Improving CNV detection from short-read MPS data in neuromuscular disorders

Neuromuscular disorders (NMD) are highly heterogenic with around 1000 reported different subtypes. Most are genetic in origin, and some 500 genes are currently identified to cause NMDs. Massively parallel sequencing (MPS) approaches have been widely used to increase the cost-effectiveness and diagnostic yield in the work-up of the genetic molecular diagnosis and to speed up the process. Copy number variants (CNVs), deletions and duplications larger than 50 base pairs, explain approximately 10% of the Mendelian disorders. No best practices pipelines have been developed yet for CNV analysis from MPS data. Therefore, the detection and verification of CNV findings has often involved complementary methods, such as array comparative genomic hybridization (array CGH), multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) and quantitative PCR approaches. Recently, various CNV detection programs have been developed, but for widely different types of designated research settings, which complicates choosing the correct approach for NMDs. These individual programs have generally exhibited less than ideal sensitivity and specificity for CNV detection. Our aim was to develop a comprehensive pipeline for the detection and annotation of CNVs with high accuracy from targeted gene panel sequencing and whole exome sequencing (WES) data of patients with NMDs. Four different CNV analysis programs were chosen for this study: CoNIFER, XHMM, ExomeDepth and CODEX. The targeted gene panel MYOcap includes 349 genes for myopathic disorders and MNDcap 302 genes for neurogenic disorders in their current panel versions. 2359 samples were sequenced with MYOcap, 942 samples with MNDcap and 262 samples with WES. This included for the targeted gene panels 24 positive control samples with previously characterized CNVs and 31 negative control samples with certain genes verified to not have CNVs. A detection sensitivity of 100% and specificity of 100% were reached for these control samples. Previously undetected CNVs from MYOcap or MNDcap sequenced samples were verified as true positive detections in 36 cases with MLPA, PCR or array CGH, and eight CNVs were verified as false positive detections. These and the positive control samples were utilized in validation of a predictive logistic regression model. In silico CNV generation into MYOcap sequenced samples provided 18,677 specific and 3892 unspecific CNV detections to initially train the model. The model was trained to differentiate true positive detections from false positive detections in order to increase the specificity of the CNV detection pipeline. The advantage of using four different CNV detection programs compared to using them individually, or with any other combination, was demonstrated by CNV detection sensitivity from the set of in silico CNVs. The predictive model with variables from all four programs provided the highest sensitivity (96.6%) and specificity (87.5%) for predicting CNV detections correctly, indicating an accuracy of 95.5% (95% CI 87.3–99.1%). The CNV detection pipeline together with the predictive model was validated for WES samples with control samples with 235 previously characterized CNVs. For CNVs spanning at least three exons, the detection sensitivity was 97.3% and the sensitivity of the predicative model was 99.3% after adjusting the model threshold for WES data. The CNV annotation platform cnvScan was expanded to contain the most recent CNV population databases as well as in-house CNV databases for all the sequenced sample sets. CNV detection results were filtered by < 1% frequency with reciprocal overlap of 90% in the common CNV population databases, with both it and < 5% frequency with 50% reciprocal overlap in the in-house CNV database, and by the true positive prediction with the model. These procedures significantly decreased the workload (with 3–13% of the original CNV detections preserved) in evaluating the CNVs further regarding clinical significance. The added value, i.e. the additional diagnostic yield from CNVs for both the targeted gene panel sequenced samples and WES samples was estimated to be 1.9%. Altogether 39 final genetic diagnoses were solved with these CNV findings. In addition, 18 patient cases had a likely pathogenic finding, and five had a heterozygous CNV likely pathogenic for a recessive disease without association to the patient’s phenotype. The clarified cases included six different DMD deletions or duplications causing dystrophinopathies. In three sequenced familial cases, the detected CNVs in CACNA1A, SGCD and TTN genes co-segregated with the disease. One case had two separate genetic diseases, tibial muscular dystrophy (TMD) and BMD, caused by the founder mutation FINmaj in the gene TTN and a deletion in DMD. Some of the solved cases had novel findings: the second ever reported large intragenic deletion in NEB causing dominant disease, and the first CNV, an intragenic deletion, in TIA1 in a patient diagnosed with Welander distal myopathy (WDM). Some of the genes associated with NMDs are challenging to analyze from short-read sequencing data due to homology or repetitive regions. An additional script was thus written to differentiate copy numbers of the highly homologous genes, SMN1 and SMN2. Two SMN1/SMN2 copy number 0/3 control cases were successfully recognized, and five cases were identified with a possible exon 7 conversion in SMN1 and a compatible spinal muscular atrophy phenotype. The latter findings were considered likely pathogenic and are awaiting further validation on the genomic level. Comparison of CNV detections within the in-house CNV database revealed divergences in the CNV detections within the triplicate repetitive region of NEB with potentially clinically significant changes. One array CGH validated change correlated well with the nemaline rod pathology observed in the patient. CNV analysis utilizing MPS data from targeted gene panels and WES samples provided increased diagnostic yield as reported also in other studies on NMDs. Our multi-algorithm and -platform approach decreased the workload in variant analysis and provided more insight into the many difficult to analyze genomic regions involved in NMDs. In the future, whole genome sequencing and long-read sequencing will likely provide higher resolution for CNV detections and reveal an even wider spectrum of structural genomic variants, together with other emerging comprehensive methods, such as optical mapping.Lihastaudit ovat hyvin heterogeenisiä, ja niistä on kuvattu noin tuhat alatyyppiä. Suurin osa on perinnöllisiä tauteja, ja tähän mennessä on tunnistettu noin 500 eri lihastauteja aiheuttavaa geeniä. Massiivista rinnakkaissekvensointia (MPS) on käytetty laajalti perinnöllisten tautien diagnostisen prosessin nopeuttamiseksi, kustannustehokkuuden parantamiseksi ja lopullisen geeniperäisen diagnoosin saavuttamiseksi. Kopiolukumuutokset, yli 50 emäsparin deleetiot tai duplikaatiot, aiheuttavat arviolta 10 % Mendelin mukaisesti periytyvistä taudeista. Kopiolukumuutosten havaitsemiseen sekvensointidatasta ei ole vielä kehitetty yleisesti hyväksyttyjä ja suositeltuja käytänteitä. Kopiolukumuutosten havaitsemiseksi ja varmistamiseksi käytetäänkin usein täydentäviä menetelmiä, kuten vertaileva genominen hybridisaatio sirulla (aCGH), rinnastettu ligaatio-riippuvainen alukemonistus (MLPA) ja kvantitatiivinen PCR. Kopiolukumuutosten havaitsemiseen sekvensointidatasta on kehitetty useita työkaluja vaihtelevissa tutkimusasetelmissa, mikä hankaloittaa oikean lähestymistavan valitsemista lihastaudeille. Yksittäisten ohjelmien on todettu tuottavan usein epätäsmällisiä ja herkkyydeltään vaihtelevia tai riittämättömiä havaintoja. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää kattava menetelmä kopiolukumuutosten havaitsemiseen ja annotointiin suurella tarkkuudella kohdennetun geenipaneelin ja koko eksomin (WES) sekvensointidatasta lihastautipotilailta. Tutkimukseen valittiin neljä kopiolukumuutosanalyysin työkalua: CoNIFER, XHMM, ExomeDepth ja CODEX. Kohdennetuista geenipaneeleista MYOcap kattaa 349 geeniä lihaspainotteisille taudeille ja MNDcap 302 hermopainotteisille taudeille nykyisissä paneeliversioissa. MYOcap:lla sekvensointiin 2359 näytettä, MNDcap:lla 942 ja WES:llä 262. Kohdennetuilla geenipaneeleilla sekvensointiin 24 positiivista kontrollinäytettä, joissa on aiemmin tunnistettu kopiolukumuutos, ja 31 negatiivista kontrollinäytettä, joissa tietyt geenit oli varmistettu kopiolukumuutoksia sisältämättömiksi. Kontrollinäytteille saavutettiin kehittämällämme menetelmällä 100 % havaitsemisherkkyys ja 100 % tarkkuus. MYOcap:lla tai MNDcap:lla sekvensoiduista näytteistä havaituista kopiolukumuutoksista 36 varmistettiin todellisiksi havainnoiksi MLPA:lla, PCR:lla tai aCGH:llä ja kahdeksan varmistettiin vääriksi positiivisiksi. Nämä ja positiiviset kontrollinäytteet sisällytettiin logistiseen regressioon perustuvan tilastollisen mallin validointiin. Erottelumallin kehitysvaiheessa MYOcap-sekvensoituihin näytteisiin tehtiin in silico kopiolukumuutoksia, mikä tuotti 18677 spesifiä ja 3892 ei-spesifiä kopiolukumuutoshavaintoa mallinnukseen. Malli kehitettiin erottelemaan todelliset kopiolukumuutoshavainnot vääristä positiivista havainnoista havaintomenetelmän tarkkuuden lisäämiseksi. Neljän ohjelman havaintojen käyttämisen paremmuus verrattuna ohjelmien käyttämiseen yksittäin tai muilla yhdistelmillä todennettiin in silico kopiolukumuutosten havaitsemisen herkkyyden tuloksilla. Erottelumalli, jossa oli muuttujia kaikilta neljältä ohjelmalta, saavutti korkeimman herkkyyden (96,6 %), täsmällisyyden (87,5 %) ja tarkkuuden 95,5 % (95 % CI 87,3–99,1 %) kopiolukumuutosten erottelulle. Kopiolukumuutoshavaitsemismenetelmä ja erottelumalli validoitiin WES-kontrollinäytteillä, joissa oli 235 aiemmin tunnistettua kopiolukumuutosta. Havaitsemisherkkyys kopiolukumuutoksille, jotka sisältävät vähintään kolme eksonia oli 97,3 %, ja erottelumallin herkkyys oli 99,3 % kunhan mallin arviointiraja oli uudelleensäädetty WES-datalle. Kopiolukumuutosten annotaatiotyökalu cnvScan laajennettiin sisältämään uusimmat kopiolukumuutospopulaatiotietokannat ja talonsisäinen kopiolukumuutostietokanta kaikista sekvensointinäytejoukoista. Alkuperäiset kopiolukumuutoshavainnot neljältä ohjelmalta suodatettiin 1 % enimmäisyleisyyden ja vastavuoroisen 90 % muutoksen kattamisen vaatimuksella yleisissä kopiolukumuutospopulaatiotietokannoissa, tällä sekä 5 % enimmäisyleisyyden ja vastavuoroisen 50 % muutoksen kattamisen vaatimuksella talonsisäisessä tietokannassa, ja lisäksi erottelumallilla todellisiin havaintoihin. Nämä toimenpiteet vähensivät merkittävästi työmäärää kliinisen merkityksen arvioinnille kopiolukumuutoksille säästäen 3–13 % alkuperäisistä havainnoista. Lisääntyneiden diagnoosien määrä kopiolukumuutoshavaintojen myötä sekä kohdennetuilla geenipaneeleilla että WES-sekvensoiduilla näytteillä oli noin 1,9 %. Kopiolukumuutoshavainnoilla saavutettiin 39 lopullista geneettistä diagnoosia potilaille. Lisäksi 18:lla tutkitulla oli todennäköisesti patogeeninen löydös, ja viidellä tutkitulla havaittiin heterotsygoottinen kopiolukumuutos, jonka arvioitiin olevan patogeeninen peittyvästi periytyvän taudin variantti ilman yhteyttä potilaan taudinkuvaan. Selvitettyihin tapauksiin sisältyi kuusi eri DMD-geenissä olevaa deleetiota tai duplikaatiota, jotka aiheuttivat dystrofinopatioita. Kolme potilasta, joilla oli oireisia perheenjäseniä, sekvensointiin perhetapauksina, ja havaitut kopiolukumuutokset geeneissä CACNA1A, SGCD ja TTN segregoituivat yhdessä taudin kanssa. Yhdellä tutkitulla havaittiin kaksi perinnöllistä tautia, tibiaalinen lihasdystrofia (TMD) ja BMD, joiden aiheuttajina olivat perustajamutaatio FINmaj TTN-geenissä ja deleetio DMD-geenissä. Osalla selvitetyistä tapauksista oli ennen havaitsemattomia löydöksiä: NEB-geenissä toinen koskaan raportoitu iso geeninsisäinen deleetio, joka aiheuttaa vallitsevasti periytyvän taudin, sekä TIA1-geenin geeninsisäinen deleetio, joka on ensimmäinen havaittu kopiolukumuutos TIA1:ssä Welanderin distaalimyopatiaa (WDM) sairastavalla potilaalla. Jotkin geeneistä, jotka on liitetty lihastauteihin, ovat haastavia analysoitavia lyhytlukuisesta sekvensointidatasta homologian ja toistojaksojen takia. Hyvin homologisille geeneille SMN1 ja SMN2 kehitettiin erillinen ohjelma erottelemaan geenien kopiolukumäärät. Kaksi kontrollitapausta tunnistettiin onnistuneesti SMN1 ja SMN2 kopiolukumäärillä 0 ja 3, ja lisäksi tunnistettiin viisi tapausta, joilla on mahdollisesti eksonin 7 konversio SMN1:ssä ja yhteensopiva spinaalinen lihasatrofia. Jälkimmäiset löydökset luokiteltiin todennäköisesti patogeeniseksi, ja ne odottavat genomista lisävarmistusta. Kopiolukumuutoshavaintojen vertailu NEB-geenin triplikaattitoistoalueella talonsisäisessä tietokannassa paljasti eroavaisuuksia, joilla on potentiaalisesti kliinisesti merkitystä. Yksi aCGH:llä varmistettu muutos korreloi selkeästi nemaliinisauvakappalepatologian kanssa, joka potilaalla oli havaittu. Kopiolukumuutoshavainnointi käyttäen sekvensointidataa kohdennetusta geenipaneelista tai WES-näytteistä lisäsi diagnoosien määrää kuten aiemmissa vastaavissa tutkimuksissa lihastaudeille. Käyttämämme usean algoritmin ja alustan lähestymistapa vähensi varianttianalyysin työmäärää ja tarjosi lisää tietoa useista hankalasti analysoitavista genomisista alueista, jotka on liitetty lihastauteihin. Tulevaisuudessa koko genomin sekvensointi ja pitkälukuinen sekvensointi tarjonnevat paremman resoluution kopiolukumuutoksille ja paljastavat enemmän rakenteellisia genomin muutoksia yhdessä muiden kehitteillä olevien kattavien menetelmien kanssa, kuten optinen kartoitus

Is Gene-Size an Issue for the Diagnosis of Skeletal Muscle Disorders?

Human genes have a variable length. Those having a coding sequence of extraordinary length and a high number of exons were almost impossible to sequence using the traditional Sanger-based gene-by-gene approach. High-throughput sequencing has partly overcome the size-related technical issues, enabling a straightforward, rapid and relatively inexpensive analysis of large genes. Several large genes (e.g. TTN, NEB, RYR1, DMD) are recognized as disease-causing in patients with skeletal muscle diseases. However, because of their sheer size, the clinical interpretation of variants in these genes is probably the most challenging aspect of the high-throughput genetic investigation in the field of skeletal muscle diseases. The main aim of this review is to discuss the technical and interpretative issues related to the diagnostic investigation of large genes and to reflect upon the current state of the art and the future advancements in the field. © 2020 - IOS Press and the authors. All rights reserved.Peer reviewe

Congenital asymmetric distal myopathy with hemifacial weakness caused by a heterozygous large de novo mosaic deletion in nebulin

We report the first mosaic mutation, a deletion of exons 11-107, identified in the nebulin gene in a Finnish patient presenting with a predominantly distal congenital myopathy and asymmetric muscle weakness. The female patient is ambulant and currently 26 years old. Muscle biopsies showed myopathic features with type 1 fibre predominance, strikingly hypotrophic type 2 fibres and central nuclei, but no nemaline bodies. The deletion was detected in a copy number variation analysis based on next-generation sequencing data. The parents of the patient did not carry the deletion. Mosaicism was detected using a custom, targeted comparative genomic hybridisation array. Expression of the truncated allele, less than half the size of full-length nebulin, was confirmed by Western blotting. The clinical and histological picture resembled that of a family with a slightly smaller deletion, and that in patients with recessively inherited distal forms of nebulin-caused myopathy. Asymmetry, however, was a novel feature. (c) 2021 Elsevier B.V. All rights reserved.Peer reviewe

Copy number variation analysis increases the diagnostic yield in muscle diseases

Objective: Copy number variants (CNVs) were analyzed from next-generation sequencing data, with the aim of improving diagnostic yield in skeletal muscle disorder cases.& para;& para;Methods: Four publicly available bioinformatic analytic tools were used to analyze CNVs from sequencing data from patients with muscle diseases. The patients were previously analyzed with a targeted gene panel for single nucleotide variants and small insertions and deletions, without achieving final diagnosis. Variants detected by multiple CNV analysis tools were verified with either array comparative genomic hybridization or PCR. The clinical significance of the verified CNVs was interpreted, considering previously identified variants, segregation studies, and clinical information of the patient cases.& para;& para;Results: Combining analysis of all different mutation types enabled integration of results and identified the final cause of the disease in 9 myopathy cases. Complex effects like compound heterozygosity of different mutation types and compound disease arising from variants of different genes were unraveled. We identified the first large intragenic deletion of the titin (TTN) gene implicated in the pathogenesis of a severe form of myopathy. Our work also revealed a "double-trouble" effect in a patient carrying a single heterozygous insertion/deletion mutation in the TTN gene and a Becker muscular dystrophy causing deletion in the dystrophin gene.& para;& para;Conclusions: Causative CNVs were identified proving that analysis of CNVs is essential for increasing the diagnostic yield in muscle diseases. Complex severe muscular dystrophy phenotypes can be the result of different mutation types but also of the compound effect of 2 different genetic diseases.Peer reviewe

Recessive PYROXD1 mutations cause adult-onset limb-girdle-type muscular dystrophy

Peer reviewe

Recessive PYROXD1 mutations cause adult-onset limb-girdle-type muscular dystrophy

Objective: To describe adult-onset limb-girdle-type muscular dystrophy caused by biallelic variants in the PYROXD1 gene, which has been recently linked to early-onset congenital myofibrillar myopathy.Methods: Whole exome sequencing was performed for adult-onset neuromuscular disease patients with no molecular diagnosis. Patients with PYROXD1 variants underwent clinical characterization, lower limb muscle MRI, muscle biopsy and spirometry. A yeast complementation assay was used to determine the biochemical consequences of the genetic variants.Results: We identified four patients with biallelic PYROXD1 variants. Three patients, who had symptom onset in their 20s or 30s, were homozygous for the previously described p.Asn155Ser. The fourth patient, with symptom onset at age 49, was compound heterozygous for p.Asn155Ser variant and previously unknown p.Tyr354Cys. All patients presented with a LGMD-type phenotype of symmetric muscle weakness and wasting. Symptoms started in proximal muscles of the lower limbs, and progressed slowly to involve also upper limbs in a proximal-predominant fashion. All patients remained ambulant past the age of 60. They had restrictive lung disease but no cardiac impairment. Muscle MRI showed strong involvement of anterolateral thigh muscles. Muscle biopsy displayed chronic myopathic changes. Yeast complementation assay demonstrated the p.Tyr354Cys mutation to impair PYROXD1 oxidoreductase ability.Conclusion: PYROXD1 variants can cause an adult-onset slowly progressive LGMD-type phenotype.</p

An unusual ryanodine receptor 1 (RYR1) phenotype Mild calf-predominant myopathy

Objective To identify the genetic defect causing a distal calf myopathy with cores. Methods Families with a genetically undetermined calf-predominant myopathy underwent detailed clinical evaluation, including EMG/nerve conduction studies, muscle biopsy, laboratory investigations, and muscle MRI. Next-generation sequencing and targeted Sanger sequencing were used to identify the causative genetic defect in each family. Results A novel deletion-insertion mutation in ryanodine receptor 1 (RYR1) was found in the proband of the index family and segregated with the disease in 6 affected relatives. Subsequently, we found 2 more families with a similar calf-predominant myopathy segregating with unique RYR1-mutated alleles. All patients showed a very slowly progressive myopathy without episodes of malignant hyperthermia or rhabdomyolysis. Muscle biopsy showed cores or core-like changes in all families. Conclusions Our findings expand the spectrum of RYR1-related disorders to include a calf-predominant myopathy with core pathology and autosomal dominant inheritance. Two families had unique and previously unreported RYR1 mutations, while affected persons in the third family carried 2 previously known mutations in the same dominant allele.Peer reviewe