Harántcsíkolt izom SR kalcium csatornájának modulációja egészséges és kóros körülmények között = Modulation of the SR calcium channels of striated muscle in health and disease

Az izom összehúzódás kiváltásában centrális szerepet játszó elektromechanikai csatolás kulcs-molekuláit tanulmányoztuk. Megállapítottuk, hogy a gadolinium ion mind a cisz mind a transz oldalról hasonlóan gátolja a csatornát (Ki=5,38+-0,63microM és Ki=5,72+-0,84microM, Ncis=4,21+-0,47, Ntrans=4,5+-0,41), feltehetően a kötőhely a csatorna vezető pórusának belsejében található, és a két oldal felől egyformán érhető el. Az európium a cis oldalról kvalitatíve hasonló módon gátol (Ki=107+-17nM), míg trans oldalról hatástalan. Megállapítottuk, hogy a timol gátolja a kalcium pumpát (K i=253+-4,7 microM, NHill=1,62+-0,05) és a csatorna aktiválásával gyors kalcium felszabadulást vált ki (Vmax=0,47+-0,04 nmol/s, EC50=258+-21 nM, NHill=3,0+-0,54). Szintetizáltuk a DHP receptor adott szakaszait, és megállapítottuk, hogy a maurocalcin (MCa) két módon is hat a RyR1 kapuzására, "hosszú fél-nyitott" (LLSS) állapotokat indukál, és az LLSS időszakok között növeli a csatorna nyitvatartási valószínűségét. A toxin pontmutánsai segítségével kimutattuk, hogy a 31 aminosavból álló teljes szekvenciának a hatás szempontjából legkritikusabb tagja a 24-es aminosav. A toxinmolekulát a 23, 22 20 és 8-as pozícióban alaninra mutálva a hatás erőssége attól függött, hogy térbelileg milyen messzire van a mutációs pont a kritikus 24-es pozíciótól. A MCa hatása polaritás- és potenciálfüggő | Key molecules playing central role on the muscle contraction have been studied. We have shown using bilayer technique that Gadolinium inhibits the calcium channel from both sides (Ki=5.38+-0.63microM and Ki=5.72+-0.84 microM, Ncis=4.21.+-0.47, Ntrans=4.5+-0.41) showing, that the Gd3+ binding site is located in the middle region of the channel pore equally accessible from both sides while Eu3+ inhibited the channel only from the cis side (Ki=107+-17nM). We have shown, that thymol inhibits the SR calcium pump (K i=253+-4.7 microM and NHill=1.62+-0.05) and evokes calcium release (Vmax=0.47+-0.04 nmol/s, EC50=258+-21 nM, NHill=3.0+-0.54). The effect of thymol on RyR1 and RyR2 is similar. Analogous sequence to the different segments of the II-III loop of the DHPR were synthesized followed by the demonstration that maurocalcin (MCa) alters the gating of the RyR1 and RyR2. It induces long lasting subconductance events (LLSS) which might last even for several seconds, and it increases the open probability between the LLSS events too. Using different point mutations of the 31 residue peptide it was shown, that the position 24 is critical for the toxin effect. Alanine mutations in the position of 8, 9, 20, 22, 23 resulted partial LLSS effect according to the three dimensional distance of the given amino acid from the crucial 24 residue. The MCa effect found to be strongly polarity and slightly potential dependent

A humán szívizom ioncsatornáinak ontogenezise = Ontogenesis of ion channels of human cardiac muscle

A project célja az volt, hogy egészséges adult humán és embrionális kamrai preparátumokon immunbiokémiai ill. immunhisztokémiai módszerekkel, voltage-clamp, akciós potenciál clamp technikákkal feltérképezzük a felszíni membrán legfontosabb ioncsatornáit és azok regionális eltéréseit. A kísérleteket kutya szívizomsejteken is elvégeztük, mert a humán szívizomminták korlátozott hozzáférése miatt egy, a humán szívizom elektrofiziológiai tulajdonságaihoz leginkább hasonlító állatmodellt is kerestünk. A humán embrionális szívizommintákkal végzett kísérletek során magunknak kellett a molekuláris biológiai módszereket humán embrionális szívizomra applikálnunk, hiszen korábban hasonló méréseket senki nem végzett. Western blot technikával sikeresen kimutattuk humán és kutya szívizomban az alábbi csatornaproteineket: Kv4.3, KChip2, MiRP1, KvLQT1, MinK, ?1C, Kir2.1, Kv1.4, HERG. Megállapítottuk, hogy egészséges humán és kutya kamra szívizomban az ioncsatornát alkotó fehérjék eloszlása apiko-bazális és endo-epikardiális inhomogenitást mutat. A csatorna fehérjék eloszlásával összhangban, a szívizom különböző régióiból származó sejteken eltérő az ionáramok denzitása és ez tükröződik az akciós potenciálok morfológiájában is. Az ionáram denzitás és a csatornafehérjék menyisége szoros korrelációt mutat mind humán, mind kutya szívizomsejteken. Az egyes szívterületek ioncsatorna inhomogenitása megegyezik a humán és a kutya szívizomsejteken. Ez alapján elmondhatjuk, hogy a kutya szívizom elektrofiziológiai sajátságok tekintetében jó modellje a humán szívizomnak. | The aim of this project was to detect the major ion channels of the surface membrane of healthy adult human and embryonic cardiomyocytes. Our goal was to explore the possible regional differences of the ion channel distribution of the ventricular wall using immunobiochemical, histochemical voltage-clamp and action potential-clamp techniques. The experiments were done on canine heart, too, because of the limited number of healthy human cardiac tissue samples, we tried to find a good model of the human cardiac myocytes. After collecting human cardiac tissue samples the known immunobiochemical methods were adjusted to the human embryonic cardiac cells, because no one has done such experiments before. Using the Western blot technique we detected the following channel proteins in human and in canine myocardium: Kv4.3, KChip2, MiRP1, KvLQT1, MinK, ?1C, Kir2.1, Kv1.4, HERG. Our experiments revealed that the distribution of the ion channel proteins of the left ventricular wall shows an apico-basal and an endocardial to epicardial inhomogenity. According to this finding we detected unequal ion current density on isolated cardiomyocytes from the different region of the left ventricle. In human and in canine myocardium the density of ion current and the expression of ion channel proteins has a strong correlation. Our results clearly show that the ion channel densities of the various regions of the ventricular wall of human and canine heart are very similar. These results prove that the canine heart is a good model to study the electrophysiological properties of human heart

A kalcium transzport szerepe a harántcsíkolt izom jelátvitelében = The role of calcium transport in signal transduction of striated muscle

A DHPR II-III hurokkal homológ szekvenciájú maruokalcin (MCa) hatását vizsgáltuk a RyR1 és a RyR2 csatornára. Megállapítottuk, hogy a MCa a RyR2-őt gyengébben befolyásolja, mint a RyR1-et, a gyengébb RyR2-MCa kölcsönhatás miatt. A RyR-MCa kölcsönhatásért a peptid 8, 22, 23, 24-es aminosavai által alkotott pozitív töltésű ?felület? a felelős, bár a kölcsönhatásban a membránpotenciál is fontos szerepet játszik. Patkányokon előidézett miokardiális infarktust (MI) követően kialakuló vázizom-gyengeségben tanulmányoztuk a RyR1 működésének megváltozását. Megállapítottuk, hogy az infarktus után 24 héttel a kalciumcsatornák mintegy 1/3-a a fiziológiással ellentétes áramirány esetén a szokásos 525pS-el szemben 750pS vezetőképességet mutat, míg ugyanezen csatornák a fiziológiás áramirány esetén is a szokásos 525-550 pS vezetőképességűek. A gyógyszerjelölt K201 molekula nem okozott szignifikáns változást a csatorna paramétereiben annak ellenére, hogy a MI-al egyszerre alkalmazva kivédi a vázizom-gyengeség kialakulását, így valamilyen poszt-transzlációs változás áll a kialakuló vázizom-gyengeség hátterében. A TPEN-ről kimutattuk, hogy gátolja a pumpát és aktiválja a csatornát, így kardioprotektív hatású. Kimutattuk, hogy az európium és a szamárium is gátolja a RyR1-et, de ? ellentétben a gadolíniummal kapott eredményekkel ? a cis és trans oldali hatás több nagyságrenddel eltér egymástól. Az európium fél-gátló koncentrációja 167?5nM a cis oldalon, míg 4,7?0,1?M a transz oldalon. | The effect of Maurocalcin (MCa) ? which is homologous to the II-III loop of the DHPR ? were investigated on the RyR1 & RyR2. The modulatory effect of MCa was more pronounced on RyR1 than on RyR2 due to the weaker interaction. The interaction is determined by the 8. 22, 23, 24 AA residues, which form a positive charged area on the MCa surface, and also influenced by the membrane potential. The effect of myocardial infarct (MI) on the function of RyR1 were also studied using rat post MI (PMI) model. It was shown, that 24 weeks after MI about 1/3 of the channels showed abnormally high conductance (750 pS instead of 525pS) at reverse calcium flux, while the forward conductances has not been altered. K-201 - a potential therapeutic agent did not alter the conductivity pattern, even though administering the drug at the onset of the MI resulted in the protection of skeletal muscles, patronizing that a kind of post-translational change is involved in the phenomena. TPEN is cardioprotective because it inhibits the calcium pump and activates the calcium. It was shown that Europium and Samarium inhibits RyR1 with substantial side preference ? in contrast to Gadolinium. Half inhibitory concentration of Eu(3+) is 167?5nM at cis side, while 4,7?0,1?M at the trans side

A szállítási szerződés reformja

INST: L_08