Диагностический и терапевтический потенциал белков экзосом при раке молочной железы

Exosomes are membrane vesicles 30–150 nm in size released by cells upon fusion of multivesicular bodies with the plasma membrane. A distinctive feature of these vesicles is the presence of the surface tetraspanins CD9, CD63, and CD81. The Rab family of small GTPases, including Rab27A and Rab27B, controls various steps in exosome release, including transport of multivesicular bodies and fusion of the multivesicular body to the plasma membrane. It is commonly accepted to date that exosomes are the main carriers of information between cells under physiological conditions, such as mammary development and lactation, and under pathological conditions, such as breast cancer. This review considers the peculiarities of exosome formation, secretion and transport, their composition and role in normal and breast cancer, as well as the prospects for using these vesicles to develop early non-invasive diagnostics and improve the effectiveness of anti-tumor therapy.Экзосомы представляют собой мембранные везикулы размером 30–150 нм, которые высвобождаются клетками при слиянии мультивезикулярных телец с плазматической мембраной. Отличительной чертой этих везикул является наличие в них поверхностных тетраспанинов CD9, CD63 и CD81. Семейство малых ГТфаз Rab, включая Rab27A и Rab27B, контролирует различные этапы высвобождения экзосом, в том числе транспорт мультивезикулярных телец и слияние мультивезикулярного тельца с плазматической мембраной. На сегодняшний день принято считать экзосомы основными переносчиками информации между клетками в физиологических  условиях, таких как развитие молочной железы и лактация, и при патологии, например при раке молочной железы. в обзоре рассмотрены особенности формирования, секреции и транспорта экзосом, их состав и роль в норме и при раке молочной железы, а также перспективы использования этих везикул для разработки ранней неинвазивной диагностики и повышения эффективности противоопухолевой терапии

Cell-free and cell-bound circulating DNA in breast tumours: DNA quantification and analysis of tumour-related gene methylation

Tumour development is characterised by the increased circulating DNA (cirDNA) concentration and by tumour-related changes in blood plasma DNA. Concentration of cirDNA and methylation of RARβ2, RASSF1A and HIC-1 gene promoters were investigated in cell-free and cell-surface-bound fractions from healthy donors, patients with breast cancer, and patients with breast fibroadenoma. Tumour development was shown to lead to significant changes in the distribution of cirDNA between cell-free and cell-surface-bound fractions. Analysis of RARβ2 and RASSF1A methylation in the total cirDNA provides 95% diagnostic coverage in breast cancer patients, 60% in patients with benign lesions, and is without false-positive results in healthy women. Results of the study indicate that methylation-specific PCR of RARβ2 and RASSF1A genes based on the total cirDNA combined with the quantitative analysis of cirDNA distribution between cell-bound and cell-free fractions in blood provide the sensitive and accurate detection and discrimination of malignant and benign breast tumours

КОНСЕРВИРОВАННЫЕ ОВОЩНЫЕ ПРОДУКТЫ ДЛЯ СОЦИАЛЬНОГО ПИТАНИЯ

The developed technology, regulatory and technical documentation allowed to produce 3-5-kg packages of sterilized vegetables: potatoes, beets, carrots and cabbage, which are in great demand in the social nutrition (the army, schools, hospitals). The use of packaging for products of composite materials allows to reduce the amount of required storage space.Разработанная технология и нормативно-техническая документация позволяют выпускать 3-5-килограммовые упаковки стерилизованных овощей: картофеля, свеклы, моркови и капусты, которые пользуются большим спросом в социальном питании (армия, учебные заведения, больницы). Использование для продуктов тары из комбинированных материалов позволяет уменьшить объемы необходимых складских помещений

Сравнительная оценка уровней опухолеассоциированных микроРНК экзосом плазмы крови и асцитической жидкости пациентов с раком яичников

Introduction. Ovarian cancer (OC) is one of the malignant neoplasms of the female reproductive system with a high mortality rate. Currently used tumor markers of this pathology do not have high sensitivity and specificity. In this regard, promising areas of molecular oncology are the study of the mechanisms of carcinogenesis of OC and the search for new biomarkers of liquid biopsy for early non-invasive diagnosis of neoplasms. It is known that tumor cells actively secrete exosomes into the extracellular space, which include biologically active molecules involved in carcinogenesis and claiming to be diagnostic markers. It was previously shown that microRNA-24 (miR-24) and microRNA-101 (miR-101) are transported as part of exosomes in OC and are involved in the degradation of the extracellular matrix, stromal remodeling, angiogenesis, and cancer cell motility.Aim. To evaluate the representation and diagnostic significance of miR-24 and miR-101 in plasma exosomes and ascitic fluid of OC patients.Materials and methods. The study included blood and ascitic fluid samples from OC patients (n = 20) and blood samples from healthy women (n = 19). The exosomal nature of the vesicles was confirmed by transmission electron microscopy, nanotracing analysis, and flow cytometry. After isolation of exosomal RNA, the relative level of miRNA was determined using reverse transcription and real-time polymerase chain reaction.Results. The highest concentration of exosomes was found in the ascitic fluid of OC patients, while the concentration of exosomes in the blood plasma of these patients was significantly higher than in healthy women. Relative levels of miR-24 and miR-101 in exosomes of blood plasma of healthy women were significantly higher than in exosomes of blood plasma and ascitic fluid of OC patients; at the same time, the levels of these miRNAs in exosomes of plasma and ascitic fluid of patients did not differ significantly.Conclusion. The results obtained confirm the promise of exosomal miR-101 and miR-24 for the diagnosis of OC by liquid biopsy.Введение. Рак яичников (РЯ) входит в число злокачественных новообразований женской репродуктивной системы с высокой летальностью. применяемые в настоящие время онкомаркеры данной патологии не обладают высокими чувствительностью и специфичностью. в связи с этим перспективными направлениями молекулярной онкологии являются исследование механизмов канцерогенеза РЯ и поиск новых биомаркеров жидкостной биопсии для ранней неинвазивной диагностики новообразований. известно, что опухолевые клетки активно секретируют во внеклеточное пространство экзосомы, в состав которых входят биологически активные молекулы, участвующие в канцерогенезе и претендующие на роль диагностических маркеров. Ранее было показано, что микроРНК-24 (miR-24) и микро-РНК-101 (miR-101) переносятся в составе экзосом при РЯ и участвуют в процессе деградации внеклеточного матрикса, ремоделировании стромы, ангиогенезе и подвижности раковых клеток.Цель исследования – оценка представленности и диагностической значимости miR-24 и miR-101 в экзосомах плазмы и асцитической жидкости больных РЯ.Материалы и методы. В исследование включены образцы крови и асцитической жидкости больных РЯ (n = 20) и образцы крови здоровых женщин (n = 19). экзосомальную природу везикул подтверждали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, трекового анализа и проточной цитофлуориметрии. после выделения экзосомальной РНК определяли относительный уровень микроРНК с использованием обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в реальном времени.Результаты. Наибольшая концентрация экзосом выявлена в асцитической жидкости больных РЯ, при этом концентрация экзосом в плазме крови этих пациенток оказалась достоверно выше, чем у здоровых женщин. Относительные уровни miR-24 и miR-101 в экзосомах плазмы крови здоровых женщин были достоверно выше, чем в экзосомах плазмы крови и асцитической жидкости больных РЯ; при этом уровни этих микроРНК в экзосомах плазмы и асцитической жидкости пациентов достоверно не различались.Заключение. Полученные результаты подтверждают перспективность экзосомальных miR-101 и miR-24 для диагностики РЯ методом жидкостной биопсии

Экзосомальные протеазы при колоректальном раке

The objective is to evaluate the level of ADAM10 and ADAM17 (a disintegrin and metalloproteinase) proteases, as well as 20S-proteasomes in blood plasma exosomes of patients with colorectal cancer.Materials and methods. The study included 60 patients with colorectal cancer (T2–4N0–2M0–1) and 10 control patients. The material for the study was EDTA blood plasma. Exosomes of blood plasma were isolated by ultrafiltration with ultracentrifugation. The level of tetraspanin-associated (ADAM10 and ADAM17) and tetraspanin-non-associated (20S-proteasome) proteases was evaluated by flow cytometry and Western blotting.Results. A twice negative subpopulation (ADAM10–/ADAM17–) predominated in blood plasma exosomes of colorectal cancer patients and control patients. The level of ADAM10+/ADAM17– exosomes was significantly higher in the exosomes of the plasma of control patients. There were no significant differences between the ADAM10/ADAM17 subpopulations and the 20S-proteasome level, depending on sex, age and tumor grade. A decrease in the ADAM10+/ADAM17– subpopulation was found in patients with metastatic colorectal cancer with hematogenous metastases compared with patients with T2–4N1–2M0 and 20S-proteasome compared to T2–4N0M0. A decrease in ADAM10–/ ADAM17+ exosomes and 20S-proteasomes level was found in exosomes of patients with colorectal cancer with a metabolic syndrome  in comparison with patients without metabolic disorders.Цель исследования – оценить уровень протеаз ADAM10 и ADAM17 (a disintegrin and metalloproteinase), а также 20S-протеасом в экзосомах плазмы крови больных колоректальным раком.Материалы и методы. В исследование были включены 60 больных колоректальным раком (T2–4N0–2M0–1) и 10 пациентов контрольной группы. Материалом для исследования послужила 3-замещенная калиевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) плазма крови. Экзосомы плазмы крови выделены методом ультрафильтрации с ультрацентрифугированием. Уровень тетраспанин-ассоциированных (ADAM10 и ADAM17) и тетраспанин-неассоциированных (20S-протеасомы) протеаз оценивали с помощью проточной цитометрии и вестерн-блоттинга.Результаты. Дважды негативная субпопуляция (ADAM10– / ADAM17–) преобладала как в экзосомах плазмы крови больных колоректальным раком, так и в экзосомах пациентов контрольной группы. Обнаружены статистически значимые различия в уровне ADAM10+ / ADAM17– экзосом у пациентов контрольной группы по сравнению с больными колоректальным раком. Не выявлено значимых различий между субпопуляциями ADAM10 / ADAM17 и уровнем 20S-протеасом экзосом в зависимости от пола, возраста и степени дифференцировки опухоли. У пациентов с метастатическим колоректальным раком с гематогенными метастазами выявлено снижение субпопуляции ADAM10+ / ADAM17– экзосом по сравнению с пациентами с местно-распространенным колоректальным раком (T2–4N1–2M0) и 20S-протеасом по сравнению с пациентами с T2–4N0M0. В экзосомах больных колоректальным раком с наличием метаболического синдрома выявлено снижение ADAM10– / ADAM17+ экзосом и уровня 20S-протеасом по сравнению с больными без метаболических нарушений

Поиск протеомных маркеров рака молочной железы в составе суммарных экзосом крови

To improve early detection of cancer, search for tumor markers in biological fluids is of great importance. A significant portion of exosomes is associated with the surface of blood cells, however, the protein spectrum of such exosomes has not been previously studied. The use of total blood exosomes (plasma exosomes and exosomes associated with the surface of blood cells) can not only significantly increase the specificity and sensitivity of existing methods, but also suggest new tumor markers for liquid biopsy.Objective. Search for candidate protein tumor markers of breast cancer by comparing 2D-proteomic maps of total blood exosomes of healthy females (HFs) and breast cancer patients (BCPs).Methods. Exosomes were isolated from plasma and total blood of HFs and BCPs by ultrafiltration followed by ultracentrifugation and were characterized using transmission electron microscopy (TEM) and immunocytochemistry. Protein concentration in exosomes was determined using the NanoOrange Protein Quantitation kit (Invitrogen) commercial kit. Proteomes of exosomes were studied using 2d electrophoresis followed by protein identification by mass spectrometry.Results. Highly purified samples of vesicles from plasma and total blood of no more than 100 nm in size were obtained, on the surface of which markers specific for exosomes were detected by monoclonal antibodies CD9. A comparative analysis of the proteomic maps of exosomal proteins of the HFs and BCPs obtained by 2D-electrophoresis allowed us to establish significant differences in the expression level and protein set in normal and pathological conditions. The 11 proteomic markers of breast cancer were identified by the peptide fingerprint method, of which LRG и у-chain FGB were detected in the composition of exosomes for the first time (according to the Exocarta database). Using MALDI-TOF mass spectrometry, 99 proteins were identified in the exosome preparations of the blood of HFs and BCPs, of which 35% were detected in the composition of the exosomes for the first time (according to the Exocarta database). 17 (53%) proteins associated with breast cancer were detected in total blood exosomes of cancer patients.Conclusion. The results obtained indicate that total blood exosomes are a promising source of diagnostic material for the search for proteomic markers of breast cancer. The identified proteomic tumor markers require further validation.Актуальность. Актуальной задачей повышения эффективности ранней диагностики онкологических заболеваний является поиск высокоспецифичных опухолевых маркеров в биологических жидкостях организма. Значительная часть экзосом ассоциирована с поверхностью форменных элементов крови, однако белковый спектр таких экзосом ранее не исследовался. использование суммарных экзосом крови (экзосом плазмы и экзосом, ассоциированных с поверхностью клеток крови) может не только значительно повысить специфичность и чувствительность существующих методов, но и выявить новые онкомаркеры для жидкостной биопсии.Цель работы - поиск кандидатных белковых онкомаркеров рака молочной железы (РМЖ) путем сравнения 2D-протеомных карт суммарных экзосом крови здоровых женщин и больных РМЖ.Материал и методы. Экзосомы выделены из крови здоровых женщин и больных РМЖ методом ультрафильтрации с последующим ультрацентрифугированием и охарактеризованы при помощи трансмиссионной электронной микроскопии и иммуноцитохимии. Концентрацию белка в экзосомах определяли при помощи коммерческого набора NanoOrange Protein Quantitation kit (Invitrogen). Протеом экзосом исследован с помощью 2D-электрофореза с последующей идентификацией белков методом масс-спектрометрии.Результаты. Получены высокоочищенные препараты микровезикул суммарной крови размером не более 100 нм, на поверхности которых иммуноцитохимически были выявлены специфические для экзосом маркеры (CD63, CD9 и CD24). Сравнительный анализ протеомных карт экзосомальных белков здоровых женщин и больных РМЖ, полученных с помощью 2D-электрофореза, позволил установить значимые различия в уровне экспрессии и наборе белков в норме и патологии. Методом пептидного фингерпринта идентифицировано 11 перспективных протеомных маркеров РМЖ, из них LRG и у-цепь FGB выявлены в составе экзосом впервые (согласно базе Exocarta). Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии идентифицировано 99 белков в препаратах экзосом крови здоровых женщин и больных РМЖ, из них 35 % выявлены в составе экзосом впервые (согласно базе Exocarta). В составе суммарных экзосом крови онкологических больных выявлено 17 (53 %) белков, ассоциированных с РМЖ.Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что суммарные экзосомы крови являются перспективным источником диагностического материала для поиска протеомных маркеров РМЖ. идентифицированные протеомные онкомаркеры в их составе требуют дальнейшей валидации

Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA

Improvements in genomic and molecular methods are expanding the range of potential applications for circulating tumour DNA (ctDNA), both in a research setting and as a ‘liquid biopsy’ for cancer management. Proof-of-principle studies have demonstrated the translational potential of ctDNA for prognostication, molecular profiling and monitoring. The field is now in an exciting transitional period in which ctDNA analysis is beginning to be applied clinically, although there is still much to learn about the biology of cell-free DNA. This is an opportune time to appraise potential approaches to ctDNA analysis, and to consider their applications in personalized oncology and in cancer research.We would like to acknowledge the support of The University of Cambridge, Cancer Research UK (grant numbers A11906, A20240, A15601) (to N.R., J.D.B.), the European Research Council under the European Union's Seventh Framework Programme (FP/2007-2013)/ERC Grant Agreement n. 337905 (to N.R.), the Cambridge Experimental Cancer Medicine Centre, and Hutchison Whampoa Limited (to N.R.), AstraZeneca (to R.B., S.P.), the Cambridge Experimental Cancer Medicine Centre (ECMC) (to R.B., S.P.), and NIHR Biomedical Research Centre (BRC) (to R.B., S.P.). J.G.C. acknowledges clinical fellowship support from SEOM

P39a

It was shown that circulating DNA could be used as a valuable source of material for cancer diagnostics (Fleischhacker, 2007), but unknown and unpredictable factors frequently dramatically decrease concentration of tumor-specific genetic biomarkers by influencing on generation and circulation in bloodstream of extracellular DNA. Sequencing of total circulating DNA could either provide valuable information regarding such factors or determine novel targets (DNA markers) for cancer diagnostics. Materials and Methods: We used a Sanger’s technology (ABI PRIZM 3110 sequenator) and BLAST analysis of circulating DNA from plasma and cell-surface-bound fraction of healthy individuals and patients with breast cancer. DNA was isolated by guanidine thiocyanate/glass milk method (Tamkovich, 2004) followed by Sau3A and EcoRI hydrolysis. Fragmented DNA was ligated into the pBlueScript II KS(-) vector. Competent XL-Blue (E. coli) cells were transformed with the vector by electroporation and after recovery the cells were plated on LB+Amp agar plates. The inserts length estimate by PCR-analysis. Results: The majority of investigated circulating DNA fragments were about 100–800 bp. Sequence analysis revealed that number of circulating DNA fragments does not depend from the size of paternal chromosome both in normal and pathological state, but fragments from chromosome six were found in the female bloodstream more frequently. It was found, that in cancer patients blood were observed frequency of occurrence of pseudo genes and CpG islands below then in healthy female blood. BLAST analysis demonstrates that 10% of coding DNA fragments circulating in blood of the breast cancer patients is associated with development of this pathology. Conclusion: Sequencing of circulating DNA demonstrates a variable concentration of different DNA sequences in comparison with genomic DNA. Further characterization of circulating DNA may be beneficial in diagnosis and prognosis and may also contribute to determining the source and function of circulating DNA