Biologia Futura: Emerging antigen-specific therapies for autoimmune diseases

Autoimmune diseases are caused by breaking the central and/or peripheral tolerance against self, leading to uncontrolled immune response to autoantigens. The incidences of autoimmune diseases have increased significantly worldwide over the last decades; nearly 5% of the world's population is affected. The current treatments aim to reduce pain and inflammation to prevent organ damage and have a general immunosuppressive effect, but they cannot cure the disease. There is a huge unmet need for autoantigen-specific therapy, without affecting the immune response against pathogens. This goal can be achieved by targeting autoantigen-specific T or B cells and by restoring self-tolerance by inducing tolerogenic antigen-presenting cells (APC) and the development of regulatory T (Treg) cells, for example, by using autoantigenic peptides bound to nanoparticles. Transferring in vitro manipulated autologous tolerogenic APC or autologous autoantigen-specific Treg cells to patients is the promising approach to develop cellular therapeutics. Most recently, chimeric autoantibody receptor T cells have been designed to specifically deplete autoreactive B cells. Limitations of these novel autoantigen-specific therapies will also be discussed

A szerin foszforiláció szabályozó szerepe a B sejtek immunoreceptor tirozin alapú aktiváló motívumok által közvetített jelátvitelében = The regulatory role of serine phosphorylation in the immunoreceptor tyrosine based activation motif-mediated signal transduction of B cells

Célunk az FcgRIIb szerint tartalmazó, sejtmembrán-közeli intracelluláris motívuma és a MAPK kölcsönhatásának, valamint az FcgRIIb szerinen történő foszforilációja funkcionális következményeinek felderítése volt. Igazoltuk, hogy aktív MAP kinázok kötődnek az FcgRIIb-n levő dokkoló helyhez, amelyek az aktivált B sejtekben foszforilálhatják magát a receptort és/vagy más, ahhoz kötődő fehérjét. Azonosítottuk azt a legrövidebb IgG Fc szekvenciát, amely FcgRII által kiváltott jelek közvetítésére alkalmas. Megállapítottuk, hogy a szerin/alanin mutácót tartalmazó receptorok fokozott tirozin kináz (lyn) és Erk aktivációt tesznek lehetővé B sejtekben, ami arra utal, hogy a vad típusú receptort hordozó sejtekben ezek a kinázok kisebb mértékben aktiválódnak. Igazoltuk, hogy a sejtbejuttatható FcgRIIb foszfopeptidek alkalmasak a B sejt receptoron keresztül kiváltott jelek pozitív és negatív szabályozására a foszforilált aminosavtól (ser vagy tyr), a dózistól és a kezelési időtől függő módon. Kimutattuk, hogy a MAPK gátlása B sejtekben fokozza az FcgRIIb expressziót, feltehetőleg a receptor leválás megakadályozásán keresztül. Ez arra a enged következtetni, hogy aktivált B sejtekben a MAPK ezzel ellentétes folyamatot, a negatívan szabályozó FcgRIIb leválását vezérli. Eredményeink azt sugallják, hogy mind a szerinen, mind a tirozinon foszforilált FcgRIIb motívum negatív szabályozó szerepet játszik a B sejt stimuláció során. | Our aim was to explore the interaction between the membrane proximal intracellular motif of FcgRIIb and the MAPK in B lymphocytes and to reveal the functional consequences of the phosphorylation of FcgRIIb on serine. We first proved that active MAP kinases bind to a docking site on FcgRIIb, then may phosphorylate the receptor itself and/or any protein that may bind to it. We identified the shortest peptide corresponding to a linear sequence in IgG Fc that binds and induces signals via FcgRII. We described that ser/ala mutant FcgRIIb admit an enhanced protein tyrosine kinase (lyn) and Erk activation in B cells, suggesting that these kinases become less activated by BCR signals in cells expressing the wild type FcgRIIb . We have shown that cellmembrane permeable FcgRIIb phosphopeptides may positively and negatively regulate signals in B cells, depending on the kind of amino acid residue (ser or tyr), the dose and time of interaction. We also pointed out that the inhibition of MAPK in B cells enhances FcgRIIb expression, most probably by inhibiting receptor release. These data indicate that activated MAPK may induce an opposite process, namely the shedding of the negatively regulating FcgRIIb from activated B cells. Our results suggest that both ser and tyr phosphorylated motifs of FcgRIIb may downregulate antigen induced signals mediated via BCR

Jelátvitel és génexpresszió a B sejtek fejlödése során, jelentösége az autoimmunitás kialakulásában = Signaling and gene expression in developing peripheral B cells, implications for autoimmunity

Célunk a B-sejt receptor (BCR), a Toll-szerű receptor 9 (TLR9), a B-sejt aktiváló faktor (BAFF) receptora, a BR3 és CD95/Fas együttes jelközvetítésének tanulmányozása, a jelpályák közötti együttműködés módjának felderítése volt. Megállapítottuk, hogy a BAFF, a TLR9 agonista, CpG, és az anti-IgG egyaránt gátolja a Fas-idukált apoptózist. A BCR és a CpG részben átfedő, (PKC) részben eltérő (PI3K vagy p38) jelpályák aktivációján keresztül fejtheti ki apoptózist gátló hatását. Elsőként jellemeztük, a Gab2 adapter szerepét B-sejtekben és leírtuk, hogy a fokozott Gab2 expresszió megmenti a B-sejteket a Fas-indukált sejthalálból, ami a Gab2 - PI3-K - Akt jelpálya aktiválásának köszönhető. A Tak1-p38 jelpálya kiemelt szerepet játszik a BCR és a TLR9 együttműködése során, míg a BR3–TLR9 együttes jelei főként az NF?B útvonalon fejtik ki a hatásukat. A ko-stimuláló jelek csökkenthetik a B sejtek aktivációs küszöbét. Eredményeink összesítve azt mutatják, hogy a TLR9-en keresztül érkező jelek kiváltják az emberi B sejtek aktiválódását, proliferációját és ellenanyag termelését, és az első két esetben szinergikus együttműködésben állnak a BCR által kiváltott jelekkel, ami arra utal, hogy a természetes immunválasz TLR9-en keresztül történő aktiválása az antigénre nem specifikus módon sejtproliferációt és ellenanyag termelést válthat ki. Ez fokozott védelmet biztosíthat a fertőző ágensekkel szemben, de fokozhatja az autoreaktív ellenanyagok termelésének veszélyét is. | Our aim was to reveal the mechanism of the cooperation between signals activated by the B-cell receptor complex (BCR), Toll-like receptor 9 (TLR9), receptor for the B-cell activating factor of tumor necrosis factor family (BAFFR, BR3) and the CD95/Fas. We have found that BAFF, TLR9 agonist CpG DNA as well as anti-IgG rescued B-cells from Fas-induced apoptosis. BCR and CpG rescue B-cells by partly overlapping (PKC mediated) and partly independent (PI3-K or p38 regulated) pathways. We first characterized the role of Gab2 adapter in B-cells, and described that enhanced expression of Gab2 rescues B-cells form Fas-induced apoptosis, that depends on the PH domain of Gab2, and it is most probably due to activation of the PI3-K-Akt pathway. Investigating the cooperation between signals stimulated by BCR, BAFF and TLR9 we described that the Tak1-p38 pathway plays the most important role in the synergism between BCR and TLR9, while BR3 and TLR9 synergism leads to NFkB activation. These co-stimulating signals decrease activation threshold of B-cells. Taking together our results indicate that TLR9 induces the activation, proliferation and antibody synthesis of B-cells, and synergizes with BCR mediated signals. This suggests that triggering the innate immune system may result in antigen independent proliferation and antibody production. That may protect against infectious agents but may also augment the danger of autoantibody production

The role of N- or C-terminal biotinylation in autoantibody recognition of citrullin containing filaggrin epitope peptides in Rheumatoid arthritis

Here, we report on the synthesis, conformational analysis and autoantibody binding properties of new sets of Rheumatoid arthritis (RA) specific biotin-peptide conjugates derived from filaggrin epitope peptides. The biotin with or without a linker was attached to the Cit or Arg containing epitope core (311TXGRS315) or epitope region (306SHQESTXGXSXGRSGRSGS324) peptide (where X = Cit), through an amide bond at the N- or C-terminal of the epitopes. Antibody binding was detected by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using sera from RA, Systemic lupus erythematosus (SLE) patients as well as healthy individuals and the secondary structure of conjugates was investigated by electronic circular dichroism (ECD). We found that autoantibodies from RA patients recognize specifically both filaggrin epitope region (306SHQESTXGXSXGRSGRSGS324) and short epitope core (311TXGRS315) peptides. Our data also indicate that the positioning of the biotin label within a peptide sequence can markedly influence the antibody binding, but the length of the linker incorporated has essentially no effect on the recognition. ECD experiments demonstrate that the Arg/Cit change does not influence the solution conformation of the peptide conjugates. However, the presence and position of the biotin moiety has a pronounced effect on the conformation of the 5-mer epitope core peptides, while it doesn’t alter the secondary structure of the 19-mer epitope region peptides

A hipothalamusz-hipofízis-gonád tengely és a humorális immunválasz kölcsönhatásának molekuláris mechanizmusa és szerepe az autoimmun betegségek kialakulásában: neuro-immuno-endokrin kölcsönhatások = Molecular mechanism of hypothalamo-pituitary-gonadal axis and humoral immune response interaction and its role in development of autoimmune disease: neuro-immuno-endocrine interactions

A hypothalamus-hipofizis-gonád (HPG) tengely és az immunrendszer fontos kölcsönhatásban van egymással. Vizsgálatainkban ezen kölcsönhatásnak molekuláris mechanizmusait próbáltuk feltárni. Kísérleteinkben megmutattuk, a HPG tengely irányításában fontos szerepet betöltő GnRH neuronban lévő jelátviteli molekulák, mint az ERK fokozott aktivitást mutat T sejt dependens B sejt immunválasz kialakulásakor a 6. napon nőstény egerekben. Ebben feltehetőleg a citokinek, mint pl. az Il-10 jelentős szerepet játszhatnak. Ez a jelenség T sejt idenpendens B sejt válaszban nem mutatható ki. Megfigyeltük továbbá, hogy az ösztrogén jelentősen növeli a T sejt dependens B sejt immunitásban megfigyelhető ERK foszforilációt a GnRH neuronban. Érdekes módon ezek a változások nem alakították át az állatok ösztrusz ciklusának menetét. A HPG tengely végpontjában felszabaduló ösztrogén jelentősen növelte az antitestek és a B sejetek mennyiségét, és ez a növekedés a T sejtektől függ. A B és a T sejtekben az ösztrogén aktiválta ERK, Akt és NF?B jelátvivő molekulákat azonban csak a T sejtekben indukál növekedést az intraellularis Ca2+ koncentrációban. Az ösztrogén ezeket a nem-klasszikus hatásokat feltehetően a B és T sejtek membránjában meglévő ösztrogén receptorokon keresztül hozza létre. Kísérleti eredményeink fontos támpontot adhatnak a HPG tengely és az immunválasz interakciójának molekuláris mechanizmusaihoz, mely közelebb vihet minket a nemi dimorfizmust mutató autoimmun betegségek megértéséhez is. | Hypothalamo-pituitary-gonadal (HPG) axis has a critical interaction with the immune system. In our experiments, we investigated the molecular mechanism of this particular interaction. Our findings clearly demonstrate that T cell-dependent immune response induces signalling molecule activation, ERK, in the central processor unit of HPG axis, the gonadotropin releasing hormone (GnRH) neuron in female mice at sixth day following immunization. This phenomenon may depend on the cytokines such as Il-10 and it could not be observed in T cell independent immune response. Estrogen further enhances the immune response-induced ERK phospohrylation in GnRH neurons. Interestingly, T cell dependent immune challenge did not alter the estrus cycle. The estrogen, the ?endpoint? of the HPG axis, significantly increases the antibody concentration, the number of B cells and this enhancement highly depends on T cells. Although estrogen induces activation of several signalling molecules such as ERK, Akt and NF?B in B and T cells the estrogen-induced Ca2+ increase was only detected in T cells. It is very likely that estrogen exerts its non-classical actions via estrogen receptors in B and T cells. Taken together, these results shed a light on the molecular mechanism of interaction of HPG axis and immune response. Accordingly, our data may also help to understand the mechanism of certain gender related autoimmune diseases

Exacerbation of collagen induced arthritis by Fcγ receptor targeted collagen peptide due to enhanced inflammatory chemokine and cytokine production

Antibodies specific for bovine type II collagen (CII) and Fcγ receptors play a major role in collagen-induced arthritis (CIA), a mouse model of rheumatoid arthritis (RA). Our aim was to clarify the mechanism of immune complex-mediated inflammation and modulation of the disease. CII pre-immunized DBA/1 mice were intravenously boosted with extravidin coupled biotinylated monomeric CII-peptide epitope (ARGLTGRPGDA) and its complexes with biotinylated FcγRII/III specific single chain Fv (scFv) fragment. Disease scores were monitored, antibody titers and cytokines were determined by ELISA, and binding of complexes was detected by flow cytometry and immune histochemistry. Cytokine and chemokine secretion was monitored by protein profiler microarray. When intravenously administered into collagen-primed DBA/1 mice, both CII-peptide and its complex with 2.4G2 scFv significantly accelerated CIA and increased the severity of the disease, whereas the monomeric peptide and monomeric 2.4G2 scFv had no effect. FcγRII/III targeted CII-peptide complexes bound to marginal zone macrophages and dendritic cells, and significantly elevated the synthesis of peptide-specific IgG2a. Furthermore, CII-peptide containing complexes augmented the in vivo secretion of cytokines, including IL-10, IL-12, IL-17, IL-23, and chemokines (CXCL13, MIP-1, MIP-2). These data indicate that complexes formed by the CII-peptide epitope aggravate CIA by inducing the secretion of chemokines and the IL-12/23 family of pro-inflammatory cytokines. Taken together, these results suggest that the in vivo emerging immune complexes formed with autoantigen(s) may trigger the IL-12/23 dependent pathways, escalating the inflammation in RA. Thus blockade of these cytokines may be beneficial to downregulate immune complex-induced inflammation in autoimmune arthritis

Jelátviteli kompartmentek és proteolózis az immunválasz, valamint az immun- és idegrendszer közötti kommunikáció szabályozásában = Signaling compartments and proteolysis in regulation of immune responses and the communication between the immune- and nervous systems

Több új immunreceptor-kölcsönhatást (FcR/CR/BCR; sejthalál-R/TCR), és több szabályozó mechanizmust azonosítottunk a lipid raftok és más membrán mikro-kompartmentek, valamint limfocita adaptor fehérjék részéről, melyek fontosak a limfociták effektor funkcióiban ill. a sejthalál folyamatában. Leírtuk az utóbbi folyamatokban kritikus miozin motorfehérje izotípusok néhány molekuláris kapcsolatának szerkezeti hátterét és szabályozási lehetőségét. Kimutattuk egyes komplement (C) faktorok és receptorok sokrétű szerepét az immunválasz szabályozásában és, hogy a belőlük származtatott peptidekkel az allergiás hízósejtválasz gátolható. Leírtuk a C-rendszer szabályozó szerepét a Sclerosis Multiplex (SM) állatmodelljében is. Kimutattuk a tripszin-szerű proteáz aktivitás szabályozó szerepét a B-sejt válaszban, és valószínűsítettük szerepüket a mielin bázikus fehérje specifikus hasításában, mely fontos eleme lehet az SM kialakulásának. Eredményeink alapját képezik szelektív immunmodulánsok kifejlesztésének autoimmun ill. allergiás kórképekben. Kimutattunk egyes immunrendszeri effektor- és idegrendszeri funkciók között fellépő, a citokin hálózat ill. steroid hormonok (ösztrogének, glukortikoidok) útján megvalósuló kommunikációs útvonalakat. Új módszereket is kifejlesztettünk (pl. antigén-targetingre alkalmas egyláncú ellenanyag konstrukciók) és a projekt támogatásával beszereztünk egy konfokális mikroszkópot, melyen több új metodikát optimalizáltunk a celluláris kommunikáció vizsgálatára. | We identified several novel immunoreceptor cross-talk elements (FcR/CR/BCR; cell death-R/TCR) and regulatory mechanisms by lipid rafts, other membrane-compartments, as well as adaptor proteins, which are essential in the lymphocytes' effector functions and cell death. Structural and regulatory aspects of some important molecular interactions of myosin motor protein isotypes, essential players in the above processes, were also described. Multiple regulatory functions of the complement system in the immune response and the inhibitory potential of C3a-derived peptides in the allergic mast cell response were identified. The regulatory potential of the complement system was also shown in an animal model of Sclerosis Multiplex (SM). We have shown that trypsin-like protease activities are involved the B cell response through formation of soluble receptors and that trypsin-4, specifically cleaving MBP, may be a critical element in development of SM. Our results form a basis for development of selective immunomodulators for autoimmune- and allergic diseases. We explored several novel communication pathways between effector mechanisms of the immune system and certain nervous system functions, through the inflammatory cytokine network and steroid hormones. New methods and molecular constructs (e.g. antigen-targeting by engineered single-chain antibodies) and several modern confocal imaging techniques for studying cellular communication were also developed with the support of the grant

Szerkezeti biológia = Structural biology

Kiroptikai spektroszkópia (ECD, VCD) - Az abszolút konfiguráció meghatározása - Gyűrűs és lineáris peptid modellek konformációjának meghatározása - Királis diródium komplexek ECD és VCD vizsgálata Fehérje NMR és modellezés - Peptidek számitástechnikai vizsgálata - Fehérjék NMR vizsgálata Fehérje röntgenkrisztallográfia - Egy prolil-oligopeptidáz (POP) komplexei kristályszerkezetének meghatározása - A kalmodulin (CaM) vizsgálata - A molekuláris felismerés szerkezeti vonatkozásai - A Pyrococcus horikoshii acilamino-peptidáz (AAP) kristályszerkezetének meghatározása Biokémiai vizsgálatok - A scallop-peptid vizsgálata három kristályközegben - A miozin-6 utolsó (tail) doménje szerkezetének predikciója - A coiled-coil és rendezetlen fehérje szegmensek kereszt-predikciójának analízise - Öt természetes és két szintetikus, töltéssel rendelkező ?-hélix lánc mikroszekundum időskálájú molekuladinamikai szimulációja vizes közegben - Az LC8 dynein centrális (hub) fehérje könnyű láncának (DYNLL) vizsgálata Immunológiai vizsgálatok - Az SHP-2 tirozin-foszfatáz vizsgálata. Különböző szerkezetű foszfopeptidek tanulmányozása - Egy biotinilezett kollagén epitóp peptid, az extravidin-peptid complex és extravidin szerkezetvizsgálata Közlemény: 36 | Chiroptical spectroscopy (ECD, VCD) - Determination of the absolute configuration - Determination of the conformation of cyclic and linear model peptides - Studies on the chiral dirhodium complexes by ECD and VCD Protein NMR and protein modeling - Computational work on peptides. - NMR studies in proteins Protein X-ray crystallography - The crystal structures of prolyl oligopeptidase (POP) in complexes were solved. - Studies on calmodulin (CaM). - Structural aspects of molecular recognition were characterized. - The crystal structure of Pyrococcus horikoshii acylaminoacyl peptidase was solved. Biochemical studies - The structure of a scallop peptide in three crystal environments was determined . - The structure of the tail domain of myosin-6 was predicted. - A thorough analysis of cross-predictions of coiled-coil and disordered protein segments was performed. - Microsecond classical molecular dynamics simulations of five naturally occurring and two synthetic charged single ?-helices were performed. - Studies on LC8 dynein light chain (DYNLL), a hub protein. Immunological studies - Studies on SHP-2 tyrosine phosphatase. A variety of phosphopeptides were tested. - Structural studies were performed on biotinylated collagen epitope peptide, an extravidin-peptide complex and extravidin. Papers: 3

Suppression of innate and adaptive B cell activation pathways by antibody coengagement of FcgammaRIIb and CD19.

The Fc receptor (FcgammaRIIb) inhibits B cell responses when coengaged with B cell receptor (BCR), and has become a target for new autoimmune disease therapeutics. For example, BCR and FcgammaRIIb coengagement via the Fc-engineered anti-CD19 XmAb5871 suppresses humoral immune responses. We now assess effects of XmAb5871 on other activation pathways, including the pathogen-associated molecular pattern receptor, TLR9. Since TLR9 signaling is implicated in autoimmune diseases, we asked if XmAb5871 could inhibit TLR9 costimulation. We show that XmAb5871 decreases ERK and AKT activation, cell proliferation, cytokine, and IgG production induced by BCR and/or TLR9 signals. XmAb5871 also inhibited differentiation of citrullinated peptide-specific plasma cells from rheumatoid arthritis patients. XmAb5871 may therefore have potential to suppress pathogenic B cells in autoimmune diseases

Bead arrays for antibody and complement profiling reveal joint contribution of antibody isotypes to C3 deposition

The development of antigen arrays has provided researchers with great tools to identify reactivities against self or foreign antigens from body fluids. Yet, these approaches mostly do not address antibody isotypes and their effector functions even though these are key points for a more detailed understanding of disease processes. Here, we present a bead array-based assay for a multiplexed determination of antigen-specific antibody levels in parallel with their properties for complement activation. We measured the deposition of C3 fragments from serum samples to reflect the degree of complement activation via all three complement activation pathways. We utilized the assay on a bead array containing native and citrullinated peptide antigens to investigate the levels of IgG, IgM and IgA autoantibodies along with their complement activating properties in serum samples of 41 rheumatoid arthritis patients and 40 controls. Our analysis revealed significantly higher IgG reactivity against the citrullinated fibrinogen β and filaggrin peptides as well as an IgA reactivity that was exclusive for citrullinated fibrinogen β peptide and C3 deposition in rheumatoid arthritis patients. In addition, we characterized the humoral immune response against the viral EBNA-1 antigen to demonstrate the applicability of this assay beyond autoimmune conditions. We observed that particular buffer compositions were demanded for separate measurement of antibody reactivity and complement activation, as detection of antigen-antibody complexes appeared to be masked due to C3 deposition. We also found that rheumatoid factors of IgM isotype altered C3 deposition and introduced false-positive reactivities against EBNA-1 antigen. In conclusion, the presented bead-based assay setup can be utilized to profile antibody reactivities and immune-complex induced complement activation in a high-throughput manner and could facilitate the understanding and diagnosis of several diseases where complement activation plays role in the pathomechanism