CXCR3 Antagonism of SDF-1(5-67) Restores Trabecular Function and Prevents Retinal Neurodegeneration in a Rat Model of Ocular Hypertension

Glaucoma, the most common cause of irreversible blindness, is a neuropathy commonly initiated by pathological ocular hypertension due to unknown mechanisms of trabecular meshwork degeneration. Current antiglaucoma therapy does not target the causal trabecular pathology, which may explain why treatment failure is often observed. Here we show that the chemokine CXCL12, its truncated form SDF-1(5-67), and the receptors CXCR4 and CXCR3 are expressed in human glaucomatous trabecular tissue and a human trabecular cell line. SDF-1(5-67) is produced under the control of matrix metallo-proteinases, TNF-α, and TGF-β2, factors known to be involved in glaucoma. CXCL12 protects in vitro trabecular cells from apoptotic death via CXCR4 whereas SDF-1(5-67) induces apoptosis through CXCR3 and caspase activation. Ocular administration of SDF-1(5-67) in the rat increases intraocular pressure. In contrast, administration of a selective CXCR3 antagonist in a rat model of ocular hypertension decreases intraocular pressure, prevents retinal neurodegeneration, and preserves visual function. The protective effect of CXCR3 antagonism is related to restoration of the trabecular function. These data demonstrate that proteolytic cleavage of CXCL12 is involved in trabecular pathophysiology, and that local administration of a selective CXCR3 antagonist may be a beneficial therapeutic strategy for treating ocular hypertension and subsequent retinal degeneration

Etude de l'expression neuronale des chémokines de la famille CXC (Stromal cell-Derived Factor-1) et CC (Monocyte Chemoattractant Protein-1) et de leur récepteur dans le système nerveux central (implications possibles dans les fonctions cérébrales et neuroendocriniennes)

Bien que les chémokines et leurs récepteurs aient été identifiés et bien étudiés dans le système immunitaire, récemment il a été suggéré qu'elles joueraient aussi un rôle dans le système nerveux central (SNC). L'établissement d'une cartographie précise des chémokines/récepteurs dans le SNC nous a semblé une étape essentielle à la compréhension de leurs effets centraux. Ainsi, le présent travail a eu pour but d'établir chez le rat, une cartographie détaillée de la distribution neuroanatomique des chémokines/récepteurs. Nos études ont porté sur les chémokines Stromal cell-Derived Factor-1 (SDF-1) et Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) et leur récepteur respectif CXCR4 et CCR2. Tout d'abord, nous avons démontré par autoradiographie quantitative que les sites de liaison du [125]SDF-1 sont distribué de manière homogène dans le cerveau, alors que des sites de liaison du [125]MCP-1 ont une nette régionalisation. Ensuite nous avons établi, par immunohistochimie en fluorescence, que les récepteurs CXCR4, CCR2 ainsi que leur ligands sont exprimés de manière constitutive par les neurones, au niveau des structures neuroanatomiques précises. Par ailleurs, nous avons clairement établi que ces chémokines/récepteurs sont exprimés par les neurones cholinergiques et dopaminergiques. SDF-1, MCP-1 et CXCR4 sont aussi co-localisés avec la vasopressine dans noyaux supraoptiques (SON) et paraventriculaires (PVN) de l'hypothalamus et avec la MCH (melanin concentrating hormone) dans l'hypothalamus latéral. Nous avons aussi mis en évidence la présence du MCP-1 au niveau des trajets vasopressinergiques, de la couche interne de l'éminence médiane et de la neurohypophyse. Au cours d'une déshydratation, nous avons montré une nette diminution de l'expression du MCP-1 et du CXCR4 au niveau du PVN et du SON. L'ensemble des résultats originaux obtenus au cours de cette thèse nous a permis d'ouvrir un champ de recherche nouveau concernant les fonctions neuromodulatrices des chémokines.Besides their well-established role in the immune system, chemokines play a role in physiological and pathological brain functions. Knowledge of cellular and regional distribution of chemokines and their receptors in the brain is essential to further understand their cerebral functions. The aim of this study was to establish a detailed neuroanatomical mapping of chemokine and their receptors in rat brain. We focused on chemokines Stromal cell-Derived Factor-1 (SDF-1) and Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1) and their receptors CXCR4 and CCR2 respectively. Firstly, by quantitative autoradiography we demonstrated that [125]SDF-1 binding sites were almost uniformly distributed throughout the brain. In contrast, [125]MCP-1 binding sites were highly regionalized in precise neuroanatomical structures. Furthermore, by dual immunohistochemistry we provide evidence that both of these chemokine/receptor couples were constitutively expressed by neurons in neuroanatomical structures such as cerebral cortex, substantia innominata, hypothalamic nuclei, substantia nigra and motoneurons. We demonstrated for the first time that SDF-1, CXCR4, MCP-1 and CCR2 were expressed in cholinergic and dopaminergic neurons. We also provide evidence that SDF-1, CXCR4 and MCP-1 colocalized with vasopressin in magnocellular neurons of supraoptic (SON) and paraventricular (PVN) hypothalamic nuclei. MCP-1-immunoreactivity was also observed in vasopressinergic processes projecting from magnocellular neurons, internal layer of eminence median and posterior pituitary; suggesting that MCP-1 might be a neurosecretory chemokine. In dehydrated rat, MCP-1 and CXCR4 expression decreased in both SON and PVN. Interestingly, in the lateral hypothalamus SDF-1, CXCR4 and MCP-1 colocalized with MCH-expressing neurons. Altogether, original results obtained here open up a new field of research on neuromodulatory functions of chemokines and suggest their implication in regulation of neuroendocrine functions.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Rôle des chimiokines CX3CL1/FKN et CXCL12/SDF-1 dans la physiopathologie du segment antérieur de l'oeil

Dans le glaucome (GPAO), la dégénérescence du nerf optique est associée à une augmentation de la pression intraoculaire (PIO) causée par la dégénérescence du trabéculum. Nous avons montré que cette chimiokine et son récepteur CX3CR1 sont exprimés au niveau de trabéculums de patients ainsi que dans une lignée humaine trabéculaire. Nous avons montré in vitro que cette chimiokine est impliquée dans la prolifération et la migration des cellules trabéculaires. Les propriétés chimio-attractantes de CX3CL1 nous ont conduits à étudier son implication dans l infiltration leucocytaire de la conjonctive. Nous avons montré que les cellules conjonctivales de patients exposés au chlorure de benzalkonium (BAK), un conservateur toxique des collyres, surexpriment CX3CL1. Des expériences in vitro sur des lignées humaines conjonctivales et in vivo sur des souris témoins et déficientes pour le récepteur CX3CR1 ont montré que CX3CL1, en présence de BAK, induit une infiltration de certains phénotypes leucocytaires. De plus, nous avons montré que des trabéculums humains ainsi qu une lignée cellulaire trabéculaire in vitro expriment CXCL12 et sa forme tronquée, le SDF-1(5-67). Des études in vitro ont mis en évidence le rôle protecteur de CXCL12 via le récepteur CXCR4, ainsi que l action délétère de SDF-1(5-67) via le récepteur CXCR3. Nous avons montré in vivo sur des rats témoins et des rats rendus hypertones par chirurgie que SDF-1(5-67) est responsable d une augmentation de la PIO et que le blocage de CXCR3 permet une restauration de la filtration trabéculaire. Ces trois études mettent en évidence l existence d un système chimiokinergique qui participe à la physiopathologie du GPAOIn primary open-angle glaucoma (POAG), retinal nerve degeneration is associated with pathological ocular hypertension (OHT) due to the degeneration of the trabeculum. We showed that human trabeculum obtained by surgery from glaucomatous patients and a human trabecular cell line express CX3CL1 and its receptor CX3CR1. We showed that CX3CL1 enhanced both proliferation and migration of trabecular cells. The chemoattracting abilities of CX3CL1 led us to investigate its implication in the leukocytic infiltration of conjunctival tissue during inflammation. This tissue was exposed to a toxic preservative present in ophthalmic medications: benxalkonium chloride (BAK). We showed that conjunctival cells from patients exposed to BAK overexpress CX3CL1. In vitro experiments on human conjunctival epithelial cell lines demonstrated that CX3CL1, in the presence of BAK, induces a selective attraction of leukocytes subsets. This observation was verified in vivo using CX3CR1-deficient mice as compared to CX3CR1+/+ controls. We identified the expression of both forms CXCL12 and SDF-1(5-67) in human glaucomatous trabecular tissue as well as in HTM cells. We performed in vitro experiments and demonstrated that CXCL12 acts as a protective chemokine via its CXCR4 receptor whereas the processing of CXCL12 into SDF-1(5-67) has a deleterious effect via CXCR3 receptor. We showed that SDF-1(5-67) induces apoptosis via CXCR3. We also demonstrated that in vivo blockade of CXCR3 by a specific antagonist can restore trabecular filtrating function. These three studies present evidence of a chemokinergic system that plays a role in the cellular physiopathology of POAGPARIS-BIUSJ-Biologie recherche (751052107) / SudocSudocFranceF

Rôle des chimiokines CXCL12 et CXCL1 dans la physiopathologie du trabéculum et de la surface oculaire au cours du glaucome

Le glaucome primitif à angle ouvert est une neuropathie optique rétinienne dont le premier facteur de risque, l hypertonie intraoculaire, est causé par une dégénérescence du trabéculum dont les mécanismes demeurent inconnus. Ainsi, les traitements actuels ne ciblent pas la trabéculopathie originelle, ce qui pourrait expliquer leur inefficacité parfois observée. En outre, ces traitements contiennent un conservateur, le chlorure de benzalkonium (BAC), qui est responsable d une inflammation iatrogène de la surface oculaire mise en cause dans l inobservance thérapeutique. Les chimiokines, cytokines initialement décrites du fait de leurs propriétés chimioattractantes, sont également impliquées dans le contrôle de la viabilité cellulaire et du microenvironnement tissulaire. Dans cette thèse, nous démontrons l existence d une balance au niveau trabéculaire entre le système CXCL12/CXCR4 aux effets protecteurs et le système SDF-1(5-67)/CXCR3 proapoptotique. Nous rapportons de façon originale que l utilisation in vivo d un antagoniste non-peptidique spécifique de CXCR3 diminue la pression intraoculaire en restaurant la fonction trabéculaire dans un modèle animal de glaucome. En parallèle, nous révélons que les cellules épithéliales conjonctivales exposées au BAC attirent certaines populations leucocytaires via CX3CL1/CX3CR1, montrant ainsi que ce système est impliqué dans le trafic immunitaire au sein de la surface oculaire. De façon originale, les chimiokines apparaissent comme un système inédit de régulation de l environnement trabéculaire et de la surface oculaire, constituant ainsi de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiquesGlaucoma is the first cause of irreversible blindness in the world. Primary open-angle glaucoma (POAG) mostly combines retinal neuropathy with abnormal elevation of the intraocualar pressure, which is the first risk factor for the disease. Ocular hypertension is caused by a trabecular meshwork degeneration whose primary mecanisms are still unknown. Indeed, the current antiglaucoma treatment does not target the intial trabecular pathology so it is not currative. Moreover, antiglaucoma eye drops often contain a preservative, such as benzalkonium chloride (BAC), which has been demonstrated to cause ocular surface inflammation in glaucomatous patients treated over a long term period. Chemokines, small proteins from the cytokine family, have been first described for their chemotactic properties for leukocytes through their interaction with G protein coupled receptors. Aside from its immune properties, the chemokine CXCL12 is involved in the regulation of cell viability and extracellulare matrix remodelling through its receptor CXCR4. Recently, it has been reported that proteolytic cleavage of CXCL12 yields a proapoptotic form, SDF-1(5-67), acting via another chemokine receptor :CXCR3. In this thesis, CXCL12, CXCR3 and CXCR4 have been detected in trabecular cells in human glaucomatous trabecular tissue and immortalized cell line. We originally describe a balance between the protective system CXCL12/CXCR4 and SDF-1(5-67)/CXCR3 which induces trabecular apoptosis under the control of cytokines and matrix metalloproteinases known to be involved in POAG. We report the sucessful use in vivo of a non-peptide specific antagonist of CXCR3 in reducing ocular hypertension and restoring trabecular function in an animal model of glaucoma, opening up new therapeutic avenues in glaucoma. We also studied the role of another chamokine, CX3CL1, in the ocular surface inflammation induced by BAC. CX3CL1 is charaterized by powerful chemoattract properties on CX3CR1-bearing leukocytes. In this study, we report an overexpression of CX3CL1 in conjunctival epithelial cells in glaucomatous patients treated with a BAC-containing medication. In vitro, we demonstrate that BAC-stimulated conjunctival epithelial cells attract lymphocytic and monocytic subpopulations by producing CX3CL1. In an animal model of BAC-induced ocular toxicity, we report a decrease in macrophage infiltration to the conjunctiva in CX3CR1-deficient mice compared to wild-type animals, further confirming that CX3CL1/CX3CR1 is involved in immune cell trafincking in the ocular surface. Our results originally show that chemokines are involved in the pathophysiology of the anterior segment in glaucoma. Chemokines appear as a new regulating system for the pathogenesis of trabecular degeneration in glaucoma as well as for ocular surface inflammation, and could constitute new specific therapeutic targets in such deleterious diseasesPARIS-BIUSJ-Biologie recherche (751052107) / SudocSudocFranceF

Interaction de la chimiokine SDF-1a/CXCL12 avec le système vasopressinergique

La chimiokine SDF-1a (CXCL12) et son récepteur CXCR4 co-localisent avec l hormone antidiurétique, l arginine vasopressine (AVP) dans l hypothalamus et la neurohypophyse. Au cours de nos études, nous avons établi que : 1) le SDF-1a et l AVP présentent une distribution cellulaire spécifique dans les neurones des noyaux magnocellulaires hypothalamiques et sont localisés dans les mêmes vésicules neurosécrétoires de la neurohypophyse ; 2) le SDF-1a, par l intermédiaire du CXCR4, module l activité électrique du système à AVP et la libération plasmatique d AVP; 3) l expression du couple SDF-1a/CXCR4 est régulée lors de changements dans l équilibre hydrique suite à une déshydratation ou chez des animaux Brattleboro ; animaux déficients en synthèse centrale d AVP. Les données originales obtenues au cours de ce travail ouvrent un axe de recherche novateur dans l implication des chimiokines dans la régulation hydrique et plus généralement dans la régulation des fonctions neuroendocriniennesThe chemokine SDF-1a (CXCL12) and its receptor CXCR4 are co-localized with the antidiuretic hormone arginine vasopressin (AVP) in the hypothalamus and in the posterior pituitary. During our studies we demonstrated that: 1) SDF-1a and AVP present a selective cellular distribution inside the neuronal cell and can be found in the same dense core vesicles in the nerve terminals in the posterior pituitary; 2) SDF-1a can modulate, through CXCR4, the electrical activity of AVP neurons and plasma AVP release; 3) the expression of SDF-1a/CXCR4 is regulated when the hydro-osmotic balance is disturbed as in case of dehydration or in Brattleboro rats ; an endogenous knock-out model for brain AVP deficiency. The original data obtained during this work open new avenues in the implication of chemokines in the water balance regulation and more generally in neuroendocrine functionsPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Les voies dopaminergiques (implication des chimiokines dans les voies dopaminergiques, implication des voies dopaminergiques dans les pathologies du mouvement en orthostatisme)

Ce travail est composé de deux parties avec les voies dopaminergiques (DA) comme fil conducteur. La première partie est consacrée au rôle de la chimiokine CCL2 et de son récepteur CCR2 dans les voies DA. Nous avons montré chez le rat à l état normal que CCL2 active la neurotransmission DA nigrostriée, modifiant le comportement moteur. Nous avons ensuite étudié l'implication de CCL2/CCR2 dans le phénomène de sensibilisation à la cocaïne. Ce phénomène est significativement diminué chez les souris KO CCR2-/-. La modulation d expression du transporteur DA (DAT) par la cocaïne est également altérée chez les souris KO CCR2-/-. Enfin, l activation de ERK dans le striatum est diminuée chez ces souris après injection aigue de cocaïne. Ces résultats suggèrent l implication de CCL2/CCR2 dans des processus à court et à long terme impliquant les voies DA. La seconde partie est consacrée à des études translationelles vers la clinique des voies DA dans les mouvements anormaux en orthostatisme. Nous avons étudié 12 patients présentant un tremblement orthostatique (TO) primaire. Aucun ne présentait de perte DA objectivable à la scintigraphie cérébrale au 123I-FP-CIT (Marqueur du DAT). Ces résultats suggèrent que la perte DA n est pas la règle dans le TO primaire. Enfin, nous avons décrit les mouvements anormaux en orthostatisme observés dans la maladie de Parkinson. Les caractéristiques électrophysiologiques des 11 patients ont permis de définir : un TO rapide, similaire au TO primaire, un TO lent et des myoclonies en orthostatisme.Ces travaux laissent entrevoir des possibilités thérapeutiques nouvelles dans la prise en charge des pathologies impliquant les voies DA.PARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

CX3CL1 is involved in the ocular surface inflammation induced by benzalkonium chloride

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Methylmercury exposure downregulates the expression of Racl and leads to neuritic degeneration and ultimately apoptosis in cerebrocortical neurons

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