The use of selected commercial molecular assays for the microbiological diagnosis of tuberculosis

Introduction: We performed a retrospective assessment of the AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis (MTB) assay for the molecular diagnosis of tuberculosis based on our own determinations between 1999 and 2009 and a preliminary assessment of the Xpert MTB/RIF system, which we are currently using. Materials and methods: The study groups comprised 1875 samples (including 104 inhibited samples) and 213 samples, respectively. Results: The sensitivities of the AMPLICOR MTB and the Xpert MTB/RIF assays were 81.9% and 81.8%, respectively, and their specificities were 97.2% and 99.5%, respectively, versus culture on Loewenstein-Jensen medium. Both assays showed a considerable difference in sensitivity depending on whether the test samples were smear-positive (AFB+) or smearnegative (AFB–). The sensitivities of the AMPLICOR MTB and the Xpert MTB/RIF assays were 97.8% and 100.0%, respectively, for AFB+ samples and 58.1% and 50.0%, respectively, for AFB– samples. Conclusions: Our results confirm full usefulness of the Xpert MTB/RIF assay for routine diagnosis in the case of smearpositive clinical samples.Wstęp: W pracy, retrospektywnie oceniono test AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis (MTB) w molekularnej diagnostyce gruźlicy, na podstawie własnych oznaczeń w latach 1999–2009 oraz wstępnie oceniono system Xpert MTB/RIF, który jest na bieżąco w użyciu. Materiał i metody: Grupy badane obejmowały odpowiednio 1875 próbek (w tym 104 reakcje zahamowane) i 213 próbek. Wyniki: Czułość testów AMPLICOR MTB i Xpert MTB/RIF oceniono na 81,9% i 81,8%, a swoistość wynosiła odpowiednio 97,2% i 99,5%, wobec hodowli na pożywce Loewensteina-Jensena. Obydwa testy wykazywały znaczącą różnicę w czułości, w zależności od tego czy badane próbki były dodatnie (AFB+) czy ujemne (AFB–) w rozmazie. I tak dla próbek AFB+ czułość wynosiła 97,8% i 100%, a dla próbek AFB– czułość była 58,1% i 50%, odpowiednio dla testów AMPLICOR MTB i Xpert MTB/RIF. Wnioski: Przedstawione wyniki wykazują pełną przydatność testu Xpert MTB/RIF w rutynowej diagnostyce dla próbek klinicznych, dodatnich w mikroskopowym badaniu rozmazu. Pneumonol. Alergol. Pol. 2012; 80, 1: 6–1

Diagnostic utility of the molecular assay GenoType MTBC (HAIN Lifesciences, Germany) for identification of tuberculous mycobacteria

Wstęp: Nowy kompleksowy system GenoType firmy HAIN Lifescience (Niemcy) stwarza szerokie możliwości w diagnostyce gruźlicy i innych zakażeń prątkowych na poziomie molekularnym. Dzięki wprowadzeniu 5 wzajemnie uzupełniających się testów, system ten pozwala na wykrycie i typowanie mykobakterii oraz określenie lekowrażliwości na rifampicynę i izoniazyd na różnych etapach postępowania diagnostycznego, od badania materiałów bezpośrednich do wyizolowanych szczepów. Zaletą systemu jest dowolność w wyborze stosowanych testów (bez konieczności wykonywania wszystkich), w zależności od potrzeb i aktualnie stosowanych innych metod wykrywania prątków. System posiada certyfikat Unii Europejskiej do stosowania w rutynowej diagnostyce. Dotychczas żaden z testów systemu GenoType nie był stosowany w Polsce. Celem prezentowanej pracy była ocena precyzji typowania testem GenoType MTBC izolatów klinicznych zidentyfikowanych uprzednio jako M. tuberculosis complex metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej w ramach rutynowego postępowania diagnostycznego. Materiał i metody: Badanie miało charakter retrospektywny. Testem GenoType MTBC zbadano 161 izolatów klinicznych M. tuberculosis complex. Szczepy pochodziły od chorych na gruźlicę hospitalizowanych w Centralnym Szpitalu Klinicznym Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w latach 1999-2007. Wyniki: Typowanie testem GenoType MTBC okazało się w 100% zgodne z typowaniem metodą analizy kwasów mykolowych. Test GenoType MTBC wykazał ponadto, że wszystkie izolaty miały wzór hybrydyzacji charakterystyczny dla M. tuberculosis/M. canettii. Wnioski: 1. Test GenoType MTBC (HAIN Lifescience, Niemcy) prawidłowo rozpoznaje kliniczne szczepy M. tuberculosis complex i może w tym zakresie zastąpić wysokociśnieniową chromatografię cieczową w rutynowej diagnostyce gruźlicy. 2. W świetle pozytywnej oceny testu GenoType MTBC celowe wydaje się rozpatrzenie możliwości stosowania pozostałych testów systemu GenoType (HAIN Lifescience, Niemcy) w diagnostyce zakażeń prątkowych.Introduction: The GenoType system (HAIN Lifescience, Germany) offers new perspectives of detecting the tuberculous and non-tuberculous mycobacteria at the molecular level. The system compromises five independent tests that could be performed either on direct specimens or isolated strains, to identify the strains and test the resistance against rifampin and isoniazid. Up to now, non GenoType test was applied in Poland. The aim of the study was an evaluation the accuracy of GenoType MTBC test in speciation of the clinical isolates, previously classified as M. tuberculosis complex by HPLC analyze of mycolic acids. Material and methods: 161 clinical isolates, derived from the TB patients hospitalized in the Warsaw Medical University Hospital between 1999 and 2007 were assayed. Results: On the basis of the hybridization patterns, all 161 studied strains were identified as M. tuberculosis/M. canettii. Conclusions: 1. The GenoType MTBC test (HAIN Lifescience, Germany) precisely recognizes M. tuberculosis complex. The 100% accordance in speciation of M. tuberculosis by the GenoType MTBC test as compared to HPLC method was demonstrated. The GenoType MTBC test can replace HPLC in detection of tuberculous mycobacteria in clinical isolates. 2. As the GenoType MTBC test performs well, the other tests of GenoType system may be considered to be verified in diagnostic procedure of mycobacterial infection

Detecting Mycobacterium tuberculosis complex DNA, based on post-mortem examination of hilar lymph nodes with real-time PCR: initial study

 INTRODUCTION: According to the WHO, almost a third of the world population are thought to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Some studies of the prevalence of latent tuberculosis infection (LTBI) have already been performed in Poland, showing that almost a quarter of the Mazovia population could be infected. It also indicated a higher prevalence of LTBI among seniors. Those studies were based on indirect diagnostic methods.MATERIAL AND METHODS: We randomly collected hilar lymph nodes from decedents aged 40 years and older during post-mortem examination. We excluded patients with previous confirmed tuberculosis. In addition, an autopsy was performed in all patients. Finally, we used real-time PCR Xpert MTB/RIF (Cepheid, USA) for the specific capture of mycobacterial DNA.RESULTS: Twenty-two of 23 patients had a negative result of the real-time PCR examination and no signs of caseous necrosis in hilar lymph nodes. We found the only positive sample in a patient with histopathological signs of tuberculosis (the presence of caseous necrosis in the specimens obtained from lymph nodes and lung). Due to the change of cartridges from version G3 to G4, further reactions were inhibited and no more post-mortem samples were tested.CONCLUSIONS: Real-time PCR Xpert MTB/RIF was capable of detecting M. tuberculosis complex DNA in a patient with tuberculosis recognised on autopsy. In the remaining patients, no M. tuberculosis complex DNA was found, in accordance with negative results of histological examination. Since the technology of cartridges has changed, it is no longer possible to use real-time PCR Xpert MTB/RIF (Cepheid USA) on post-mortem material. Wstęp: Zgodnie z danymi Światowej Organizacji Zdrowia, uważa się, że prawie 1/3 światowej populacji jest zakażona prątkiem gruźlicy. Wyniki badań prowadzonych przy użyciu pośrednich metod diagnostycznych nad rozpowszechnieniem utajonego zakażenia prątkiem gruźlicy w Polsce wykazały, że nawet 1/4 populacji Mazowsza może być zakażona, z przewagą u osób starszych.Materiał i metody: Podczas badania post-mortem pobierano w sposób losowy węzły chłonne wnękowe od zmarłych w wieku 40 lat i powyżej. Na podstawie danych z historii chorób wykluczono pacjentów leczonych z powodu gruźlicy w przeszłości. U wszystkich chorych przeprowadzono badanie sekcyjne. Następnie wykonywano badanie real-time PCR, Xpert MTB/RIF, Cepheid, USA w celu wykrycia DNA Mycobacterium tuberculosis complex.Wyniki: U 22 z 23 pacjentów wynik reakcji real-time PCR był negatywny, a w preparatach węzłów chłonnych nie stwierdzono ziarniny serowaciejącej. W jednym przypadku badanie real-time PCR było dodatnie. Dotyczyło to chorego, u którego stwierdzono obecność ziarniny serowaciejącej zarówno w preparatach z węzłów chłonnych, jak i pobranych z nacieku płucnego. Po zmianie kartridży z wersji G3 na G4 w real-time PCR, Xpert MTB/RIF kolejne reakcje były zahamowane i nie testowano większej liczby próbek.Wnioski: Badanie metodą real-time PCR, Xpert MTB/RIF wykazało obecność M. tuberculosis complex DNA u chorego z pośmiertnie stwierdzoną gruźlicą płuc i ww. chłonnych. U pozostałych chorych nie wykryto obecności DNA M. tuberculosis complex w tkankach, co pozostawało w zgodzie z negatywnym wynikiem badania histologicznego. Po zmianie technologii badania real-time PCR, Xpert MTB/RIF zawodzi przy badaniu próbek z materiału uzyskanego pośmiertnie

The comparison between two methods for typing of nontuberculous mycobacteria: high pressure liquid chromatography and molecular assay GenoType Mycobacterium CM/AS

Wstęp: W pracy oceniano przydatność diagnostyczną molekularnego systemu GenoType Mycobacterium CM/AS (HAIN Lifescience, Niemcy) w różnicowaniu izolatów klinicznych mykobakterii w porównaniu z analizą kwasów mykolowych z zastosowaniem cieczowej chromatografii wysokociśnieniowej. Zastosowanie obydwu testów umożliwia wyróżnienie 38 wzorów molekularnych, z których 24 można przypisać do poszczególnych gatunków mykobakterii, 10 wzorów odpowiada mykobaktedwóm, czasem kilku gatunkom, a 4 wzory odpowiadają Mycobacterium sp. lub Gram-dodatnim bakteriom z dużą zawartością par G-C w genomie. Materiał i metody: Badanie miało charakter retrospektywny i obejmowało 127 szczepów mykobakterii wyizolowanych na podłożu stałym Loewensteina-Jensena od pacjentów szpitala klinicznego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w latach 1999-2007. Prątki identyfikowano metodą analizy kwasów mykolowych cieczową chromatografią wysokociśnieniową (HPLC) w ramach rutynowego postępowania diagnostycznego. Szczepy typowano powtórnie testami molekularnymi, najpierw GenoType Mycobacterium CM, a następnie - jeśli uzyskanego wzoru molekularnego nie można było przypisać do żadnego z wzorców - testem GenoType Mycobacterium AS. Wyniki: Spośród 127 badanych szczepów porównanie obu technik było możliwe dla 113 izolatów. Dla 105 ze 113 (93%) szczepów uzyskano wyniki zgodne. Należy podkreślić, że spośród 8 izolatów rozbieżnie typowanych w jednym przypadku w systemie GenoType Mycobacterium CM/AS stwierdzono obecność genomu M. tuberculosis complex. Szczep ten w typowaniu HPLC określono jako szybkorosnący gatunek M. abscessus/M. chelonae. Spośród pozostałych 14 ze 127 izolatów klinicznych 11 wytypowano tylko jedną z metod: 6 szczepów - techniką HPLC i 5 szczepów - w systemie molekularnym. W przypadku 3 szczepów identyfikacja nie powiodła się żadną z metod. Wnioski: System GenoType Mycobacterium CM/AS pozwala na szybką i rzetelną identyfikację gatunkową izolatów klinicznych mykobakterii. W porównaniu z obecnie stosowaną metodą HPLC system molekularny jest przyjazny dla środowiska i prostszy w wykonaniu. Pneumonol. Alergol. Pol. 2010; 78, 5: 363-368Introduction: The GenoType Mycobacterium CM and the GenoType Mycobacterium AS (HAIN Lifescience, Germany) were evaluated for the ability to differentiate mycobacterial species of clinical isolates. Serial use of the both assays is aimed to identify 38 different molecular patterns, of which 24 patterns can be assigned to single species, 10 patterns are allocated to two or more Mycobacterium species, and 4 patterns correspond to Mycobacterium species and gram-positive bacteria with a high G + C content. The analysis of mycolic acids by high pressure liquid chromatography (HPLC) was the reference method. Material and methods: A set of 127 nontuberculous mycobacterial isolates on Loewenstein-Jensen slants, derived from different patients between 1999 and 2007, was analyzed. The strains were primary classified by HPLC following the diagnostic procedure, and retyped by GenoType Mycobacterium CM/AS. Results: In total, results obtained by both methods were interpretable for 113 strains. Concordant results were obtained for 105 (93%) mycobacterial strains. One out of 8 inconcordant classified strains, which was classified a

Diagnosis of tuberculous lymphadenitis based on the fineneedleaspirationsamplesanalysis

Tuberculous lymphadenitis is one of the most common extrapulmonary manifestations of tuberculosis. The most common lymph nodes involved are in the cervical region. Lymphadenitis due to M. tuberculosis generally presents with enlarging neck lymph nodes over weeks or months associated with fever, weight loss and fatigue. Fine needle aspiration (FNA) of affected lymph nodes has been shown to yield a high sensitivity and specificityinthe diagnosis of tuberculous lymphadenitis. Specimens should be examined cytologically, as well as by AFB smear and cultures. The time between the onset of symptoms, clinical presentation and final diagnosis is often too long.We present a case of 60 years old man with tuberculous lymphadenitis, initially suspected of lymphoproliferative disease

Adenosine deaminase activity in tuberculous and malignant pleural effusions

Measurement of pleural adenosine deaminase activity (ADA) is a useful diagnostic tool for tuberculous pleurisy, but false-positive findings from non-tuberculous effusions have been reported. In order to improve diagnostic value of ADA it is recommended to estimate activity of both ADA1 and ADA2 izoenzymes or 2'-deoxyadenosine/adenosine activity ratio. In order to evaluate ADA as a diagnostic parameter total ADA, with adenosine as a substrate, and 2'-deoxyadenosine/adenosine activity ratio were measured in tuberculous and malignant pleural effusions. Altogether, 26 pleural exudates (11 tuberculous and 15 malignant) were selected. ADA either with adenosine or 2'-deoxyadenosine was determined by colorimetric method of Giusti. Each pleural fluid sample was diluted prior to the assay(1:8)to avoid enzyme inhibition which was observed in nondiluted pleural effusions. The ADA level reached the diagnostic cut-off set for tuberculous effusions (40 U/L) in every 11 tuberculous exudates with the mean value of 85,3±47,1U/L; in 9 of these the 2'-deoxyadenosine/adenosine ratio was less than 0,45. In the malignant group of patients, no one ADA level exceed 40 U/L, being estimated at 10,6±7,7 U/L (

Pleural fluid interferon-gamma (IFN-γ) measurement as a diagnostic tool in tuberculous pleurisy

Wstęp: Mimo że gruźlicze zapalenie opłucnej stanowi jedną z częstszych przyczyn obecności płynu w jamie opłucnej, rozpoznanie choroby nie należy jednak do łatwych. Najważniejsze znaczenie diagnostyczne mają badania histologiczne i mikrobiologiczne bioptatów opłucnej. Prowadzi się także liczne badania nad innymi markerami gruźliczego zapalenia opłucnej. Celem badania była ocena przydatności oznaczania stężenia interferonu gamma (IFN-&#947;) w płynie opłucnowym jako metody diagnostycznej gruźliczego zapalenia opłucnej. Materiał i metody: Badaną grupę stanowiło 94 chorych z płynem w opłucnej (44 kobiety i 50 mężczyzn, w wieku od 18 do 95 lat, średnia 59 &#177; 18 lat). U wszystkich wykonano punkcję opłucnej i badanie właściwości fizykochemicznych płynu (m.in. stężenie białka, aktywność dehydrogenazy mleczanowej [LDH, lactate dehydrogenase]). Dokonano także oceny całkowitej liczby komórek w płynie i ich składu odsetkowego. O innych badaniach diagnostycznych decydowały przesłanki kliniczne i wyniki badania płynu. Podstawę rozpoznania gruźliczej etiologii wysięku stanowiły: 1) dodatni wynik hodowli płynu lub bioptatu opłucnej lub 2) stwierdzenie ziarniny gruźliczopodobnej w bioptatach przy jednoczesnym wykluczeniu innych chorób mogących stanowić jej przyczynę. Stężenie IFN-&#947; w płynie opłucnowym oznaczano metodą ELISA (Quantikine Human IFN-&#947; Immunoassay, R&D Systems, USA). Wyniki: Gruźlicze wysiękowe zapalenie opłucnej rozpoznano u 28 osób. Wśród chorych z niegruźliczym płynem w opłucnej wyróżniono następujące podgrupy: wysięk nowotworowy (n = 35), wysięk parapneumoniczny/ropniak opłucnej (n = 20), przesięk w przebiegu niewydolności serca (n = 5) i inne rzadsze przyczyny płynu (n = 6). Średnie stężenie IFN-&#947; było znamiennie wyższe u chorych z wysiękiem gruźliczym niż w pozostałej grupie chorych (614,1 &#177; 324,5 vs. 15,1 &#177; 36,0 pg/ml, p < 0,0001). Przyjmując jako wartość odcinającą stężenie równe 100 pg/ml, czułość i swoistość testu dla rozpoznania gruźliczej etiologii wysięku wyniosły odpowiednio 100% i 98,5%. Wniosek: Stężenie IFN-&#947; okazało się bardzo swoistym i czułym markerem pozwalającym na rozróżnienie gruźliczego wysięku w opłucnej od płynów o innej etiologii.Introduction: Tuberculosis is one of the most common causes of pleural effusion (PE). However, the diagnosis of tuberculous pleurisy still remains difficult. Since M. tuberculosis isolation rates in tuberculous effusions are relatively low the histological and microbiological studies of pleural biopsy samples are usually required to confirm the diagnosis. Several biological markers have been proposed to enhance the effectiveness of diagnosing patients with tuberculous pleurisy. The study was undertaken to evaluate the diagnostic accuracy of pleural fluid IFN-&#947; concentration in differentiation between tuberculous pleural effusion (TPE) and non-tuberculous pleural effusion (nTPE). Material and methods: 94 patients (50 M and 44 F, mean age 59 &#177; 18, range 18-95 years) with PE were studied. All subjects underwent diagnostic thoracenthesis and extensive laboratory pleural fluid evaluation. Tuberculous pleural effusion was diagnosed in: 1) patients with positive pleural fluid or pleural biopsy culture and 2) patients with granulomas in the pleural biopsy specimen, after exclusion of other granulomatous diseases. IFN-&#947; level in pleural fluid was measured with commercially available immunoenzymatic assay (Quantikine Human IFN-&#947; Immunoassay, R&amp;D Systems, USA). Results: Tuberculous pleural effusion was diagnosed in 28 pts. The non-tuberculous pleural effusion group consisted of 66 pts, including 35 with malignant PE, 20 with parapneumonic effusion or pleural empyema, 5 with pleural transudates due to heart failure, and 6 with miscellaneous causes of PE. The mean concentration of IFN-g was significantly higher in TPE than in nTPE (614.1 &#177; 324.5 vs. 15.1 &#177; 36.0 pg/ml, p < 0.0001). At the cut-off value of 100 pg/ml the sensitivity and specificity of the test were 100% and 98,5% respectively. Conclusion: The pleural fluid concentration of IFN-&#947; was found to be highly sensitive and specific marker of tuberculous pleurisy

Draft Genome Sequences of Mycobacterium kansasii Strains 1010001454, 1010001458, 1010001468, 1010001493, 1010001495, and 1010001469, Isolated from Environmental Sources

Mycobacterium kansasii belongs to the nontuberculous mycobacteria (NTM) and causes opportunistic infections with both pulmonary and extrapulmonary manifestations. Here, we report the draft genome sequences of six environmental M. kansasii strains, designated 1010001495 (type I), 1010001469 (type II), 1010001468 (type III), 1010001458 (type IV), 1010001454 (type V), and 1010001493 (type V), originally isolated in five different European countries.The study was financed by the National Centre for Research and Development: “LIDER” Program (contract no. LIDER/044/457/L-4/12/NCBR/2013)