Engineeringof Pencillium chrysogenum for enhanced ß-lactam biosynthesis

De ontdekking van penicilline door Alexander Fleming heeft een grote invloed gehad op onze samenleving en de kwaliteit van leven. Tegenwoordig is ook bekend welke genen en de daaraan gekoppelde enzymen verantwoordelijk zijn voor de productie van penicilline in de filamenteuze schimmel Penicillium chrysogenum. Drie van de vier genen die betrokken zijn bij de productie van penicilline liggen bij elkaar in een zogenaamd gencluster (biosynthetisch gencluster). Deze 3 genen zijn: pcbAB dat codeert voor het enzym δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine synthetase (ACVS), pcbC coderend voor isopenicillin N synthase (IPNS) en penDE dat codeert voor isopenicillin N acyltransferase (IAT). Daarnaast is er nog een vierde enzym of klasse van enzymen betrokken bij de productie van penicilline. Deze enzymen zijn CoA ligases die verantwoordelijk zijn voor de Coenzym A activatie van zijketen die gebruikt wordt tijdens het productieproces van penicilline. De genen coderende voor deze enzymen liggen niet geclusterd in tegenstelling tot de andere 3 enzymen betrokken bij de productie van penicilline, maar bevinden zich elders in het DNA van P. chrysogenum. Bijvoorbeeld het enzym phenylacetic acid CoA ligase (PCL) gecodeerd door phl is een enzym dat fenylazijnzuur activeert en betrokken is bij de productie van penicilline G. De moderne industriële productie van β-lactam antibiotica is hoofdzakelijk gebaseerd op P. chrysogenum productiestammen die verkregen zijn middels meerdere rondes van klassieke stamverbetering. Dit klassieke stamverbeteringsproces is hoofdzakelijk uitgevoerd door middel van UV behandelingen en behandeling met toxische/mutagene stoffen, waarna er hoofdzakelijk geselecteerd werd op verbeterde penicilline productie onder relevante productieomstandigheden. Analyse van deze verbeterde productiestammen heeft geleid tot de ontdekking van verschillende belangrijke mutaties. Hiervan heeft de vermeerdering van het aantal kopieën van de biosynthetische gencluster de meeste invloed gehad

Dynamic Functional ForceMeasurements on an Anterior Bite Plane during theNight

Abstract. : Background: : Anterior bite planes are used in removable and fixed appliance treatment. In removable appliance treatment the question arising is whether the delivered forces can achieve active intrusion in terms of their amplitude and duration. In fixed appliance treatment, the force effect on the incisors and associated pathologic side effects, in particular under the application of intrusion mechanics, have to be considered. Subjects and Method: : The aim of the present study was to investigate the effects of an anterior bite plane during the night. For this purpose ten subjects underwent nocturnal sleep investigations by means of a telemetric system. A silicon force sensor was integrated into an anterior bite plane for continuous measurement of bite forces and of the frequency of occlusal contact with the plate. Results: : The occlusal forces exerted on the anterior bite planes ranged between 3 and 80 N. The average forces were 5.5-24 N. The number of occlusal contacts varied between 39 and 558, with forces of between 7 and 9 N being registered in most cases. Major interindividual differences were detected in the magnitude of the force as well as in bite frequency. The intraindividual pattern of arising occlusal forces showed an intermittent force effect. No significant differences were found with regard to gender or growth pattern. Conclusions: : In subjects with removable appliances, no active intrusion of teeth is possible during the night owing to the small number of occlusal contacts. Due to the partially very high forces in fixed appliance therapy, the integration of an anterior bite plane has to be assessed as critical in patients with unfavorable root geometry or bruxis

CORBA und ODMG-93 als Grundlage zur Realisierung eines föderierten Datenbanksystems

Der zunehmende Einsatz von Datenbanksystemen (DBS) führte in den letzten Jahren dazu, daß heute in vielen Organisationen unterschiedliche Datenbanksysteme nebeneinander im Einsatz sind. Gründe hierfür liegen einerseits darin, daß verschiedene Datenbankmanagementsysteme (DBMS) sich in unterschiedlicher Weise gut für bestimmte Anwendungsbereiche eignen, andererseits unterstützen Hersteller von spezieller Anwendungssoftware im allgemeinen nur bestimmte DBMS. Hieraus resultiert, daß der eine Organisation betreffende Realweltauschnitt auf eine Menge von unterschiedlichen Datenhaltungssystemen abgebildet wird. Es zeigt sich, daß diese Systeme sehr oft inhaltlich verwandte Daten verwalten. Diese Situation verschärft sich auch in dem Maße, in dem Organisationen sich zusammenschließen, etwa bei Fusionierung von Unternehmen oder durch Restruktierung von Behörden. Das Betreiben dieser voneinander isolierten DBS innerhalb einer Organisation impliziert eine Reihe von gravierenden Problemen. Die redundante Haltung der gleichen Information in verschiedenen, nicht kooperien den Systemen legt dabei den Benutzern zusätzliche Mehrarbeit auf. Das Verknüpfen von Daten unterschiedlicher DBS wird in keiner Weise unterstützt, wodurch ein Informationsverlust ensteht ("das Ganze ist mehr als die Summe seiner Teile"). Die Entwicklung und Realisierung eines einzigen, unternehmensweiten Datenmodells als Ausweg aus der Krise führt häufig zu sehr komplexen, schlecht überschaubaren und ineffizienten Informationssystemen. Darüber hinaus ist dieser Weg häufig in ökonomischer Hinsicht nicht sinnvoll, da eine Migration erhebliche Kosten verursacht und die bereits bestehenden Anwendungen einen großen Teil des Unternehmens-Know-Hows darstellen. Ein vielversprechender Ansatz zur Integration von heterogenen Datenbeständen innerhalb einer Organisation stellen föderierte Datenbanksysteme (FDBS) dar, welche aktueller Gegenstand der Forschung sind. Föderierte Datenbanksysteme versuchen mithilfe einer zusätzlichen Softwareschicht die Heterogenität der zu integrierenden Datenbanksysteme transparent zu machen und eine neue integrierte Sicht auf die verteilten Daten einer Organisation zu unterstützen. Im Rahmen der Föderation bewahren die bestehenden Datenbanksysteme weitgehend ihre Autonomie, so daß bestehende Anwendungen unverändert weiterlaufen können. Insofern ist ein föderiertes Datenbanksystem durchaus mit einer politischen Föderation, wie etwa der Europäischen Union oder der Uno, zu vergleichen. Ähnlich wie bei einer politischen Föderation besteht die besondere Problematik bei der Entwicklung eines föderierten Datenbanksystems in der Heterogenität der zu integrierenden Teilsysteme. Die Zielse tzung dieser Diplomarbeit besteht darin, vor dem Hintergrund eines konkreten Anwendungs-Szenarios ein föderietes Datenbanksystem zu entwickeln, das versucht die Heterogenitäts-Problematik durch den Einsatz von Standards zu lösen. Als Anwendungs-Szenario wurde die Eingemeindung der Städte Bochum und Wattenscheid und die daraus resultierende Restrukturierung der städtischen Behörden gewählt. Das zu entwickelnde föderierte Datenbanksystem soll die datentechnische Kooperation ausgewählter Behörden unterstützen. Hierbei sollen insbesondere zwei wesentliche Aspekte der Heterogenität der zu integrierenden Datenbanksysteme betrachtet werden:Bezüglich der Heterogenität in der Ablaufumgebung soll in der Diplomarbeit der Ansatz verfolgt werden, die Komponenten des angestrebten FDBS als verteilte, kooperierende Objekte zu konzipieren und zu realisieren. Diese kommunizieren über einen CORBA kompatiblen Object Request Broker (ORB) miteinander. Die Common-Object-Request-Broker-Architecture (CORBA) beschreibt eine objektorientierte Infrastruktur, welche die Entwicklung von verteilten objektorientierten Systemen standardisiert. Der CORBA-Standard könnte schon bald zu einer Art Esperanto für verteilte heterogene Objekte avancieren. Die Heterogenität der Datenbankmanagementsysteme (DBMS) bzw. ihrer unterschiedlichen Datenmodelle soll durch den Einsatz des ODMG-93-Standards für objektorientierte Datenbankmanagementsysteme (ODBMS) überwunden werden. Das objektorientierte Datenmodell dieses Standards soll dabei als gemeinsames Datenmodell des föderierten Datenbanksystems fungieren. Die Rolle des gemeinsamen Datenmodells ist in etwa vergleichbar mit der Rolle der gemeinsamen Amtsprache in einer politischen Föderation. Ihre Ausdrucksstärke hat einen wesentliche Einfluß auf den Grad der erreichbaren Kooperation. Das föderierte Datenbanksystem soll unter Einsatz objektorientierter Entwurfsmethoden entwickelt werden. In der Diplomarbeit soll die Unified Modeling Language, die durch das Entwurfswerkzeug Rational Rose 4.0 unterstützt wird, eingesetzt werden

Steuerung von Fluorierungsreaktionen durch Wasserstoffbrückenbindungen in der Koordinationssphäre von Platin-Fluorido-Komplexen

Die vorliegende Arbeit beinhaltet Studien zur Darstellung, Charakterisierung und Reaktivität von Platin-Fluorido-Komplexen, die 2-(3-Methyl)indolyl-substituierte Phosphan-Liganden besitzen, welche über die Indolyl-Einheiten Wasserstoffbrückenbindungen zu Fluorido-Liganden oder Poly(hydrogenfluorid)¬fluorid-Anionen in der äußeren Ligandensphäre ausbilden. Die Darstellung der Platin-Fluorido-Komplexe gelang dabei über zwei verschiedene Syntheserouten. Die Reaktion von Chlorido-Vorläuferkomplexen mit Tetramethylammoniumfluorid führte zur Deprotonierung der Indolyl-NH-Protonen und einer damit verbundenen Cyclometallierung der Phosphan-Liganden am Platinzentralmetall. Bei Zugabe von Fluorwasserstoff-Quellen erfolgte die Bildung eines Platin-Fluorido-Komplexes, mit dem die Aktivierung von CO zu einem Carbamoyl-Komplex sowie von einem Inamid zu einem ungewöhnlichen Oxazol-Derivat gelang. Eine weitere Möglichkeit zur Darstellung von Platin-Fluorido-Komplexen eröffnete sich durch die Reaktion von Platin-Methyl-Verbindungen mit HF-Quellen. Hierbei bildeten sich Fluorido-Komplexe, bei denen die beiden trans-ständigen Indolylphosphan-Liganden intramolekulare Wasserstoffbrücken zum platingebundenen Fluoratom aufbauen. Die Identität der Fluorido-Komplexe wurde mittels 1H-, 19F , 31P{1H}- sowie 1H,15N-HMBC-NMR-Spektroskopie, IR-Spektroskopie sowie teilweise durch Röntgenstrukturanalysen untersucht. Durch gezielte Veränderungen des zum Fluorido-Liganden trans-ständigen Aryl-Liganden konnten zudem die Struktur-Eigenschafts-Beziehungen näher ermittelt werden. Die Existenz der Wasserstoffbrücken in der äußeren Koordinationssphäre zum Fluorido-Liganden ermöglichte bisher beispiellose Reaktivitäten. So wurde in Modellreaktionen die elektrophile Aktivierung von Alkinen bei gleichzeitiger Bereitstellung des dissoziierten Fluorido-Liganden in der äußeren Koordinationssphäre beobachtet. Hierauf basierend wurden selektive, katalytische Umsetzungen von Alkinen zu (Z)-Fluoralkenen entwickelt.Studies on the formation, characterisation and reactivity of platinum fluorido complexes bearing 2-(3-methyl)indolyl substituted phosphine ligands, which allow for the generation of hydrogen bonding to the fluorido ligand as well as polyfluorides in the outer coordination-sphere are presented. The formation of the platinum fluorido complexes was achieved by two different synthetic routes. Using tetramethylammonium fluoride (TMAF) for an Cl/F exchange at chlorido precursor complexes led to the formation of cyclometallated platinum complexes due to deprotonation of the indolyl NH group of the phosphine ligands. Treatment of the cyclometallated complex with HF-sources led to the formation of a platinum fluorido compound, which was applied in the electrophilic activation of carbon monoxide as well as an ynamide generating a carbamoyl complex and an exceptional metal bound oxazole derivative, respectively. Additionally, platinum fluorido complexes were accessible through protonation of methyl ligands of suitable precursor complexes. Using this route, fluorido complexes bearing trans coordinated indolylphosphine ligands are formed, which allow for the generation of two hydrogen bonds to the fluorido ligand. The structure of the fluorido complexes were analysed by 1H-, 19F-, 31P{1H}- and 1H,15N-HMBC NMR data, IR-spectroscopy and in part by single crystal X-ray diffraction. Variation of the aryl ligands in a mutually trans position to the platinum bound fluorine atom gave an insight on the structure-property relationships of the fluorido complexes. The existence of outer-sphere hydrogen bonding to the fluorido ligands allowed for unprecedented reactivities. Thus, model reactions revealed complexes bearing a pendant fluoride in the coordination sphere while at the same time an alkyne is activated at the platinum centre. Based on this, catalytic hydrofluorination reactions of unactivated alkynes to provide selectively (Z)-fluoroalkenes were developed

Linkage Evidence for a Two-Locus Inheritance of LQT-Associated Seizures in a Multigenerational LQT Family With a Novel KCNQ1 Loss-of-Function Mutation

Mutations in several genes encoding ion channels can cause the long-QT (LQT) syndrome with cardiac arrhythmias, syncope and sudden death. Recently, mutations in some of these genes were also identified to cause epileptic seizures in these patients, and the sudden unexplained death in epilepsy (SUDEP) was considered to be the pathologic overlap between the two clinical conditions. For LQT-associated KCNQ1 mutations, only few investigations reported the coincidence of cardiac dysfunction and epileptic seizures. Clinical, electrophysiological and genetic characterization of a large pedigree (n = 241 family members) with LQT syndrome caused by a 12-base-pair duplication in exon 8 of the KCNQ1 gene duplicating four amino acids in the carboxyterminal KCNQ1 domain (KCNQ1dup12; p.R360_Q361dupQKQR, NM_000218.2, hg19). Electrophysiological recordings revealed no substantial KCNQ1-like currents. The mutation did not exhibit a dominant negative effect on wild-type KCNQ1 channel function. Most likely, the mutant protein was not functionally expressed and thus not incorporated into a heteromeric channel tetramer. Many LQT family members suffered from syncopes or developed sudden death, often after physical activity. Of 26 family members with LQT, seizures were present in 14 (LQTplus seizure trait). Molecular genetic analyses confirmed a causative role of the novel KCNQ1dup12 mutation for the LQT trait and revealed a strong link also with the LQTplus seizure trait. Genome-wide parametric multipoint linkage analyses identified a second strong genetic modifier locus for the LQTplus seizure trait in the chromosomal region 10p14. The linkage results suggest a two-locus inheritance model for the LQTplus seizure trait in which both the KCNQ1dup12 mutation and the 10p14 risk haplotype are necessary for the occurrence of LQT-associated seizures. The data strongly support emerging concepts that KCNQ1 mutations may increase the risk of epilepsy, but additional genetic modifiers are necessary for the clinical manifestation of epileptic seizures

Mathematical Modeling Identifies Inhibitors of Apoptosis as Mediators of Positive Feedback and Bistability

The intrinsic, or mitochondrial, pathway of caspase activation is essential for apoptosis induction by various stimuli including cytotoxic stress. It depends on the cellular context, whether cytochrome c released from mitochondria induces caspase activation gradually or in an all-or-none fashion, and whether caspase activation irreversibly commits cells to apoptosis. By analyzing a quantitative kinetic model, we show that inhibition of caspase-3 (Casp3) and Casp9 by inhibitors of apoptosis (IAPs) results in an implicit positive feedback, since cleaved Casp3 augments its own activation by sequestering IAPs away from Casp9. We demonstrate that this positive feedback brings about bistability (i.e., all-or-none behaviour), and that it cooperates with Casp3-mediated feedback cleavage of Casp9 to generate irreversibility in caspase activation. Our calculations also unravel how cell-specific protein expression brings about the observed qualitative differences in caspase activation (gradual versus all-or-none and reversible versus irreversible). Finally, known regulators of the pathway are shown to efficiently shift the apoptotic threshold stimulus, suggesting that the bistable caspase cascade computes multiple inputs into an all-or-none caspase output. As cellular inhibitory proteins (e.g., IAPs) frequently inhibit consecutive intermediates in cellular signaling cascades (e.g., Casp3 and Casp9), the feedback mechanism described in this paper is likely to be a widespread principle on how cells achieve ultrasensitivity, bistability, and irreversibility