Etudes ciblées de spéciation d éléments chimiques dans des échantillons environnementaux et nutritionnels

Le travail de thèse est constitué de deux volets. Le premier présente l étude par un système d extraction séquentielle à flux continu, des formes et quantités des espèces de fer dans des échantillons de produits de corrosion de pipelines de gaz naturel. L extraction séquentielle se déroule en quatre étapes qui permettent de dissoudre les fractions de fer (I) soluble dans l eau, (II) soluble dans l acide, (III) réduit (Fe-(oxyhydr)oxides) et (iv) oxydable. 61-99% du fer est retrouvé dans la fraction de fer réduit, montrant que les (oxyhydro)oxides sont les constituants majeurs qui résultent essentiellement de réactions avec de l oxygène et de l eau. Ces données peuvent être utilisées pour comprendre les origines et les mécanismes de corrosion et pour prévenir et résoudre les problèmes dans l industrie pétrolière. Le second volet présente des extractions séquentielles (eau, driselase, protéase) et des extractions simulant les fluides gastro-intestinaux afin de caractériser la capacité de liaison et la bioaccessibilité du chrome dans deux levures enrichies en chrome (suppléments alimentaires). Les rendements d extraction obtenus avec l eau, la driselase ou avec un fluide gastrique simulé, sont faibles (<10%) contrairement à la protéolyse ou la digestion par fluide gastro-intestinal simulé qui libèrent plus de la moitié du Cr présent dans l échantillon. Le fractionnement par SEC-ICP MS a permis de distinguer deux fractions (<1 kDa et 1-5 kDa) qui contiennent la totalité du Cr extrait. Après RP HPLC-ICP MS, la fraction de faible masse moléculaire s avère contenir du Cr(III), tandis que la fraction de haute masse moléculaire détient des complexes du Cr stables et hydrophobes.This work consists of two parts. In the first part, the forms and quantities of iron species in corrosion products from natural gas pipelines were examined using a continuous-flow sequential extraction system. Sequential extraction consists of four steps which are dissolve water soluble iron (FeSO4), acid soluble iron (FeCO3), reducible iron (Fe-(oxyhydr)oxides) and oxidizable iron (FeS2) fractions, respectively. Selectivity of extractants for particular iron species was evaluated through determination of co-extracted anions. Iron was found predominantly in the reducible fraction, indicating that Fe-(oxyhydr)oxides are the major constituents and the corrosion products investigated mostly resulted from O2 and water. The iron fractionation data can be used to understand the origins and to prevent or solve corrosion problems in the petroleum and natural gas industries. In the second part, sequential extraction (water, Driselase and protease XIV) and extraction with simulated gastrointestinal fluids were used to characterize binding and bioaccessibility of chromium (Cr) in two Cr-enriched yeasts-based food supplements. Cr in such yeasts was found to be hardly extractable with water, Driselase or simulated gastric fluid, but proteolysis or gastrointestinal fluid digestion released more than half of the Cr present. Investigation with SEC-RP HPLC-ICP MS provided the fractionation and binding data of Cr complex. However, attempts at their identification by MALDI-TOF MS and ESI MS/MS were not successful. Information obtained can be useful for the nutrient evaluation of supplements and for distinguish products from different manufacturers.PAU-BU Sciences (644452103) / SudocSudocFranceF

Détermination de l'origine géographique et du millésime des vins

La recherche d'une méthode d'authentification des vins a conduit à l'exploration de divers types d'analyses : éléments minéraux, rapports isotopiques, composés polyphénoliques mais aussi à la mise au point de méthodes analytiques : RMN 2D et ICP-MS. Les premières investigations réalisées ont concerné les éléments minéraux du vin. La méthode d'analyse multiélémentaire nous a permis d'une part d'évaluer l'effet de l'utilisation de bentonites sur le contenu minéral des vins et d'autre part de tester les capacités de l'analyse multiélémentaire dans la différenciation et l'authentification des vins. Une méthode rapide, juste et précise de mesure des rapports isotopiques du plomb et du strontium par ICP-MS à secteur magnétique et multicollecteur est présentée. L'utilisation de ces rapports pour réaliser l'authentification d'un vin est discutée. L'analyse d'un extrait polyphénolique de vin par RMN à deux dimensions (HMBC-GAS) a montré que les composés polyphénoliques du vin représentant à la fois le patrimoine génétique de la vigne et les conditions de maturation du raisin. Par cette méthode l'authentification complète de vins a été réalisée.The aim of this work was wine authentication. Trace and ultra trace minerals, strontium and lead isotopes ratio, phenolic composition of wine were studied. Several analytical technics were used : ICP-MS with three different type of analysers and heteronuclear 2D NMR. Trace and ultra trace minerals were measured by ICP-MS an adapted method was used to measure mineral enrichment due to bentonites treatment during vinification. Concentration values obtained for a collection of wines allowed to test the capacity of minerals to perform wine differenciation and authentication. Rapid, precise and accurate measurement of lead and strontium isotope ratios in wine by inductively coupled plasma sector field multicollector mass spectrometry is presented. The use of lead or strontium isotope ratio to determine wine origin is discussed. Phenolic wine extracts were prepared and analysed by 2D NMR (HMBC-GAS). Data analysis applied to NMR data allowed complete wine authentication from variety to origin and vintage. Phenolic compounds were found to be representative of plant genetics, and of growing conditions of vine and grapes.PAU-BU Sciences (644452103) / SudocSudocFranceF

Approches analytiques pour la quantification par spectrométrie de masse élémentaire et moléculaire du sélénium total, des acides aminés et métabolites séléniés dans les matériaux biologiques.

La thèse présente des solutions et des développements concernant l'analyse d'échantillons biologiques pour la détermination du sélénium total et de ses formes chimiques. Concernant la détermination du sélénium total, l'utilisation du xénon comme gaz de collision non réactif a été proposée pour éliminer les interférences polyatomiques pour la détection en ICP MS. Ceci a permis une détermination précise des rapports isotopiques du sélénium sans correction mathématique des interférences. Une méthode utilisant la dilution isotopique a été développée pour la détermination précise du sélénium dans le sérum sanguin. La partie principale de la thèse concerne le développement de méthodes pour la détermination quantitative des sélénométhionine et sélénocystéine dans le sang animal, les tissus mous et le lait. Les méthodes développées sont basées sur la carbamidométhylation quantitative de la sélénocystéine (SeCys) et de la sélénométhionine (SeMet) dans les protéines suivie par la protéolyse. La fraction contenant les deux acides aminés séléniés dérivatisés a été isolée par chromatographie d'exclusion stérique et analysée par HPLC en phase inverse avec appariement d'ions couplée à l'ICP MS. La limite de détection a été de 0.02 g g-1 (matière sèche) pour chacun des deux acides aminés. Quant à la contribution à l'analyse en spéciation des plantes enrichies en sélénium, le travail propose le développement d'un schéma de l'extraction séquentielle permettant le recouvrement du sélénium de l'ail et une stratégie analytique générique pour l'identification de métabolites séléniés de faibles poids moléculaires sans étalon dans l'analyse d'un extrait aqueux de noix riches en sélénium.The thesis presents methodological developments and solutions to several problems concerning the analysis of biological samples for the concentration of the total selenium and its species. As a contribution to the methodology for the total Se determination, the use of Xe as a non-reactive collision gas was proposed to eliminate the polyatomic interferences in Se detection by ICP MS. This allowed anaccurate determination of Se isotope ratios without mathematical correction. The principal part of the thesis concerns the development of methods for the quantitative determination of the Se-aminoacids (selenomethionine (SeMet), selenocysteine (Secys)) in animal blood, soft tissues and milk. The methods developed are based on the quantitative carbamidomethylation of SeCys and SeMet followed by their proteolytic release from proteins. The fraction isolated by size-exclusion chromatography was submitted to ion-paring HPLC - ICP MS analysis. In terms of contribution to speciation analysis of Se-rich plants, the work proposes a sequential extraction scheme allowing the recovery of Se from garlic. Se in Se-enriched garlic was fractionated by a sequential procedure including leaching with water, lysis, proteolysis, leaching with HCI, sulfite and CS and, finally, digestion of the residue. A strategy for the standardless identification of unknown water-soluble low-molecular weight Se metabolites by molecular mass spectrometry is pursued for monkeypot nuts. The use of size-exclusion, cation-exchange and ion-paring reversed-phase HPLC allowed the purification of selenocystathionine and its y-glutamyl-derivatives to a degree allowing their formal identification by organic mass spectrometry.PAU-BU Sciences (644452103) / SudocSudocFranceF

Détection et identification de sélénoprotéines par électrophorèse sur gel associée aux spectrométries de masse atomique et moléculaire.

Le sélénium est un élément trace connu pour son caractère essentiel au développement de nombreux organismes vivants mais également pour ses effets bénéfiques sur la santé humaine. Les recherches effectuées ces cinq dernières années ont renforcé l idée que ces propriétés seraient dues à la synthèse de sélénoprotéines chez les êtres vivants. Les méthodes classiques d analyse protéomique ne sont pas adaptées à l identification ciblée de ces sélénoprotéines très minoritaires. Les travaux de cette thèse ont consisté à développer des méthodes complémentaires plus spécifiques et sensibles en vue de leur détection et de leur identification. Un étalon protéique sélénié stable a été produit pour développer ces méthodes. Le couplage de l ablation laser et de la spectrométrie de masse couplée à un plasma induit (LA-ICP-MS) a été mis en oeuvre pour la détection des sélénoprotéines après une séparation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). Le dispositif d ablation laser conventionnel a ici été amélioré avec un laser femtoseconde à balayage très rapide permettant une détection plus sensible des sélénoprotéines dans les échantillons biologiques. Une fois détectées, les sélénoprotéines ont été identifiées en spectrométrie de masse moléculaire. Pour cela les sélénopeptides issus de la digestion enzymatique des sélénoprotéines sont d abord repérés en nanochromatographie couplée à l ICP-MS puis séquencés en nanochromatographie couplée à la spectrométrie de masse en tandem à ionisation électrospray (nanoHPLC-ESI-MS/MS). La procédure en LA-ICP-MS développée a notamment permis la détection de nouvelles sélénoprotéines chez la bactérie Desulfococcus multivorans. La procédure d identification a été validée sur deux sélénoprotéines purifiées thiorédoxine réductase et glutathione peroxydase carboxyméthylée. La méthodologie développée contribuera à l identification de nouvelles sélénoprotéines pour une meilleure compréhension des rôles physiologiques de ces molécules chez de nombreux êtres vivants.Selenium is a trace element known for its necessity in organisms development and its beneficial roles in human health. Research in the past five years strengthened the idea that these properties are largely due to the synthesis of selenoproteins in living organisms. Classical methods in proteomics are not adapted to identify minor selenoproteins. In this PhD work, more sensitive and more specific methods complementary to proteomics have been developed for their detection and identification. A stable selenized protein standard has been produced to develop these methods. The development of laser ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass spectrometry coupling (LA-ICP-MS) lead to the detection of selenoproteins after separation by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conventional device of laser ablation has been used and then improved with a new device using femtoseconde laser with ultrafast scanning for more sensitive detection of selenoproteins in biological samples. Once detected, selenoproteins have been identified by molecular mass spectrometry. For this purpose selenopeptids from enzymatic digestion of selenoproteins have been detected first by nanochromatography coupled to ICP-MS and sequenced then by means of by nanochromatography coupled to electrospray ionisation tandem mass spectrometry (nanoHPLC-ESI-MS/MS). LA-ICP-MS device has been successful for detection of new selenoproteins in Desulfococcus multivorans bacteria. This identification procedure has been validated on two purified selenoproteins thioredoxin reductase and carboxymathylated glutathion peroxidase. This developed methodology will lead to identification of selenoproteins and a better understanding of the physiological role of these molecules in numerous living organisms.PAU-BU Sciences (644452103) / SudocSudocFranceF

Nickel Nanoparticles Induce the Synthesis of a Tumor-Related Polypeptide in Human Epidermal Keratinocytes

Although nickel allergy and carcinogenicity are well known, their molecular mechanisms are still uncertain, thus demanding studies at the molecular level. The nickel carcinogenicity is known to be dependent on the chemical form of nickel, since only certain nickel compounds can enter the cell. This study investigates, for the first time, the cytotoxicity, cellular uptake, and molecular targets of nickel nanoparticles (NiNPs) in human skin cells in comparison with other chemical forms of nickel. The dose-response curve that was obtained for NiNPs in the cytotoxicity assays showed a linear behavior typical of genotoxic carcinogens. The exposure of keratinocytes to NiNPs leads to the release of Ni2+ ions and its accumulation in the cytosol. A 6 kDa nickel-binding molecule was found to be synthesized by cells exposed to NiNPs at a dose corresponding to medium mortality. This molecule was identified to be tumor-related p63-regulated gene 1 protein