Transcriptional control of muscle cell excitation-contraction coupling:the role of activity and mitochondrial function

Abstract Cardiac and skeletal muscle cell contraction is a result of excitation-contraction coupling (ECC), where an electrical signal leads to a rise in intracellular calcium levels and contraction. This process is carefully regulated to meet physiological demand and heavily dependent on an adequate energy supply. Disturbed ECC can have severe consequences on muscle cell function and underlies many cardiac and skeletal muscle pathologies. Cell stress, changing intracellular Ca²⁺ concentrations, and calcium signal dynamics can all play a role in the transcriptional regulation of genes involved in myocyte Ca²⁺-handling. In this thesis project, the transcriptional control of ECC was studied in skeletal and cardiac myocytes. Skeletal myocyte calsequestrin (CASQ1) was downregulated in a mouse model of mitochondrial myopathy and it contributed to the decreased SR Ca²⁺ load and impaired Ca²⁺ handling in Tfam-/- skeletal myocytes. In cultured neonatal cardiomyocytes, mitochondrial uncoupler FCCP-induced mitochondrial dysfunction led to downregulation of cardiac calsequestrin (CASQ2) and similarly impaired Ca²⁺ handling. Whereas there was no increase in reactive oxygen species (ROS) levels in Tfam-/- myocytes, cultured cells exposed to FCCP did display increased ROS, an effect that was counteracted by coexposure with the ROS scavenger (NAC). NAC attenuated FCCP-induced CASQ2 downregulation and restored Ca²⁺ handling. Therefore, mitochondrial dysfunction led to CASQ1/2 downregulation and impaired Ca²⁺ handling in these two cell types, but by different mechanisms. This project also looked at the role of Ca²⁺ dynamics on the transcriptional regulation of Ca²⁺ handling genes. Increased intracellular Ca²⁺ levels and β-adrenergic stimulation of cardiomyocytes activate Ca²⁺-calmodulin kinase II (CaMKII) and can trigger hypertrophic remodeling. It was found that CaMKII downregulated expression of the L-type Ca²⁺ channel α1c-subunit (Cacna1c) in cultured cardiomyocytes. Analysis of the Cacna1c promoter revealed that the transcriptional repressor DREAM bound to a putative downstream regulatory element. The results shed light on the complex interplay between muscle cell energetics and transcriptional regulation of SR Ca²⁺ handling proteins. A unique pathway for Cacna1c transcriptional regulation by CaMKII and DREAM was also described.Tiivistelmä Sydän- ja luustolihassolujen supistuminen on seurausta ärsytys-supistuskytkennästä (ECC), jossa sähköinen ärsytys kohottaa solunsisäistä kalsiumpitoisuutta ja aiheuttaa supistuksen. Tätä säädellään tarkasti fysiologisen tarpeen mukaan, ja se riippuu riittävästä energian saannista. Häiriintynyt ECC voi aiheuttaa vakavia seurauksia lihassolujen toiminnalle, ja se on mukana monien sydän- ja luustolihasten sairauksien synnyssä. Tässä tutkimuksessa ECC:n transkriptionaalista säätelyä tutkittiin luustolihasten ja sydämen lihassoluissa. Luustolihassolujen kalsekvestriinin (CASQ1) väheneminen pienensi SR:n Ca²⁺-määrää mitokondrioiden myopatian hiirimallissa ja heikensi Ca²⁺-tasapainon ylläpitoa Tfam-/--luustolihassoluissa. Viljellyissä vastasyntyneiden kammio-sydänlihassoluissa mitokondrio-irtikytkijän FCCP:n aiheuttama mitokondrioiden toimintahäiriö johti sydämen kalsekvestriinin (CASQ2) vähenemiseen ja heikensi samalla tavalla Ca²⁺-tasapainon ylläpitoa. Vaikka Tfam-/--myosyyteissä reaktiivisten happilajien (ROS) tasot eivät olleet koholla, FCCP:lle altistetuissa viljellyissä soluissa ROS kuitenkin lisääntyi. Vaikutusta esti ROS-puhdistaja NAC, joka heikensi FCCP:n aiheuttamaa CASQ2:n laskua ja palautti Ca²⁺-säätelyn normaaliksi. Mitokondrioiden toimintahäiriö siis johti CASQ1/2:n vähenemiseen ja Ca²⁺-säätelyn heikentymiseen molemmissa solutyypeissä, mutta eri mekanismeilla. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin myös Ca²⁺-dynamiikan osuutta Ca²⁺-tasapainoon osallistuvien geenien transkription säätelyssä. Lisääntynyt solunsisäinen Ca²⁺-taso ja sydänlihassolujen β-adrenerginen stimulointi aktivoivat Ca²⁺-kalmoduliinikinaasi II:n (CaMKII), ja ne voivat laukaista sydämen hypertrofisen uudelleenmuovautumisen. Havaittiin, että CaMKII vähensi L-tyypin Ca²⁺-kanavan a1c-alayksikön (Cacna1c) ilmentymistä viljellyissä sydänlihassoluissa. Promoottorianalyysi osoitti tämän johtuvan transkription repressorin DREAM:n sitoutumisesta oletettuun DRE:hen (alavirrassa sijaitseva säätelyelementti). Nämä tulokset tuovat uutta tietoa lihassolujen energiatalouden ja SR:n Ca²⁺:n vaikuttavien proteiinien transkription säätelyn vuorovaikutuksesta. Lisäksi havaittiin ainutlaatuinen Cacna1c-transkription säätelyn reitti, johon osallistuvat CaMKII ja DREAM

Sarcoplasmic reticulum Ca²⁺-induced Ca²⁺ release regulates class IIa HDAC localization in mouse embryonic cardiomyocytes

Abstract In embryonic cardiomyocytes, sarcoplasmic reticulum (SR)-derived Ca²⁺ release is required to induce Ca²⁺ oscillations for contraction and to control cardiac development through Ca²⁺-activated pathways. Here, our aim was to study how SR Ca²⁺ release regulates cytosolic and nuclear Ca²⁺ distribution and the subsequent effects on the Ca²⁺-dependent localization of class IIa histone deacetylases (HDAC) and cardiac-specific gene expression in embryonic cardiomyocytes. Confocal microscopy was used to study changes in Ca²⁺-distribution and localization of immunolabeled HDAC4 and HDAC5 upon changes in SR Ca²⁺ release in mouse embryonic cardiomyocytes. Dynamics of translocation were also observed with a confocal microscope, using HDAC5-green fluorescent protein transfected myocytes. Expression of class IIa HDACs in differentiating myocytes and changes in cardiac-specific gene expression were studied using real-time quantitative PCR. Inhibition of SR Ca²⁺ release caused a significant decrease in intranuclear Ca²⁺ concentration, a rapid nuclear import of HDAC5 and subnuclear redistribution of HDAC4. Endogenous localization of HDAC5 and HDAC4 was mostly cytosolic and at the nuclear periphery, respectively. Downregulated expression of cardiac-specific genes was also observed upon SR Ca²⁺ release inhibition. Electrical stimulation of sarcolemmal Ca²⁺ influx was not sufficient to rescue either the HDAC localization or the gene expression changes. SR Ca²⁺ release controls subcellular Ca²⁺ distribution and regulates localization of HDAC4 and HDAC5 in embryonic cardiomyocytes. Changes in SR Ca²⁺ release also caused changes in expression of the developmental phase-specific genes, which may be due to the changes in HDAC-localization