules, aspartic peptidases (APs) are one of the major classes of proteolytic enzymes. Thistle flowers (family Asteraceae) are a rich source of APs. In order to ensure a continuous supply of Aps from flowers, they can be obtained from its natural source or by recombinant methods. Because of their distinctive properties Aps from thistle flowers are used in various industrial processes. Cheese-making is an example of traditional use of thistle APs, but also other promising applications such as production of bioactive peptides with antimicrobial and cytotoxic activity, remodelling of bone extracellular matrix, immobilization in chitosan sponges for drug delivery, and catalysis in organic media are discussed in this review.Facultad de Ciencias Exacta

Aspartic peptidases from flowers of Asteraceae with potential biotechnological application

En las últimas décadas el interés por las peptidasas se ha incrementado significativamente. La gran mayoría de las enzimas comerciales que se emplean se obtienen principalmente de microorganismos. Sin embargo, también pueden ser extraídas de especies vegetales que se presentan como una fuente promisoria de estas moléculas. De hecho, las peptidasas vegetales son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria, farmacéutica, biotecnológica y de detergentes, y son candidatas atractivas para el desarrollo de nuevos fármacos y en terapias combinadas. Están ampliamente distribuidas en los organismos vivos. Típicamente presentan un prodominio autoinhibitorio, que debe ser eliminado para activar la enzima. Si bien todas llevan a cabo la misma reacción que consiste en la hidrólisis de los enlaces peptídicos de las proteínas, difieren sin embargo, en la especificidad de sustrato, pH óptimo, la temperatura y otros parámetros que hacen que sus propiedades sean únicas, mostrando una gran diversidad funcional. Dentro de estas moléculas, las peptidasas aspárticas (PAs), constituyen una de las principales clases de peptidasas. Las flores de cardo (familia Asteraceae) son una fuente rica de PAs. Con el fin de asegurar una fuente continua de dichas enzimas, las mismas pueden ser obtenidas de su fuente natural o por métodos recombinantes. Debido a sus propiedades características se emplean en diversos procesos industriales. Ejemplos de aplicaciones tradicionales de estas peptidasas como fabricación de queso así como otras aplicaciones promisorias como la obtención de péptidos bioactivos con actividad antimicrobiana y citotóxica, acción en la remodelación de la matriz extracelular, inmovilización en esponjas de quitosano, catalizadores en medios orgánicos son discutidas en esta revisión.The interest in peptidase has increased significantly in recent decades. The vast majority of commercial enzymes used in industry are mainly obtained from microorganisms. However, they can also be extracted from plant species that are considered as a promising source of these molecules. In fact, plant peptidases are widely used in the food, detergent, pharmaceutical and biotechnological industry, and are attractive candidates for the development of new drugs and in combination therapies. They are widely distributed in living organisms. Typically they have a self-inhibitory prodomain, which must be removed to activate the enzyme. While all peptidases carried out the same reaction, the hydrolysis of protein peptide bonds, they differ in substrate specificity, optimum pH and temperature as well as in other parameters that make their properties unique, showing a great functional diversity. Among these molecules, aspartic peptidases (APs) are one of the major classes of proteolytic enzymes. Thistle flowers (family Asteraceae) are a rich source of APs. In order to ensure a continuous supply of Aps from flowers, they can be obtained from its natural source or by recombinant methods. Because of their distinctive properties Aps from thistle flowers are used in various industrial processes. Cheese-making is an example of traditional use of thistle APs, but also other promising applications such as production of bioactive peptides with antimicrobial and cytotoxic activity, remodelling of bone extracellular matrix, immobilization in chitosan sponges for drug delivery, and catalysis in organic media are discussed in this review.Facultad de Ciencias Exacta