Rôle de l'oxydase alternative et des radicaux libres dans le contrôle de la longevité chez Podospora anserina

L'inactivation du complexe IV de la chaîne respiratoire mitochondriale accroît considérablement la longévité de P. anserina, réduit nettement le niveau énergétique et le taux de radicaux libres (mutant respiratoire cox5::ble). Cette augmentation de longévité pourrait avoir diverses origines, et notamment un faible taux de radicaux libres diminué grâce à l'utilisation exclusive de l'oxydase alternative (AOX) et à ses propriétés antioxydantes éventuelles.La première approche de ma thèse consistait à évaluer les propriétés antioxydantes de l'AOX et son implication dans le contrôle de la longévité. J ai ainsi montré que l AOX n'a pas de rôle antioxydant dans nos conditions standard de culture, et qu elle n'est pas un déterminant de la longévité. Par contre, la surexpression de l AOX chez le mutant cox5::ble conduit à une amélioration notable du bilan énergétique associée à une restauration systématique de la sénescence et une augmentation du niveau de radicaux libres, ce qui met en évidence le rôle majeur du métabolisme énergétique dans le contrôle de la longévité.La seconde approche de ma thèse consistait à caractériser de nouveaux acteurs impliqués dans le contrôle de la longévité, par la caractérisation de suppresseurs de la très grande longévité de mutants respiratoires. Le gène suppresseur rse2 améliore le bilan énergétique, augmente la production de radicaux libres et restaure concomitamment la sénescence. Ce gène semble impliqué dans la régulation de l'expression de l'AOX, mais les études menées jusqu'à présent semblent exclure que ce suppresseur soit une mutation du gène aox. Afin de caractériser plus précisément le suppresseur rse2, son clonage a été entrepris.Inactivation of complex IV of the mitochondrial respiratory chain considerably extends lifespan of P. anserina, markedly decreases energy and ROS levels (respiratory mutant cox5::ble). This lifespan extension could result from various modifications, and notably from a low level of ROS decreased thanks to the exclusive use of the alternative oxidase (AOX) and its hypothetical antioxidant properties.The first approach of my thesis was to evaluate antioxidant properties of AOX and its hypothetical role in the control of longevity. I have shown that AOX has no antioxidant properties in stantard conditions, and that it is not a longevity determinant. Overexpression of AOX in the cox5::ble mutant leads to an improvement of the energy level associated with a systematic restoration of senescence and an increase of ROS level, what points out a major role of energetic metabolism in the control of longevity.The second approach of my thesis was to characterize new actors of the control of longevity by the characterization of suppressors of the long-lived respiratory mutants. The rse2 suppressor gene improves energy level, increases ROS production and at the same time restores senescence. This gene seems to be implicated in the regulation of AOX expression, but studies done so far seem to exclude that this suppressor could be a mutation of the aox gene. In order to characterize more precisely the rse2 suppressor, its cloning has been undertaken.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Caractérisation de deux acteurs d'une voie de régulation rétrograde induite par un stress mitochondrial chez Podospora anserina

Le champignon filamenteux Podospora anserina constitue un système modèle pour l étude de plusieurs processus biologiques, notamment le vieillissement. Une relation de causalité entre le fonctionnement de la chaine respiratoire et la longévité a été établie pour la première fois chez P. anserina et cette relation de causalité semble conservée. Le lien entre fonctionnement de la chaîne respiratoire et longévité pourrait se faire en partie par l induction d une régulation rétrograde en réponse à un dysfonctionnement mitochondrial. Les études des régulations rétrogrades mitochondriales et chloroplastiques montrent qu en réponse à un dysfonctionnement de ces organites, il y a une reprogrammation de l expression génique qui participe à la plasticité adaptative des espèces en réponse à l environnement. Un gène cible d une régulation rétrograde mitochondriale a été identifié chez P. anserina: le gène aox. L oxydase alternative appartient à une voie respiratoire alternative en conditions de dysfonctionnement de la voie des cytochromes. Deux facteurs de transcription acteurs de cette régulation rétrograde mitochondriale ont été identifiés par une approche génétique. Ces protéines, RSE2 et RSE3, appartiennent à la famille des protéines Zn2Cys6 et sont les régulateurs majeurs du gène aox. Outre le gène aox, ces deux facteurs de transcription corégulent les deux enzymes de la néoglucogenèse FBP (Fructose-1,6-biphosphatase) et PCK (Phosphoénolpyruvate carboxykinase). Des allèles gain de fonction des gènes rse2 et rse3 ont été isolés et le crible pratiquement saturé. L analyse de ces mutations ainsi que des approches de mutagenèse dirigée, ont permis de proposer l existence de régions régulatrices dans les séquences protéiques RSE2 et RSE3. Une approche transcriptomique a permis d identifier de nouvelles cibles de RSE2 et RSE3 activées lors d un dysfonctionnement mitochondrial : le gène fhb (codant une flavohémoglobine) et le gène Pa_6_4030 (codant une a/b hydrolase). Une approche métabolomique a permis une meilleure compréhension de la reprogrammation métabolique en réponse à un dysfonctionnement de la chaîne respiratoire et du rôle de RSE2/RSE3 dans cette reprogrammation.RSE2 et RSE3 sont donc des acteurs d une régulation rétrograde mitochondriale responsables de l activation de voies respiratoires alternatives mais aussi d une reprogrammation du métabolisme de P. anserina qui permettrait de maintenir une homéostasie cellulaire en condition de dysfonctionnement mitochondrial.The filamentous fungus Podospora anserina is a model system for the study of many biological processes, including aging. A causal relationship between the respiratory chain efficiency and longevity has been established for the first time in P. anserina. This causal relationship seems to be conserved between species. The link between the respiratory chain efficiency and longevity could be in part explained by the induction of retrograde regulation in response to mitochondrial dysfunction. Studies of mitochondrial and chloroplast retrograde regulation show that in response to a dysfunction of these organelles, there is a reprogramming of gene expression involved in the adaptive plasticity of organisms in response to the environment.A target gene of mitochondrial retrograde regulation was identified in P. anserina: the aox gene. The alternative oxidase belongs to the respiratory alternative pathway induced when the mitochondrial electron transport chain is impaired. Two transcription factors involved in mitochondrial retrograde regulation were identified by a genetic approach. These proteins, RSE2 and RSE3 belong to the family of Zn2Cys6 proteins and are major regulators of aox. Besides the aox gene, these two transcription factors are responsible for the coregulation of two gluconeogenic enzymes: FBP (fructose-1,6-bisphosphatase) and PCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase). By a genetic approach, several gain-of-function mutations were isolated in RSE2 and RSE3 and our screen was likely to be saturated. Analysis of these mutations, together with other mutagenesis approaches allowed us to propose the existence of regulatory regions in RSE2 and RSE3 sequences.Microarray transcriptional profiling was conducted on rse2 and rse3 gain of function mutants. This identified new targets of RSE2 and RSE3 activated during mitochondrial dysfunction: FHB (a gene encoding a flavohemoglobin) and Pa_6_4030 (a gene encoding an a / b hydrolase). A metabolomic approach was also used and it gave new insight to the metabolic reprogramming in response to a malfunction of the respiratory chain and the role of RSE2/RSE3 in this reprogramming.Thus we showed that RSE2 and RSE3 play a role in mitochondrial retrograde regulation that is responsible for the activation of the respiratory alternative pathway, and also for the activation of metabolic reprogramming of P. anserina that would maintain cellular homeostasis under conditions of mitochondrial dysfunction.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Effets de mutations de la translocase ATP/ADP mitochondriale sur la stabilité de l'ADN mitochondrial et la longévité chez le champignon filamenteux Podospora anserina

Chez l homme, plusieurs mutations dans le gène hANTI codant le transporteur ATP/ADP mitochondrial sont associées à des cas d ophtalmoplégie progressive autosomale dominante (adPEO) caractérisés par l accumulation de délétions de l ADN mitochondrial (ADNmt). Le mécanisme responsable de cette instabilité est encore obscur. Deux hypothèses sont proposées, l une stipule que l effet primaire des mutations est de découpler le membrane interne mitochondriale, ce qui secondairement entraîne une déstabilisation de l ANDmt, l autre propose que l effet primaire des mutations est perturber le pool de nucléotides adényliniques , ce qui entraine la déstabilisation de l ADNmt. En utilisant le modèle Podospora anserina, j ai montré que les mutations humaines A114P, L98P et V289M introduites dans le gène homologue PaAnt sont responsables de défauts de croissance, d une diminutions de la production de radicaux libres (ROS), d une chute du potentiel du membrane ( ) et de l accumulation de larges délétions de l ADNmt entraînant une mort prématurée. J ai également montré que l instabilité de l ADNmt des mutations M106P et A121P ne peut s expliquer uniquement par une chute du ni par une augmentation du ROS comme il est généralement proposé puisque cette instabilité est supprimée sans restauration du et des ROS en présence d un allèle du gène rmp1 impliqué dans le cross-talk mitochondrie-noyau et d un allèle du gène AS1 codant une sous unité du ribosome cytosolique. L instabilité de l ADNmt associée à la mutation S296M n est supprimée par aucun des 2 allèles. Ces résultats illustrent le rôle central du fond génétique dans le développement des ces pathologies.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Suppression of Mitochondrial DNA Instability of Autosomal Dominant Forms of Progressive External Ophthalmoplegia-Associated ANT1 Mutations in Podospora anserina

Maintenance and expression of mitochondrial DNA (mtDNA) are essential for the cell and the organism. In humans, several mutations in the adenine nucleotide translocase gene ANT1 are associated with multiple mtDNA deletions and autosomal dominant forms of progressive external ophthalmoplegia (adPEO). The mechanisms underlying the mtDNA instability are still obscure. A current hypothesis proposes that these pathogenic mutations primarily uncouple the mitochondrial inner membrane, which secondarily causes mtDNA instability. Here we show that the three adPEO-associated mutations equivalent to A114P, L98P, and V289M introduced into the Podospora anserina ANT1 ortholog dominantly cause severe growth defects, decreased reactive oxygen species production (ROS), decreased mitochondrial inner membrane potential (Δψ), and accumulation of large-scale mtDNA deletions leading to premature death. Interestingly, we show that, at least for the adPEO-type M106P and A121P mutant alleles, the associated mtDNA instability cannot be attributed only to a reduced membrane potential or to an increased ROS level since it can be suppressed without restoration of the Δψ or modification of the ROS production. Suppression of mtDNA instability due to the M106P and A121P mutations was obtained by an allele of the rmp1 gene involved in nucleo-mitochondrial cross- talk and also by an allele of the AS1 gene encoding a cytosolic ribosomal protein. In contrast, the mtDNA instability caused by the S296M mutation was not suppressed by these alleles

Mitochondrial metabolism and aging in the filamentous fungus Podospora anserina.

The filamentous fungus Podospora anserina has a limited lifespan. In this organism, aging is systematically associated to mitochondrial DNA instability. We recently provided evidence that the respiratory function is a key determinant of its lifespan. Loss of function of the cytochrome pathway leads to the compensatory induction of an alternative oxidase, to a decreased production of reactive oxygen species and to a striking increase in lifespan. These changes are associated to the stabilization of the mitochondrial DNA. Here we review and discuss the links between these different parameters and their implication in the control of lifespan. Since we demonstrated the central role of mitochondrial metabolism in aging, the same relationship has been evidenced in several model systems from yeast to mice, confirming the usefulness of simple organisms as P. anserina for studying lifespan regulation

Mutations in the Phosphatase Domain of the 6-phosphofructo-2-kinase/fructose 2,6-bisphosphatase Result in the Transcriptional Activation of the Alternative Oxidase and Gluconeogenic Pathways in Podospora anserina

International audienceBy screening suppressors of a respiratory mutant lacking a functional cytochrome pathway in the filamentous fungus Podospora anserina, we isolated a mutation located in the phosphatase domain of the bi-functional enzyme 6-phosphofructo-2-kinase/fructose 2,6-bisphosphatase (PFK-2/FBPase-2). We show that the inactivation of the phosphatase but not of the kinase domain is responsible for the suppressor effect that results from the activation of the RSEs transcription factors that control expression of AOX, an alternative oxidase able to bypass the mitochondria cytochrome pathway of respiration. Remarkably, activation of the RSEs also stimulates the expression of the gluconeogenic enzymes, fructose-1,6 bi-phosphatase (FBPase-1) and phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK-1). We thus reveal in P. anserina an apparently paradoxical situation where the inactivation of the phosphatase domain of PFK-2/FBPase-2, supposed to stimulate glycolysis, is correlated with the transcriptional induction of the gluconeogenic enzymes. Phylogenic analysis revealed the presence of multiple presumed PFK-2/FBPase-2 isoforms in all the species of tested Ascomycetes

Deletion of the MED13 and CDK8 subunits of the Mediator improves the phenotype of a long-lived respiratory deficient mutant of Podospora anserina.

International audienceIn Podospora anserina, the loss of function of the cytochrome segment of the mitochondrial respiratory chain is viable. This is due to the presence in this organism, as in most filamentous fungi, of an alternative respiratory oxidase (AOX) that provides a bypass to the cytochrome pathway. However mutants lacking a functional cytochrome pathway present multiple phenotypes including poorly colored thin mycelium and slow growth. In a large genetic screen based on the improvement of these phenotypes, we isolated a large number of independent suppressor mutations. Most of them led to the constitutive overexpression of the aox gene. In this study, we characterize a new suppressor mutation that does not affect the production of AOX. It is a loss-of-function mutation in the gene encoding the MED13 subunit of the kinase module of the Mediator complex. Inactivation of the cdk8 gene encoding another subunit of the same module also results in partial suppression of a cytochrome-deficient mutant. Analysis of strains lacking the MED13 or CDK8 subunits points to the importance of these subunits as regulators involved in diverse physiological processes such as growth, longevity and sexual development. Interestingly, transcriptional analyses indicate that in P. anserina, loss of the respiratory cytochrome pathway results in the up-regulation of glycolysis-related genes revealing a new type of retrograde regulation. The loss of MED13 augments the up-regulation of some of these genes