Antibodies and cellular receptors interaction with the immunodominant antigenic site of the capsid of FMD virus: a computational study

La Fiebre aftosa (FA) es una de las principales enfermedades de origen viral que afecta muchas especies de animales domésticos y salvajes con pezuña hendida. La misma, no solo perjudica a los productores dueños de los rodeos sino que, a nivel global, ocasiona gastos y pérdidas económicas millonarias debido al costo de los programas de control y a las restricciones que se imponen en el comercio internacional. El agente etiológico es el virus de la fiebre aftosa (VFA) y su principal vía de entrada a la célula huésped es mediada por la interacción con receptores de membrana tipo integrinas (Ig). Fundamentalmente, el control del VFA es mediado por anticuerpos neutralizantes que reconocen regiones claves del virus como el referido sitio de interacción con las integrinas, en donde el motivo RGD (arginina-glicina-aspartato) resulta esencial. Toda esta región viral conforma el sitio antigénico inmunodominante que se ha denominado sitio A. Las interacciones VFA/Ac y VFA/Ig han sido estudiadas por difracción de cristales y caracterizadas a nivel cuasi-atómico para algunos complejos en particular, pero no existen investigaciones que extrapolen esta información hacia otros aislamientos del VFA, anticuerpos o integrinas de interés. A la vez, las frecuentes variaciones nucleotídicas en el genoma de un virus de ARN como el VFA, determinan una composición aminoacídica también variable que afecta en particular a las proteínas virales estructurales y sus sitios de contacto con los anticuerpos. Los elementos referidos sustentan la relevancia de las investigaciones centradas en la formalización y modelización de estos fenómenos de interacción para complejos entre Ac y otros VFA, posibilitando la generación de conocimiento que resultará de utilidad para el diseño de mejores antígenos y vacunas, así como para la comprensión de los elementos que determinan la especificidad de reconocimiento virus/célula en el modelo del VFA. En esta tesis evaluamos la efectividad de múltiples herramientas de diseño computacional, con diferentes simplificaciones físico-químicas, para modelizar los fenómenos de reconocimiento entre Ag del VFA de serotipo C y anticuerpos, y su variación ante las mutaciones del antígeno. Trabajamos con un primer conjunto de complejos de interacción, disponibles en el repositorio público de datos de estructura (PDB), entre dos Ac de referencia y variantes de un péptido que representa al sitio A del VFA. Modelizamos molecularmente todas las mutaciones puntuales posibles en todos los residuos aminoacídicos del referido péptido antigénico viral y generamos un perfil computacional de la influencia de estas mutaciones en la energía de interacción Ag/Ac. Realizamos además, modelizaciones del antígeno de cepas del VFA con mutaciones en múltiples residuos aminoacídicos representativas de brotes y aislamientos a campo, y obtuvimos una predicción de la interacción de estas variantes antigénicas con los referidos Ac monoclonales. Los resultados emergentes de esta etapa soportan la utilización de aquellos métodos computacionales, que hacen eje en las optimizaciones de las cadenas laterales y el uso de conjuntos de complejos de interacción como molde, para predecir la interacción Ag-Ac. En una 2da etapa clonamos la secuencia codificante de otros 2 Ac monoclonales obtenidos en Argentina que reconocen un sitio A similar pero del VFA A24 Cruzeiro, perteneciente al serotipo A. Para estos anticuerpos implementamos un protocolo de modelado de su estructura molecular y de su interacción con el Ag viral asistidos por la información de los perfiles mutacionales obtenidos en ensayos de ELISA con péptidos con mutaciones puntuales y de información bibliográfica. Por medio de estos resultados de ELISA desarrollamos un mapa diferencial y fino del epítopo funcional para Ac monoclonales anti serotipo A. Finalmente, trabajamos en las interacciones virus/integrinas y mediante las herramientas computacionales descritas, caracterizamos la estructura de dichos complejo de interacción y recapitulamos específicamente sobre los elementos de secuencia y estructura que determinan la especificidad de las integrinas bovinas por elmotivo RGD en el contexto aminoacídico viral. Este trabajo nos permitió detectar potenciales elementos claves en la especificidad de las integrinas αVβ6 por sus ligandos. Este trabajo de tesis demuestra la pertinencia y aplicabilidad de técnicas computacionales de predicción y modelado de la estructura y el acople molecular en fenómenos de interacción entre el sitio inmunodominante del VFA y moléculas del huésped como anticuerpos e integrinas.Foot-and-mouth disease (FMD) is one of the major animal diseases affecting many domestic and wild cloven-hoofed species. FMD not only affect stock farmers but, globally, causes loss of millions of dollars in economic expenses, control programs and the restrictions it imposes on international trade. Its etiologic agent is the foot-and- mouth disease virus (FMDV), whose main entry to the host cells is through the interaction with integrin (Ig)-like membrane receptors. The FMDV control is mainly exerted by neutralizing antibodies that recognize functional-relevant viral regions. Specifically, the major target for neutralizing antibodies lays in the vicinity of the viral recognition site for the integrins, the RGD motif of the immunodominant antigenic site called A. The FMDV/Ab and FMDV/Ig had been studied by crystal diffraction methods and characterized at a quasi-atomic level for some specific complexes, but there are no investigations that extrapolate this information to other FMDV strains, antibodies or integrins of interest. Furthermore, FMDV displays a high mutation rate, typical from RNA virus, which is often translated into structural protein amino acid changes affecting antibodies contact sites. These elements support the relevance of pursuing the formalization and modeling this phenomenon in order to study and generalize them from a structural biology point of view. This knowledge will be useful for better antigen (Ag) and vaccines design as well as the understanding of virus/cell specificity determinants in the FMDV model. In this thesis, we have evaluated the effectiveness of multiple computational programs with different physical-chemical simplifications to model the recognition phenomena between site A antigens of FMDV of serotype C and monoclonal antibodies (mAbs), and their variation facing Ag mutational changes. Initially, we worked with two of interaction complexes, available in the public repository of structure data (PDB), between two different mAbs and their antigenic partner, a FMDV RGD peptide. Specifically, we model all the possible point mutations through all the amino acid residues of the aforementioned viral antigenic peptide and generate a computational profile of the influence of these mutations on the Ag/mAb interaction energy. Secondly, we successfully challenged the computational approaches with a prediction experiment; by means of modeling multiple amino acid mutations representative of FMDV outbreaks and field isolates interacting with the referred mAbs. The emerging data from this module showed a good correlation between previous published experimental data and predictions produced in this work. These results supported the feasibility of using computational methods with foundations in the optimizations of the side chains and the use of an ensemble of interaction complexes as an input for the Ag/Ab interaction modeling pipeline. In a second module, we cloned the coding sequence of further two mAbs obtained in Argentina that also recognize and neutralize site A epitopes, mainly from serotype A FMDV (A24 Cruzeiro ). For these antibodies, we implemented a protocol for modeling their molecular structure as well as their interaction with viral Ag, assisted by the information of the mutational profiles obtained by us in peptide ELISA tests and bibliographic information. By means of the ELISA results we developed a differential and fine map of the functional epitope for those mAbs. Finally, we work on integrin/site A interactions using the computational tools previously described and recapitulate over published structural data for human integrins, which allowed us to detect potentially new key integrin specificity position for its ligands. We also model several bovine integrins molecules in complex with a viral RGD peptide and characterized it concerning the integrin ́s specificity determinants by the RGD motif in the viral amino acid context. This work demonstrates the relevance and applicability of the computational prediction techniques on molecular structure modeling and molecular docking in the interaction phenomena between the FMDV immunodominant site A and biotechnologically relevant host molecules, antibodies and integrins.Fil: Marrero Díaz de Villegas, Rubén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Antibodies and cellular receptors interaction with the immunodominant antigenic site of the capsid of FMD virus: a computational study

La Fiebre aftosa (FA) es una de las principales enfermedades de origen viral que afecta muchas especies de animales domésticos y salvajes con pezuña hendida. La misma, no solo perjudica a los productores dueños de los rodeos sino que, a nivel global, ocasiona gastos y pérdidas económicas millonarias debido al costo de los programas de control y a las restricciones que se imponen en el comercio internacional. El agente etiológico es el virus de la fiebre aftosa (VFA) y su principal vía de entrada a la célula huésped es mediada por la interacción con receptores de membrana tipo integrinas (Ig). Fundamentalmente, el control del VFA es mediado por anticuerpos neutralizantes que reconocen regiones claves del virus como el referido sitio de interacción con las integrinas, en donde el motivo RGD (arginina-glicina-aspartato) resulta esencial. Toda esta región viral conforma el sitio antigénico inmunodominante que se ha denominado sitio A. Las interacciones VFA/Ac y VFA/Ig han sido estudiadas por difracción de cristales y caracterizadas a nivel cuasi-atómico para algunos complejos en particular, pero no existen investigaciones que extrapolen esta información hacia otros aislamientos del VFA, anticuerpos o integrinas de interés. A la vez, las frecuentes variaciones nucleotídicas en el genoma de un virus de ARN como el VFA, determinan una composición aminoacídica también variable que afecta en particular a las proteínas virales estructurales y sus sitios de contacto con los anticuerpos. Los elementos referidos sustentan la relevancia de las investigaciones centradas en la formalización y modelización de estos fenómenos de interacción para complejos entre Ac y otros VFA, posibilitando la generación de conocimiento que resultará de utilidad para el diseño de mejores antígenos y vacunas, así como para la comprensión de los elementos que determinan la especificidad de reconocimiento virus/célula en el modelo del VFA. En esta tesis evaluamos la efectividad de múltiples herramientas de diseño computacional, con diferentes simplificaciones físico-químicas, para modelizar los fenómenos de reconocimiento entre Ag del VFA de serotipo C y anticuerpos, y su variación ante las mutaciones del antígeno. Trabajamos con un primer conjunto de complejos de interacción, disponibles en el repositorio público de datos de estructura (PDB), entre dos Ac de referencia y variantes de un péptido que representa al sitio A del VFA. Modelizamos molecularmente todas las mutaciones puntuales posibles en todos los residuos aminoacídicos del referido péptido antigénico viral y generamos un perfil computacional de la influencia de estas mutaciones en la energía de interacción Ag/Ac. Realizamos además, modelizaciones del antígeno de cepas del VFA con mutaciones en múltiples residuos aminoacídicos representativas de brotes y aislamientos a campo, y obtuvimos una predicción de la interacción de estas variantes antigénicas con los referidos Ac monoclonales. Los resultados emergentes de esta etapa soportan la utilización de aquellos métodos computacionales, que hacen eje en las optimizaciones de las cadenas laterales y el uso de conjuntos de complejos de interacción como molde, para predecir la interacción Ag-Ac. En una 2da etapa clonamos la secuencia codificante de otros 2 Ac monoclonales obtenidos en Argentina que reconocen un sitio A similar pero del VFA A24 Cruzeiro, perteneciente al serotipo A. Para estos anticuerpos implementamos un protocolo de modelado de su estructura molecular y de su interacción con el Ag viral asistidos por la información de los perfiles mutacionales obtenidos en ensayos de ELISA con péptidos con mutaciones puntuales y de información bibliográfica. Por medio de estos resultados de ELISA desarrollamos un mapa diferencial y fino del epítopo funcional para Ac monoclonales anti serotipo A. Finalmente, trabajamos en las interacciones virus/integrinas y mediante las herramientas computacionales descritas, caracterizamos la estructura de dichos complejo de interacción y recapitulamos específicamente sobre los elementos de secuencia y estructura que determinan la especificidad de las integrinas bovinas por elmotivo RGD en el contexto aminoacídico viral. Este trabajo nos permitió detectar potenciales elementos claves en la especificidad de las integrinas αVβ6 por sus ligandos. Este trabajo de tesis demuestra la pertinencia y aplicabilidad de técnicas computacionales de predicción y modelado de la estructura y el acople molecular en fenómenos de interacción entre el sitio inmunodominante del VFA y moléculas del huésped como anticuerpos e integrinas.Foot-and-mouth disease (FMD) is one of the major animal diseases affecting many domestic and wild cloven-hoofed species. FMD not only affect stock farmers but, globally, causes loss of millions of dollars in economic expenses, control programs and the restrictions it imposes on international trade. Its etiologic agent is the foot-and- mouth disease virus (FMDV), whose main entry to the host cells is through the interaction with integrin (Ig)-like membrane receptors. The FMDV control is mainly exerted by neutralizing antibodies that recognize functional-relevant viral regions. Specifically, the major target for neutralizing antibodies lays in the vicinity of the viral recognition site for the integrins, the RGD motif of the immunodominant antigenic site called A. The FMDV/Ab and FMDV/Ig had been studied by crystal diffraction methods and characterized at a quasi-atomic level for some specific complexes, but there are no investigations that extrapolate this information to other FMDV strains, antibodies or integrins of interest. Furthermore, FMDV displays a high mutation rate, typical from RNA virus, which is often translated into structural protein amino acid changes affecting antibodies contact sites. These elements support the relevance of pursuing the formalization and modeling this phenomenon in order to study and generalize them from a structural biology point of view. This knowledge will be useful for better antigen (Ag) and vaccines design as well as the understanding of virus/cell specificity determinants in the FMDV model. In this thesis, we have evaluated the effectiveness of multiple computational programs with different physical-chemical simplifications to model the recognition phenomena between site A antigens of FMDV of serotype C and monoclonal antibodies (mAbs), and their variation facing Ag mutational changes. Initially, we worked with two of interaction complexes, available in the public repository of structure data (PDB), between two different mAbs and their antigenic partner, a FMDV RGD peptide. Specifically, we model all the possible point mutations through all the amino acid residues of the aforementioned viral antigenic peptide and generate a computational profile of the influence of these mutations on the Ag/mAb interaction energy. Secondly, we successfully challenged the computational approaches with a prediction experiment; by means of modeling multiple amino acid mutations representative of FMDV outbreaks and field isolates interacting with the referred mAbs. The emerging data from this module showed a good correlation between previous published experimental data and predictions produced in this work. These results supported the feasibility of using computational methods with foundations in the optimizations of the side chains and the use of an ensemble of interaction complexes as an input for the Ag/Ab interaction modeling pipeline. In a second module, we cloned the coding sequence of further two mAbs obtained in Argentina that also recognize and neutralize site A epitopes, mainly from serotype A FMDV (A24 Cruzeiro ). For these antibodies, we implemented a protocol for modeling their molecular structure as well as their interaction with viral Ag, assisted by the information of the mutational profiles obtained by us in peptide ELISA tests and bibliographic information. By means of the ELISA results we developed a differential and fine map of the functional epitope for those mAbs. Finally, we work on integrin/site A interactions using the computational tools previously described and recapitulate over published structural data for human integrins, which allowed us to detect potentially new key integrin specificity position for its ligands. We also model several bovine integrins molecules in complex with a viral RGD peptide and characterized it concerning the integrin ́s specificity determinants by the RGD motif in the viral amino acid context. This work demonstrates the relevance and applicability of the computational prediction techniques on molecular structure modeling and molecular docking in the interaction phenomena between the FMDV immunodominant site A and biotechnologically relevant host molecules, antibodies and integrins.Fil: Marrero Díaz de Villegas, Rubén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

EcXyl43 β-xylosidase: molecular modeling, activity on natural and artificial substrates, and synergism with endoxylanases for lignocellulose deconstruction

Biomass hydrolysis constitutes a bottleneck for the biotransformation of lignocellulosic residues into bioethanol and high-value products. The efficient deconstruction of polysaccharides to fermentable sugars requires multiple enzymes acting concertedly. GH43 β-xylosidases are among the most interesting enzymes involved in hemicellulose deconstruction into xylose. In this work, the structural and functional properties of β-xylosidase EcXyl43 from Enterobacter sp. were thoroughly characterized. Molecular modeling suggested a 3D structure formed by a conserved N-terminal catalytic domain linked to an ancillary C-terminal domain. Both domains resulted essential for enzymatic activity, and the role of critical residues, from the catalytic and the ancillary modules, was confirmed by mutagenesis. EcXyl43 presented β-xylosidase activity towards natural and artificial substrates while arabinofuranosidase activity was only detected on nitrophenyl α-L-arabinofuranoside (pNPA). It hydrolyzed xylobiose and purified xylooligosaccharides (XOS), up to degree of polymerization 6, with higher activity towards longer XOS. Low levels of activity on commercial xylan were also observed, mainly on the soluble fraction. The addition of EcXyl43 to GH10 and GH11 endoxylanases increased the release of xylose from xylan and pre-treated wheat straw. Additionally, EcXyl43 exhibited high efficiency and thermal stability under its optimal conditions (40 °C, pH 6.5), with a half-life of 58 h. Therefore, this enzyme could be a suitable additive for hemicellulases in long-term hydrolysis reactions. Because of its moderate inhibition by monomeric sugars but its high inhibition by ethanol, EcXyl43 could be particularly more useful in separate hydrolysis and fermentation (SHF) than in simultaneous saccharification and co-fermentation (SSCF) or consolidated bioprocessing (CBP).Fil: Ontañon, Ornella Mailén. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Ghio, Silvina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación de Recursos Naturales. Instituto de Suelos; ArgentinaFil: Marrero Díaz de Villegas, Rubén. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Piccinni, Florencia Elizabeth. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Talia, Paola Monica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Cerutti, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Campos, Eleonora. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Paenibacillus sp. A59 GH10 and GH11 Extracellular Endoxylanases: Application in Biomass Bioconversion

The cost-efficient degradation of xylan to fermentable sugars is of particular interest in second generation bioethanol production, feed, food, and pulp and paper industries. Multiple potentially secreted enzymes involved in polysaccharide deconstruction are encoded in the genome of Paenibacillus sp. A59, a xylanolytic soil bacterium, such as three endoxylanases, seven GH43 β-xylosidases, and two GH30 glucuronoxylanases. In secretome analysis of xylan cultures, ten glycoside hydrolases were identified, including the three predicted endoxylanases, confirming their active role. The two uni-modular xylanases, a 32-KDa GH10 and a 20-KDa GH11, were recombinantly expressed and their activity on xylan was confirmed (106 and 85 IU/mg, respectively), with differences in their activity pattern. Both endoxylanases released mainly xylobiose (X2) and xylotriose (X3) from xylan and pre-treated biomasses (wheat straw, barley straw, and sweet corn cob), although only rGH10XynA released xylose (X1). rGH10XynA presented optimal conditions at pH 6, with thermal stability at 45?50 °C, while rGH11XynB showed activity in a wider range of pH, from 5 to 9, and was thermostable only at 45 °C. Moreover, GH11XynB presented sigmoidal kinetics on xylan, indicating possible cooperative binding, which was further supported by the structural model. This study provides a detailed analysis of the complete set of carbohydrate-active enzymes encoded in Paenibacillus sp. A59 genome and those effectively implicated in hemicellulose hydrolysis, contributing to understanding the mechanisms necessary for the bioconversion of this polysaccharide. Moreover, the two main free secreted xylanases, rGH10XynA and rGH11XynB, were fully characterized, supporting their potential application in industrial bioprocesses on lignocellulosic biomass.Fil: Ghio, Silvina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación de Recursos Naturales. Instituto de Suelos; ArgentinaFil: Ontañon, Ornella Mailén. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Piccinni, Florencia Elizabeth. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Marrero Díaz de Villegas, Rubén. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Talia, Paola Monica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Grasso, Daniel Hector. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación de Recursos Naturales. Instituto de Suelos; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; ArgentinaFil: Campos, Eleonora. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentin