MicroRNAs in the Functional Defects of Skin Aging

Humankind has always been intrigued by death, as illustrated by the eternal quest for the fountain of youth. Aging is a relentless biological process slowly progressing as life cycle proceeds. Indeed, aging traduces an accumulation of physiological changes over time that render organisms more likely to die. Thus, despite our mastery of advanced technologies and robust medical knowledge, defining the molecular basis of aging to control lifespan is still currently one of the greatest challenges in biology. In mammals, the skin is the ultimate multitasker vital organ, protecting organisms from the world they live in. As a preferential interface with the environment, the skin is reflecting the internal physiological balances. The maintenance of these balances, called homeostasis, depends on the concurrent assimilation of diversified signals at the cellular level. MicroRNAs (miRNAs) are noncoding RNAs that regulate gene expression by mRNAs degradation or translational repression. Their relatively recent discovery in 2000 provided new insights into the understanding of the gene regulatory networks. In this chapter, we focused on the role of three miRNA families, namely miR-30, miR-200, and miR-181, playing a key role in the progression of the skin aging process, with particular input in mechanistic considerations related to autophagy, oxidative stress, and mitochondrial homeostasis

Exosomes or vectors of communication between fibroblasts and keratinocytes : modeling of exchanges in healthy skin and during aging

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des acteurs clés de la communication intercellulaire puisqu’elles permettent le transfert de matériel biologique fonctionnel d’une cellule productrice à une cellule receveuse et peuvent induire des réponses cellulaires. Ces VE sont constituées d’une bicouche lipidique renfermant des protéines, des ARN messagers, des ARN non codants ainsi que des lipides, et sont sécrétées par tous les types cellulaires. Le rôle de ces VE dans différents processus physiologiques et pathologiques a été largement décrit ces dernières années et suscite un intérêt croissant pour le développement de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans le contexte spécifique de la peau, il a notamment été démontré que les VE jouent un rôle majeur dans le maintien de l’homéostasie cutanée, la pigmentation, la cicatrisation et la survenue de différentes pathologies. Au cours de cette thèse, nous avons étudié les communications dermo-épidermiques mettant en jeu les petites VE, appelées exosomes, et comment ces communications pouvaient être modulées au cours du vieillissement cutané. Pour cela, nous avons extrait des fibroblastes primaires de biopsies de peaux humaines de jeunes adultes (18-37 ans), d’adultes d’âge intermédiaire (55-65 ans) et d’adultes âgés (72-78 ans), afin de caractériser leur phénotype de vieillissement in vitro. Nous avons démontré que des fibroblastes primaires issus d’individus âgés de plus de 70 ans possèdent des capacités prolifératives et clonogéniques diminuées, une production de matrice extracellulaire perturbée et un métabolisme mitochondrial différent, comparé à des fibroblastes de jeunes adultes. Les fibroblastes isolés d’adultes d’âge intermédiaire ont, quant à eux, un profil phénotypique variable, tantôt proche des cellules de jeunes adultes, tantôt proche des cellules d’individus âgés. Ainsi, nous avons validé que des fibroblastes primaires issus de biopsies de peaux humaines conservent une mémoire du vieillissement chronologique du tissu d’origine une fois mis en culture. Les fibroblastes primaires issus de peaux âgées peuvent donc être utilisés comme un modèle d’étude in vitro du vieillissement cutané, plus pertinent que les modèles usuels de sénescence induite, notamment pour le criblage de molécules anti-âges. Les petites VE produites par ces cellules ont ensuite été isolées pour traiter des kératinocytes primaires issus de biopsies d’enfants ou d’adultes. Nous avons mis en évidence que ces exosomes modulent in vitro la différenciation des kératinocytes dans un modèle 2D, mais également dans un modèle 3D d’épiderme reconstruit. De façon surprenante, les réponses cellulaires obtenues diffèrent en fonction de l’âge des kératinocytes traités : sur des kératinocytes d’enfants, les exosomes stimulent la différenciation, tandis que sur des kératinocytes d’adultes, ces mêmes exosomes répriment la différenciation. Une première caractérisation du contenu de ces exosomes de fibroblastes nous a permis d’identifier le microARN miR-140-3p comme un régulateur potentiel de ces variations. Ce microARN induit une diminution de l’expression du facteur de transcription KLF4, impliqué dans le contrôle de la différenciation kératinocytaire. En conclusion, ce travail de thèse a permis de mettre en évidence le rôle des VE de fibroblastes dans la différenciation des kératinocytes au cours du vieillissement chronologique et d’identifier un microARN transporté par ces VE et potentiellement impliqué dans la régulation de ce processus cellulaire primordial au maintien de l’homéostasie cutanée.Extracellular vesicles (EVs) are deeply implicated in intercellular communications thanks to their ability to transfer functional material from a donor cell to a recipient cell and to induce cellular responses. EVs are made of a lipid bilayer enclosing proteins, messenger RNAs, non-coding RNAs and lipids and are secreted by all cell types. The role of EVs in numerous physiological and pathological processes has already been described and it generates growing interest in the development of new therapeutic targets. In skin tissue, it has been demonstrated that EVs are implicated in homeostasis maintenance, pigmentation, wound healing and in the occurrence of several pathologies. In this thesis work, we studied communications between dermal fibroblasts and epidermal keratinocytes using small EVs, also called exosomes, and how skin aging could impact these communications. To do so, we extracted primary fibroblasts from skin biopsies of young (18-37 years old), middle-aged (55-65 years old) and old adults (72-78 years old) in order to characterize their aging phenotype in vitro. We observed a strong decreased of both cell proliferation and clonogenic capacities, an impairment in extracellular matrix production together with altered respiratory metabolism in fibroblasts from adults aged over 70 years old, as compared to fibroblasts from young adults. The fibroblasts from middle-aged adults exhibited a variable phenotypic profile, sometimes close to the cells from young adults, sometimes close to the cells from elderly individuals. Thus, we confirmed that primary fibroblasts retain in vitro some characteristics of chronological aging of the original tissue from which they were extracted. Therefore, primary fibroblasts isolated from aged skin represent a valuable in vitro model for skin aging studies, more relevant than the usual models of induced senescence, notably for screening of anti-aging molecules discovery. The small EVs secreted by these primary fibroblasts were then isolated to treat primary keratinocytes from child or adult skin biopsies. We observed that fibroblasts exosomes modulate in vitro keratinocyte differentiation in a 2D model but also in a reconstructed epidermis 3D model. Surprisingly, cellular responses are different according to the age of keratinocytes: EVs stimulate child keratinocytes differentiation whereas they inhibit adult keratinocyte differentiation. A first characterization of fibroblast EVs cargo allowed us to identify the microRNA miR-140-3p as a potential regulator of these variations. This microRNA represses the expression of the transcription factor KLF4 which is implicated in the regulation of keratinocyte differentiation. In conclusion, this thesis work allowed us to demonstrate that fibroblasts EVs play a role in keratinocyte differentiation during aging and to identify an exosomes-related microRNA potentially implicated in the regulation of this essential skin homeostasis process

Exosomes ou vecteurs de communication entre les fibroblastes et les kératinocytes : modélisation des échanges dans la peau saine et au cours du vieillissement

Extracellular vesicles (EVs) are deeply implicated in intercellular communications thanks to their ability to transfer functional material from a donor cell to a recipient cell and to induce cellular responses. EVs are made of a lipid bilayer enclosing proteins, messenger RNAs, non-coding RNAs and lipids and are secreted by all cell types. The role of EVs in numerous physiological and pathological processes has already been described and it generates growing interest in the development of new therapeutic targets. In skin tissue, it has been demonstrated that EVs are implicated in homeostasis maintenance, pigmentation, wound healing and in the occurrence of several pathologies. In this thesis work, we studied communications between dermal fibroblasts and epidermal keratinocytes using small EVs, also called exosomes, and how skin aging could impact these communications. To do so, we extracted primary fibroblasts from skin biopsies of young (18-37 years old), middle-aged (55-65 years old) and old adults (72-78 years old) in order to characterize their aging phenotype in vitro. We observed a strong decreased of both cell proliferation and clonogenic capacities, an impairment in extracellular matrix production together with altered respiratory metabolism in fibroblasts from adults aged over 70 years old, as compared to fibroblasts from young adults. The fibroblasts from middle-aged adults exhibited a variable phenotypic profile, sometimes close to the cells from young adults, sometimes close to the cells from elderly individuals. Thus, we confirmed that primary fibroblasts retain in vitro some characteristics of chronological aging of the original tissue from which they were extracted. Therefore, primary fibroblasts isolated from aged skin represent a valuable in vitro model for skin aging studies, more relevant than the usual models of induced senescence, notably for screening of anti-aging molecules discovery. The small EVs secreted by these primary fibroblasts were then isolated to treat primary keratinocytes from child or adult skin biopsies. We observed that fibroblasts exosomes modulate in vitro keratinocyte differentiation in a 2D model but also in a reconstructed epidermis 3D model. Surprisingly, cellular responses are different according to the age of keratinocytes: EVs stimulate child keratinocytes differentiation whereas they inhibit adult keratinocyte differentiation. A first characterization of fibroblast EVs cargo allowed us to identify the microRNA miR-140-3p as a potential regulator of these variations. This microRNA represses the expression of the transcription factor KLF4 which is implicated in the regulation of keratinocyte differentiation. In conclusion, this thesis work allowed us to demonstrate that fibroblasts EVs play a role in keratinocyte differentiation during aging and to identify an exosomes-related microRNA potentially implicated in the regulation of this essential skin homeostasis process.Les vésicules extracellulaires (VE) sont des acteurs clés de la communication intercellulaire puisqu’elles permettent le transfert de matériel biologique fonctionnel d’une cellule productrice à une cellule receveuse et peuvent induire des réponses cellulaires. Ces VE sont constituées d’une bicouche lipidique renfermant des protéines, des ARN messagers, des ARN non codants ainsi que des lipides, et sont sécrétées par tous les types cellulaires. Le rôle de ces VE dans différents processus physiologiques et pathologiques a été largement décrit ces dernières années et suscite un intérêt croissant pour le développement de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans le contexte spécifique de la peau, il a notamment été démontré que les VE jouent un rôle majeur dans le maintien de l’homéostasie cutanée, la pigmentation, la cicatrisation et la survenue de différentes pathologies. Au cours de cette thèse, nous avons étudié les communications dermo-épidermiques mettant en jeu les petites VE, appelées exosomes, et comment ces communications pouvaient être modulées au cours du vieillissement cutané. Pour cela, nous avons extrait des fibroblastes primaires de biopsies de peaux humaines de jeunes adultes (18-37 ans), d’adultes d’âge intermédiaire (55-65 ans) et d’adultes âgés (72-78 ans), afin de caractériser leur phénotype de vieillissement in vitro. Nous avons démontré que des fibroblastes primaires issus d’individus âgés de plus de 70 ans possèdent des capacités prolifératives et clonogéniques diminuées, une production de matrice extracellulaire perturbée et un métabolisme mitochondrial différent, comparé à des fibroblastes de jeunes adultes. Les fibroblastes isolés d’adultes d’âge intermédiaire ont, quant à eux, un profil phénotypique variable, tantôt proche des cellules de jeunes adultes, tantôt proche des cellules d’individus âgés. Ainsi, nous avons validé que des fibroblastes primaires issus de biopsies de peaux humaines conservent une mémoire du vieillissement chronologique du tissu d’origine une fois mis en culture. Les fibroblastes primaires issus de peaux âgées peuvent donc être utilisés comme un modèle d’étude in vitro du vieillissement cutané, plus pertinent que les modèles usuels de sénescence induite, notamment pour le criblage de molécules anti-âges. Les petites VE produites par ces cellules ont ensuite été isolées pour traiter des kératinocytes primaires issus de biopsies d’enfants ou d’adultes. Nous avons mis en évidence que ces exosomes modulent in vitro la différenciation des kératinocytes dans un modèle 2D, mais également dans un modèle 3D d’épiderme reconstruit. De façon surprenante, les réponses cellulaires obtenues diffèrent en fonction de l’âge des kératinocytes traités : sur des kératinocytes d’enfants, les exosomes stimulent la différenciation, tandis que sur des kératinocytes d’adultes, ces mêmes exosomes répriment la différenciation. Une première caractérisation du contenu de ces exosomes de fibroblastes nous a permis d’identifier le microARN miR-140-3p comme un régulateur potentiel de ces variations. Ce microARN induit une diminution de l’expression du facteur de transcription KLF4, impliqué dans le contrôle de la différenciation kératinocytaire. En conclusion, ce travail de thèse a permis de mettre en évidence le rôle des VE de fibroblastes dans la différenciation des kératinocytes au cours du vieillissement chronologique et d’identifier un microARN transporté par ces VE et potentiellement impliqué dans la régulation de ce processus cellulaire primordial au maintien de l’homéostasie cutanée

Vieillissement et intégrité de la peau

La peau est un organe sentinelle, soumis au vieillissement chronologique et environnemental qui fragilise sa structure et ses fonctions. La fonction barrière de la peau, ses propriétés élastiques et de résistance, ainsi que sa réactivité vasculaire sont atteintes par le vieillissement dans les compartiments épidermiques, dermiques et vasculaires. Les progrès de la recherche ont permis de révéler des processus biologiques sous-jacents, qui peuvent être ciblés par des approches médicamenteuses topiques ou globales à base notamment d’anti-oxydants ou de sénolytiques. Ces stratégies anti-âge pourront contribuer à restaurer, au moins en partie, l’intégrité fonctionnelle de la peau âgée

Chronological aging impacts abundance, function and microRNA content of extracellular vesicles produced by human epidermal keratinocytes

Abstract The disturbance of intercellular communication is one of the hallmarks of aging. The goal of this study is to clarify the impact of chronological aging on extracellular vesicles (EVs), a key mode of communication in mammalian tissues. We focused on epidermal keratinocytes, the main cells of the outer protective layer of the skin which is strongly impaired in the skin of elderly. EVs were purified from conditioned medium of primary keratinocytes isolated from infant or aged adult skin. A significant increase of the relative number of EVs released from aged keratinocytes was observed whereas their size distribution was not modified. By small RNA sequencing, we described a specific microRNA (miRNA) signature of aged EVs with an increase abundance of miR-30a, a key regulator of barrier function in human epidermis. EVs from aged keratinocytes were found to be able to reduce the proliferation of young keratinocytes, to impact their organogenesis properties in a reconstructed epidermis model and to slow down the early steps of skin wound healing in mice, three features observed in aged epidermis. This work reveals that intercellular communication mediated by EVs is modulated during aging process in keratinocytes and might be involved in the functional defects observed in aged skin

Maintenance of Chronological Aging Features in Culture of Normal Human Dermal Fibroblasts from Old Donors

Chronological aging is defined as a time-dependent decline of tissue homeostasis which severely impacts skin. Understanding the mechanisms of skin aging is an active research area limited by the lack of relevant in vitro models. Being a component of aging, replicative or stress-induced senescence is repeatedly used to mimic skin aging in vitro, thus presenting only a partial view of the complexity of aging. Herein, we aimed to clarify whether primary normal human dermal fibroblasts retained age-related characteristics when cultured in 2D monolayer, and could be used as a relevant model for aging research. We compared three groups of fibroblasts isolated from different aged donors. We observed strongly decreased population doubling capacities, a reduced clonogenic ability, an impairment in extracellular matrix production together with modifications of respiratory metabolism with an increase in age. These disruptions were particularly marked when comparing fibroblasts isolated from old individuals (over 70 years old) to those isolated from young individuals (18–37 years old), while cells from middle-aged donors exhibited an intermediate profile. These alterations of cell features can be related to the signs of dermis aging, thus showing that cultured primary cells indeed retain some characteristics of the original tissue from which they were extracted