Decaprenylphosphoryl-β-D-Ribose 2′-Epimerase, the Target of Benzothiazinones and Dinitrobenzamides, Is an Essential Enzyme in Mycobacterium smegmatis

BACKGROUND: The unique cell wall of bacteria of the suborder Corynebacterineae is essential for the growth and survival of significant human pathogens including Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae. Drug resistance in mycobacteria is an increasingly common development, making identification of new antimicrobials a priority. Recent studies have revealed potent anti-mycobacterial compounds, the benzothiazinones and dinitrobenzamides, active against DprE1, a subunit of decaprenylphosphoribose 2' epimerase which forms decaprenylphosphoryl arabinose, the arabinose donor for mycobacterial cell wall biosynthesis. Despite the exploitation of Mycobacterium smegmatis in the identification of DprE1 as the target of these new antimicrobials and its use in the exploration of mechanisms of resistance, the essentiality of DprE1 in this species has never been examined. Indeed, direct experimental evidence of the essentiality of DprE1 has not been obtained in any species of mycobacterium. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: In this study we constructed a conditional gene knockout strain targeting the ortholog of dprE1 in M. smegmatis, MSMEG_6382. Disruption of the chromosomal copy of MSMEG_6382 was only possible in the presence of a plasmid-encoded copy of MSMEG_6382. Curing of this "rescue" plasmid from the bacterial population resulted in a cessation of growth, demonstrating gene essentiality. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: This study provides the first direct experimental evidence for the essentiality of DprE1 in mycobacteria. The essentiality of DprE1 in M. smegmatis, combined with its conservation in all sequenced mycobacterial genomes, suggests that decaprenylphosphoryl arabinose synthesis is essential in all mycobacteria. Our findings indicate a lack of redundancy in decaprenylphosphoryl arabinose synthesis in M. smegmatis, despite the relatively large coding capacity of this species, and suggest that no alternative arabinose donors for cell wall biosynthesis exist. Overall, this study further validates DprE1 as a promising target for new anti-mycobacterial drugs

Gene regulatory network modeling via global optimization of high-order dynamic Bayesian network

Abstract Background Dynamic Bayesian network (DBN) is among the mainstream approaches for modeling various biological networks, including the gene regulatory network (GRN). Most current methods for learning DBN employ either local search such as hill-climbing, or a meta stochastic global optimization framework such as genetic algorithm or simulated annealing, which are only able to locate sub-optimal solutions. Further, current DBN applications have essentially been limited to small sized networks. Results To overcome the above difficulties, we introduce here a deterministic global optimization based DBN approach for reverse engineering genetic networks from time course gene expression data. For such DBN models that consist only of inter time slice arcs, we show that there exists a polynomial time algorithm for learning the globally optimal network structure. The proposed approach, named GlobalMIT+, employs the recently proposed information theoretic scoring metric named mutual information test (MIT). GlobalMIT+ is able to learn high-order time delayed genetic interactions, which are common to most biological systems. Evaluation of the approach using both synthetic and real data sets, including a 733 cyanobacterial gene expression data set, shows significantly improved performance over other techniques. Conclusions Our studies demonstrate that deterministic global optimization approaches can infer large scale genetic networks

Is there a Relation between Chlamydia Infection and Primary Biliary Cirrhosis?

Over the past two decades, a number of studies have failed to provide direct evidence of specific microbial chronic infection in primary biliary cirrhosis (PBC). However, a recent report suggests that there is a specific association of Chlamydia pneumoniae in patients with PBC and that C. pneumoniae or similar antigens might play a role in the pathogenesis of disease. To determine if Chlamydia infection is associated with PBC, we applied a combination of immunological and molecular approaches to investigate (a) the serological reactivity against two common Chlamydia human pathogens, C. pneumoniae and C. trachomatis, by immunoblotting, (b) the presence of Chlamydia in liver samples of patients with PBC and controls by PCR amplification of Chlamydia specific 16S rRNA and (c) the presence of Chlamydia proteins in liver samples of patients with PBC and controls by immunohistochemical staining. By immunoblotting, C. trachomatis and C. pneumoniae specific serological antibodies were found in 52/57 (91.2%) AMA positive PBC, 7/33 (21/2%) of AMA negative PBC, 1/25 (4%) PSC, 0/15 (0%) Sjorgen's syndrome and 0/20 (0%) systemic lupus erythematosus patients and 0/20 (0%) healthy volunteers at 1:200 sera dilution. PBC sera reacted to Chlamydia and E. coli lysates in western blots up to a maximum of 10-4 dilution. However, PCR amplification of the Chlamydia specific 16S rRNA gene was negative in 25/25 PBC livers but positive in 1/4 PSC liver, 3/6 in other liver disease controls and 1/4 normal liver samples. While two commercially available specific monoclonal antibodies stained positive controls (Chlamydia infected HEp-2 cells) they failed to detect Chlamydia antigens in PBC livers. The detection of Chlamydia specific antibodies but not Chlamydia rRNA gene and Chlamydia antigens in PBC suggests that Chlamydia infection is not involved in PBC

Autoimmune Cholangitis in the SJL/J Mouse is Antigen Non-specific

Primary biliary cirrhosis (PBC) is an autoimmune disease characterized by intrahepatic bile duct destruction and the production of anti-mitochondrial antibodies (AMA). The absence of an animal model has been a striking impedance in defining the molecular basis of disease. Previous work has suggested that SJL/J mice immunize with the pyruvate dehydrogenase complex (PDC-E2), the major mitochondrial autoantigen of PBC, leads to the development of lymphoid cell infiltration in portal tracts and a model system coined autoimmune cholangitis. We hypothesized that this pathology would be augmented if immunization occurred in the presence of IFN-γ injections. Accordingly, SJL/J mice were immunized with PDC-E2 and, for purpose of control, α-casein. Subgroups of mice were also treated with exogenous IFN-γ. As expected, mice immunized with PDC-E2, with or without IFN-γ, developed high titer AMAs. In contrast, mice immunized with α-casein, develop antinuclear antibodies. More importantly, the livers from mice immunized with PDC-E2 and/or those immunized with α-casein all displayed lymphoid cell infiltration to the portal tracts, irrespective of bile duct size. Indeed, there was no significant difference between the experimental and the control groups by histologic analysis. Thus, autoimmune cholangitis in these mice is antigen non-specific

Identification of HLA-A2–restricted CD8+ Cytotoxic T Cell Responses in Primary Biliary Cirrhosis: T Cell Activation Is Augmented by Immune Complexes Cross-Presented by Dendritic Cells

Primary biliary cirrhosis (PBC) is characterized by an intense biliary inflammatory CD4+ and CD8+ T cell response. Very limited information on autoantigen-specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses is available compared with autoreactive CD4+ T cell responses. Using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from PBC, we identified an HLA-A2–restricted CTL epitope of the E2 component of pyruvate dehydrogenase (PDC-E2), the immunodominant mitochondrial autoantigen. This peptide, amino acids 159–167 of PDC-E2, induces specific MHC class I–restricted CD8+ CTL lines from 10/12 HLA-A2+ PBC patients, but not controls, after in vitro stimulation with antigen-pulsed dendritic cells (DCs). PDC-E2–specific CTLs could also be generated by pulsing DCs with full-length recombinant PDC-E2 protein. Furthermore, using soluble PDC-E2 complexed with either PDC-E2–specific human monoclonal antibody or affinity-purified autoantibodies against PDC-E2, the generation of PDC-E2–specific CTLs, occurred at 100-fold and 10-fold less concentration, respectively, compared with soluble antigen alone. Collectively, these data demonstrate that autoantibody, helper, and CTL epitopes all contain a shared peptide sequence. The finding that autoantigen–immune complexes can not only cross-present but also that presentation of the autoantigen is of a higher relative efficiency, for the first time defines a unique role for autoantibodies in the pathogenesis of an autoimmune disease

Insulinresistenz im postprandialen Lipidstoffwechsel bei Metabolischem Syndrom : Untersuchung der Glucosetoleranz nach oraler Fettaufnahme

Das Metabolische Syndrom als Risikocluster von Stoffwechselstörungen spielt bei der Entstehung von atherosklerotischen Gefäßerkrankungen eine zentrale Rolle. Störungen des Glukose- und Triglyzeridstoffwechsels werden dabei häufig gemeinsam beobachtet. Freie Fettsäuren und Insulin werden als Mediatoren im Intermediärstoffwechsel sowohl für physiologische Steuerungsvorgänge als auch für pathologische Veränderungen verantwortlich gemacht. Eine Insulinresistenz kann zur Entwicklung einer Hyperinsulinämie führen, die durch direkte Einwirkung auf die Arterienwand und durch Begünstigung von pathologischen Zuständen, wie Hypertonie und Dyslipoproteinämie, die Atherosklerose unterstützt. Alternative Vorstellungen gehen von einer Störung des Triglyzeridstoffwechsels mit Erhöhung freier Fettsäuren aus, die über eine Reduktion der Glukoseaufnahme der Muskulatur und Beeinflussung von Insulinsekretion und -wirkung zur Insulinresistenz und Hyperinsulinämie führen könnte. Mit der hier vorgestellten Dissertationsarbeit sollte ein Beitrag dazu geleistet werden, einen klinisch anwendbaren Test zur Diagnostik des Triglyzerid- und Glukosemetabolismus zu finden, der die Beobachtung der postprandialen Stoffwechselparameter ermöglicht. Das Augenmerk wurde auf die Konzentrationsverläufe von Glucose, Insulin und freien Fettsäuren gerichtet. Auch wurde der Einfluß klinischer Meßgrößen der Adipositas auf die Stoffwechselparameter beleuchtet. Weiterhin sollte untersucht werden, ob die Veränderungen der postprandialen Glukosetoleranz zwischen gesunden Probanden und Patienten mit angiographisch gesicherter KHK Rückschlüsse auf pathologische Zustände bei koronarer Herzerkrankung und Metabolischem Syndrom zulassen. Hierzu wurde das entwickelte Testverfahren mit je einer Gruppe gesunder Probanden und Patienten, die eine angiographisch gesicherte KHK aufwiesen, durchgeführt. Es wurde die Kombination aus einer Belastung des Probanden mit oral aufgenommenem Fett via naturalis und die eher experimentelle Beobachtung des Kohlenhydratstoffwechsels mittels intravenösem Glukosetoleranztest gewählt. Zur Anwendung kam ein standardisierter intravenöser Glukosetoleranztest nüchtern (Test 1) und 4 Stunden nach oraler Aufnahme (Test 2) einer definierten Triglyzeridemulsion. Die orale Fettgabe führte bei Test 2 zu einem signifikanten Anstieg der Plasmakonzentration der freien Fettsäuren gegenüber Test 1 ohne Fettgabe. Nach Injektion des Glukosebolus und Anstieg des Plasma-Insulins wurde die Fettsäure-Konzentration bei den Probanden während Test 2 signifikant höher unterdrückt als bei Test 1. Die KHK-Patienten erreichten hier keine Zunahme der Unterdrückung der Fettsäurespiegel. Das Verhalten der Insulin- und Glukosekonzentrationen zeigte eine erhöhte Insulinausschüttung nach vorheriger oraler Fettzufuhr (Test 2) in den ersten 30 min des Glukosetoleranztests gegenüber Test 1. Dieser Effekt war in der folgenden Stunde bei den Gesunden nicht mehr nachzuweisen, während die KHK-Patienten auch in der Spätphase eine erhöhte Insulinkonzentration bei Test 2 gegenüber Test 1 zeigten. Die Glukosekonzentrationen blieben weitgehend unverändert in beiden Gruppen. Zusammenhänge der Adipositas mit dem Verlauf der Stoffwechseltests wurden durch die Korrelation von Körpermaßzahlen mit verschiedenen Testablaufparametern untersucht. Als Adipositas-Meßwerte wurden der Body-mass-index, die Waist-to-Hip-Ratio und die Ergebnisse der Bioimpedanzanalyse, welche durch elektrische Hautwiderstandsmessung die Bestimmung des relativen Körperwassergehalts, der Magermasse und des Körperfettanteil ermöglicht, in die Korrelationsrechung eingeschlossen. Hervorzuheben ist eine konstante positive Korrelation der Waist-to-Hip-Ratio mit der glucosestimulierten Insulinkonzentration bei beiden Tests und beiden Gruppen. Diese Ergebnisse deuten auf einen Zusammenhang der Menge des intraabdominalen Fettgewebes mit der Insulinkinetik hin. Die Insulinkonzentration könnte dabei über eine Interaktion einer erhöhten freien Fettsäurekonzentration im Portalblut bei zunehmender Stoffwechselaktivität des intraabdominalen Fettgewebes beeinflußt werden. Die Durchführung der Untersuchung belegte die klinische Anwendbarkeit eines Belastungstestverfahrens zur Beobachtung der Interaktionen des Glukose- und Triglyzerid-stoffwechsels. Die Beobachtung einer Zunahme der glukosestimulierten Insulinkonzentration durch orale Fettgabe deutet darauf hin, daß freie Fettsäuren eine Abnahme der Glukosetoleranz bewirken könnten, die durch eine erhöhte Insulinausschüttung kompensiert wurde. Die Glukosehomöostase wurde dadurch aufrecht erhalten. Das angewendete Testverfahren konnte im Vergleich zwischen Gesunden und KHK-Patienten eine prolongierte Insulinämie zeigen. Diese könnte an der Atherogenese beteiligt sein. Trotz Verlängerung der Insulinämie wurde die Fettsäuresuppression nicht, wie bei den Gesunden Probanden verstärkt, was eine reduzierte Insulinwirksamkeit darstellen könnte. Die Ergebnisse rechtfertigen eine mehr fettstoffwechselbezogene Sichtweise der Pathogenese des Metabolischen Syndroms. Die Messung der Körperkonstitution könnte bei der Risikoabschätzung von Stoffwechselstörungen hilfreich sein. Insbesondere die Messung des intraabdominalen Fettgewebes ist aufgrund der erhöhten Stoffwechselaktivität dabei interessant. Die prospektive Bedeutung solcher Belastungstests müßte anhand größer angelegter Studien mit der Möglichkeit der Bestimmung von Normalbereichen überprüft werden

Autoimmune Cholangitis in the SJL/J Mouse is Antigen Non-specific

Primary biliary cirrhosis (PBC) is an autoimmune disease characterized by intrahepatic bile duct destruction and the production of anti-mitochondrial antibodies (AMA). The absence of an animal model has been a striking impedance in defining the molecular basis of disease. Previous work has suggested that SJL/J mice immunize with the pyruvate dehydrogenase complex (PDC-E2), the major mitochondrial autoantigen of PBC, leads to the development of lymphoid cell infiltration in portal tracts and a model system coined autoimmune cholangitis. We hypothesized that this pathology would be augmented if immunization occurred in the presence of IFN-γ injections. Accordingly, SJL/J mice were immunized with PDC-E2 and, for purpose of control, α-casein. Subgroups of mice were also treated with exogenous IFN-γ. As expected, mice immunized with PDC-E2, with or without IFN-γ, developed high titer AMAs. In contrast, mice immunized with α-casein, develop antinuclear antibodies. More importantly, the livers from mice immunized with PDC-E2 and/or those immunized with α-casein all displayed lymphoid cell infiltration to the portal tracts, irrespective of bile duct size. Indeed, there was no significant difference between the experimental and the control groups by histologic analysis. Thus, autoimmune cholangitis in these mice is antigen non-specific

Interactions between Plasmodium falciparum skeleton-binding protein 1 and the membrane skeleton of malaria-infected red blood cells

During development inside red blood cells (RBCs), Plasmodium falciparum malaria parasites export proteins that associate with the RBC membrane skeleton. These interactions cause profound changes to the biophysical properties of RBCs that underpin the often severe and fatal clinical manifestations of falciparum malaria. P. falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1) is one such exported parasite protein that plays a major role in malaria pathogenesis since its exposure on the parasitised RBC surface mediates their adhesion to vascular endothelium and placental syncytioblasts. En route to the RBC membrane skeleton, PfEMP1 transiently associates with Maurer\u27s clefts (MCs), parasite-derived membranous structures in the RBC cytoplasm. We have previously shown that a resident MC protein, skeleton-binding protein 1 (SBP1), is essential for the placement of PfEMP1 onto the RBC surface and hypothesised that the function of SBP1 may be to target MCs to the RBC membrane. Since this would require additional protein interactions, we set out to identify binding partners for SBP1. Using a combination of approaches, we have defined the region of SBP1 that binds specifically to defined sub-domains of two major components of the RBC membrane skeleton, protein 4.1R and spectrin. We show that these interactions serve as one mechanism to anchor MCs to the RBC membrane skeleton, however, while they appear to be necessary, they are not sufficient for the translocation of PfEMP1 onto the RBC surface. The N-terminal domain of SBP1 that resides within the lumen of MCs clearly plays an essential, but presently unknown role in this process