Clustered Single Cellulosic Fiber Dissolution Kinetics and Mechanisms through Optical Microscopy under Limited Dissolving Conditions

Herein, we describe a new method of assessing the kinetics of dissolution of single fibers by dissolution under limited dissolving conditions. The dissolution is followed by optical microscopy under limited dissolving conditions. Videos of the dissolution were processed in Image) to yield kinetics for dissolution, based on the disappearance of pixels associated with intact fibers. Data processing was performed using the Python language, utilizing available scientific libraries. The methods of processing the data include clustering of the single fiber data, identifying clusters associated with different fiber types, producing average dissolution traces and also extraction of practical parameters, such as, time taken to dissolve 25, SO, 75, 95, and 99.5% of the clustered fibers. In addition to these simple parameters, exponential fitting was also performed yielding rate constants for fiber dissolution. Fits for sample and cluster averages were variable, although demonstrating first-order kinetics for dissolution overall. To illustrate this process, two reference pulps (a bleached softwood kraft pulp and a bleached hardwood pre hydrolysis kraft pulp) and their cellulase-treated versions were analyzed. As expected, differences in the kinetics and dissolution mechanisms between these samples were observed. Our initial interpretations are presented, based on the combined mechanistic observations and single fiber dissolution kinetics for these different samples. While the dissolution mechanisms observed were similar to those published previously, the more direct link of mechanistic information with the kinetics improve our understanding of cell wall structure and pre-treatments, toward improved processability.Peer reviewe

Reversibelt syrebindande organometalliska komplex

To porphyrins structurally related organometallic complexes, which bind oxygen reversibly, have been used in oxygen enriching processes either as actively oxygen binding groups in oxygen enriching membranes, or as mobile oxygen carriers in solution. The complexes of interest for this work are metalloporphyrins, -porphyrazines and -phthalocyanines. In the literature survey biological oxygen enriching systems are briefly discussed, as well as artificial systems where oxygen is enriched by mobile oxygen carriers or by oxygen enriching membranes. Metal complexes of porphyrins, porphyrazines and phthalocyanines are dealt with as potential oxygen carriers. Their synthesis, and especially their solubility and aggregation is discussed, since they are important properties to be tuned in order to maximize the oxygen transport capability in solution. The metallophthalocyanines were found to be the easiest to synthesize and the work is concentrated on them. The synthesis of metallophthalocyanines as well as methods for introducing substituents on them is reviewed in detail. Cobaltphthalocyanines have been found to be among the most suitable for oxygen transport, but the presence of the ferromagnetic Co(II) ion makes NMR analysis impossible. Therefore, the analysis and caracterization of phthalocyanines are discussed too. In the experimental part, the microwave assisted synthesis of a tetra-tert-butyl and a tetrafluoro substituted cobaltphthalocyanine is explored with two different methods, but with poor product quality. In the following experiments two water soluble cobalt-phthalocyanines are synthesized successfully, and they are characterized by IR, UV-Vis and mass spectroscopy. The analysis clearly indicates that the complexes dimerize in water, but exist as monomers in methanol solution. The water solubility is due to charged substituents: the first phthalocyanine is substituted with four by methylene quaternized pyridyloxy groups; the second phthalocyanine is substituted with four isophthalate phenoxy groups. The phthalocyanines were synthesized in refluxing pentanol with basic catalysis out of the corresponding phthalonitrile and metal salt. The phthalonitrile was formed by nucleophilic aromatic nitro replacement

Selluloosan entsymaattinen hydrolyysi vesipitoisissa ioninesteissä

Total enzymatic hydrolysis of the polysaccharides in lignocellulosic biomass to monosaccharides is currently a focus research area. The monosaccharides obtained from lignocellulose hydrolysis can be used for the production of platform chemicals and biofuels, most notably ethanol. One major challenge in the commercialization of lignocellulosic ethanol production is the recalcitrance of lignocellulosics towards enzymatic hydrolysis, necessitating efficient pretreatment of the lignocellulosic feedstock. Certain ionic liquids (ILs, salts with melting points below 100 °C) dissolve cellulose and even lignocellulosic biomass and are as such interesting candidates for pretreatment technology. However, cellulose-dissolving ILs have been found to severely inactivate the hydrolytic enzymes (cellulases) employed in cellulose hydrolysis. This work focuses on elucidating how certain ILs affect the action of cellulases in cellulose hydrolysis. The main emphasis was on the action of purified monocomponent Trichoderma reesei cellulases, but some commercial cellulase preparations were also studied in IL matrices. Hydrolysis experiments were made in solutions containing up to 90% of the two cellulose-dissolving ILs 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate ([EMIM]AcO) and 1,3-dimethylimidazolium dimethylphosphate ([DMIM]DMP). The presence of increasing amounts of IL led to decreasing yields of solubilised saccharides in enzymatic hydrolysis. Depending on the IL and cellulase, no soluble saccharides were released in hydrolysis matrices containing over 40–50% IL. There were clear differences in the severity of the effects of different cellulose-dissolving ILs on cellulase action. [EMIM]AcO was generally more harmful for cellulase action than [DMIM]DMP. Pure [EMIM]AcO completely inactivated T. reesei endoglucanase in 4 h in residual activity measurements, whereas pure [DMIM]DMP supported considerable cellulase activity for at least three days. These results were confirmed by time curves of microcrystalline cellulose (MCC) hydrolysis in matrices containing the two ILs. Cellulose-dissolving ILs based on carboxylate salts of the organic superbases 1,1,3,3-tetramethylguanidine (TMG) and 1,5-diazabicyclo[4.3.0]non-5-ene (DBN) have recently become available. These compounds are distillable under relatively mild conditions and are thus recyclable. However, these ILs were found to be at least as harmful for cellulase action as the studied imidazolium-based ILs and did thus not offer any benefits in terms of enzyme compatibility. T. reesei endoglucanases were unable to reduce the molecular weight of MCC in buffer or in any aqueous matrix containing IL, except in 90% (v/v) [DMIM]DMP in which the MCC was partially dissolved. Cellulose-dissolving ILs were found to be basic in aqueous solution. According to the results in this work, the pH increase caused by IL basicity was not the main reason for the observed cellulase inactivation. Cellulases with confirmed activity at high pH did not perform better than acidic or neutral cellulases in IL solutions. Some indications were however obtained that cellulase thermostability may be associated with better activity in cellulose-dissolving ILs. The studied ILs were found to have very detrimental effects on saccharide analytics. A capillary electrophoresis (CE) method was developed for the analysis of mono- and oligosaccharides in matrices containing ILs. With this CE method, the yields and product distribution of cello-oligomers produced in the hydrolysis experiments could be determined. It was found that the presence of ILs shifted the product distribution to larger cello-oligomers for some cellulases. The CE method was also used to monitor the hydrolysis of cello-oligomers with Aspergillus niger β-glucosidase in IL matrices. This β-glucosidase was found to be very IL sensitive. ILs were found to affect the cellulose binding of T. reesei cellulases. The cellulase binding to MCC in solutions with [DMIM]DMP and [EMIM]AcO was studied with radiolabeled T. reesei Cel5A (endoglucanase II) and Cel7A (cellobiohydrolase I) and their respective core domains. Cel7A was able to bind to MCC with its core domain, whereas it was shown that Cel5A was very dependent on its CBM for efficient substrate binding. High cellulose binding affinity was not necessary for all the cellulases in order for them to be hydrolytically active. [EMIM]AcO interfered more with cellulase substrate binding than [DMIM]DMP. The binding ability of the T. reesei carbohydrate-binding modules (CBMs) was very IL sensitive.Enzymatisk totalhydrolys av lignocellulosans polysackarider till monosackarider är för tillfället ett mycket aktivt forskningsområde. De sålunda producerade monosackariderna kan användas som råvara vid tillverkningen av plattformkemikalier och biobränslen, av vilka särskilt kan nämnas etanol. En av de största utmaningarna i kommersialiseringen av etanoltillverkning från lignocellulosa är lignocellulosans motståndskraft mot enzymatisk hydrolys. Därför behövs effektiva förbehandlingsmetoder då lignocellulosan används som råvara. Vissa jonvätskor (definierade som salt med smältpunkt under 100 °C) löser cellulosa och till och med fullständig lignocellulosa. Jonvätskorna utgör sålunda ett intressant alternativ som förbehandlingsteknologi för lignocellulosa. Jonvätskorna har emellertid i hög grad konstaterats inaktivera de hydrolytiska enzymer, cellulaser, som används i cellulosahydrolys. Detta arbete har haft som målsättning att klargöra hur cellulosalösande jonvätskor påverkar cellulasernas funktion i cellulosahydrolys. I första hand undersöktes hur funktionen hos cellulaser renade till enkomponentpreparat från Trichoderma reesei, men också hos kommersiella cellulaspreparat, påverkades i vissa jonvätskelösningar. Hydrolysexperimenten utfördes i lösningar med upp till 90 % jonvätska (1-etyl-3-metylimidazolium acetat ([EMIM]AcO) eller 1,3-dimetylimidazolium dimetylfosfat ([DMIM]DMP)). En ökande mängd jonvätska ledde till avtagande hydrolysutbyten i form av lösliga sackarider i enzymatisk hydrolys. Beroende på kombinationen av jonvätska och cellulas observerades ingen tillkomst av lösliga sackarider när jonvätskekoncentrationen steg över 40–50 %. De olika jonvätskorna var i olika utsträckning skadliga för cellulasernas funktion. [EMIM]AcO var i allmänhet mer skadlig än [DMIM]DMP för cellulasernas funktion. Ren [EMIM]AcO inaktiverade T. reesei endoglukanas fullständigt på mindre än 4 h, medan betydande restaktiviteter mättes efter inkubation i [DMIM]DMP under åtminstone tre dygn. Detta resultat understöddes av hydrolyskurvorna när mikrokristallin cellulosa (microcrystalline cellulose, MCC) hydrolyserades i lösningar med dessa två jonvätskor. Cellulosalösande jonvätskor som består av karboxylater av de organiska superbaserna 1,1,3,3-tetrametylguanidin (TMG) och 1,5-diazabicyklo[4.3.0]non-5-en (DBN) har nyligen blivit tillgängliga. Dessa jonvätskor är speciellt intressanta eftersom de är destillerbara under relativt milda förhållanden och sålunda är återvinningsbara. I hydrolysexperimenten konstaterades dessa jonvätskor dock vara åtminstone lika skadliga för cellulasernas funktion som de imidazoliumbaserade jonvätskorna, så dessa jonvätskor medförde ingen nytta i form av ökad enzymkompatibilitet. T. reeseis endoglukanaser kunde inte reducera MCC:s molmassa i buffertlösning eller i någon jonvätskelösning, förutom i 90 % (v/v) [DMIM]DMP, vari MCC partiellt löste sig. Jonvätskor som löser cellulosa befanns vara basiska i vattenlösning. Enligt resultaten i detta arbete skulle det stigande pH-värdet, som förosakades av de cellulosalösande jonvätskornas basiskhet, inte vara en av huvudorsakerna för den observerade inaktiveringen hos cellulaserna. Cellulaser med aktivitet i höga pH-värden presterade inte bättre i jonvätskelösningar än sura eller neutrala cellulaser. Däremot observerades det att cellulaser med ökande termostabilitet verkade bevara sin förmåga att katalysera cellulosahydrolys i jonvätskelösningar bättre, än cellulaser som är temperaturkänsliga. De studerade jonvätskorna konstaterades vara mycket skadliga för många av de vanliga metoderna som används i kolhydratanalytik. En kapillärelektroforesmetod utvecklades för att analysera mono- och oligosackarider i jonvätskelösningar. Med den här analysmetoden kunde både hydrolysutbytena och produktdistributionen av lösliga cello-oligomerer bestämmas i jonvätskelösningar. För endel cellulaser ledde närvaron av jonvätska under hydrolysen till att produktdistributionen skiftades mot längre oligomerer, jämfört med situationen i optimumförhållanden. Kapillärelektroforesmetoden användes också för att följa med hur Aspergillus nigers β-glukosidas hydrolyserade cello-oligomerer i jonvätskelösningar. Detta β-glukosidas konstaterades vara mycket känsligt för närvaron av jonvätska. Jonvätskor konstaterades påverka cellulosabindandet hos T. reeseis cellulaser. T. reesei Cel5A (endoglukanas II), Cel7A (cellobiohydrolas I) och deras respektive katalytiska domäner märktes med radioaktivt tritium och dessa cellulasers förmåga att binda till MCC studerades i lösningar innehållande [DMIM]DMP och [EMIM]AcO. Cel7A kunde binda sig till MCC direkt via sin katalytiska domän, medan det kunde påvisas att Cel5A var ytterst beroende av sin kolhydratbindande modul för att binda till cellulosa. En hög grad av bindning till cellulosa var inte nödvändig för Cel5A för att hydrolys skulle äga rum. [EMIM]AcO konstaterades påverka cellulasernas bindingsgrad till MCC mer än [DMIM]DMP. Bindningsförmågan hos T. reeseis kolhydratbindande moduler konstaterades vara synnerligen känslig för de studerade jonvätskorna.Lignoselluloosan entsymaattista totaalihydrolyysiä tutkitaan nykyisin hyvin aktiivisesti. Lignoselluloosassa olevien polysakkaridien hydrolyysistä syntyviä monosakkarideja voidaan käyttää raaka-aineina kemikaalien, polymeerien ja biopolttoaineiden, erityisesti etanolin, tuotannossa. Iso haaste lignoselluloosapohjaisen etanolituotannon kaupallistamisessa on lignoselluloosan monimutkainen rakenne, joka vaikeuttaa entsymaattista hydrolyysiä. Tehokkaiden, lignoselluloosaa avaavien esikäsittelymenetelmien kehittäminen on siis tärkeää. Tietyt ioninesteet, jotka määritellään suoloiksi, joiden sulamispiste on alle 100 °C, liuottavat selluloosaa ja jopa lignoselluloosaa. Ne ovatkin hyvin mielenkiintoisia käytettäviksi lignoselluloosan esikäsittelyssä. Selluloosaa liuottavien ioninesteiden on kuitenkin todettu inaktivoivan hydrolyyttisiä entsyymejä, sellulaaseja, joita käytetään selluloosan totaalihydrolyysissä. Tässä työssä selvitettiin, miten tietyt ioninesteet vaikuttavat sellulaasien toimintaan selluloosan hydrolyysissä. Työssä tutkittiin pääasiassa Trichoderma reesei -homeen tuottamien ja puhdistettujen sellulaasien sekä myös joidenkin kaupallisesti saatavien sellulaasituotteiden toimintaa vesipitoisissa ioninesteliuoksissa. Hydrolyysikokeita tehtiin selluloosalla vesiliuoksissa, joiden ioninestepitoisuus vaihteli; suurimmillaan se oli 90 % (joko 1-etyyli-3-metyylimidatsoliumi asetaatti ([EMIM]AcO) tai 1,3-dimetyylimidatsoliumi dimetyylifosfaatti ([DMIM]DMP)). Kasvavat ioninestepitoisuudet aiheuttivat hydrolyysisaannon pienenemisen selluloosan entsyymaattisessa hydrolyysissä. Riippuen sellulaasin ja ioninesteen yhdistelmästä liukenevia mono- ja oligosakkarideja ei syntynyt lainkaan hydrolyyseissä, joissa oli enemmän kuin 40–50 % ioninestettä. Selluloosaa liuottavien ioninesteiden vaikutuksessa sellulaasien toimintaan oli selviä eroja. [EMIM]AcO haittasi enemmän sellulaasien toimintaa kuin [DMIM]DMP. Puhtaassa [EMIM]AcO:ssa T. reesein endoglukanaasi inaktivoitui täysin neljän tunnin käsittelyssä jäännösaktiivisuusmittauksen perusteella, kun taas aktiivisuus aleni hyvin vähän ja hitaasti [DMIM]DMP:ssa kolmen vuorokauden aikana. Nämä tulokset vastasivat hyvin samojen ioninesteiden vesiliuoksissa tehtyjen mikrokiteisen selluloosan (microcrystalline cellulose, MCC) entsymaattisten hydrolyysien tuloksia. Äskettäin on kehitetty selluloosaa liuottavia ioninesteitä, jotka perustuvat orgaanisten superemästen 1,1,3,3-tetrametyyliguanidiinin (TMG) ja 1,5-diatsabisyklo[4.3.0]non-5-eenin (DBN) karboksylaattisuoloihin. Nämä ioninesteet ovat tislattavia suhteellisen miedoissa olosuhteissa ja näin ollen kierrätettäviä. Hydrolyysikokeiden perusteella nämä uudet selluloosaa liuottavat ioninesteet eivät kuitenkaan olleet paremmin yhteensopivia sellulaasien kanssa kuin perinteiset imidatsoliumi-pohjaiset ioninesteet. T. reesein endoglukanaasit eivät pystyneet vähentämään MCC:n molekyylipainoa puskurissa eivätkä missään muussa ioninestettä sisältävässä liuoksessa, paitsi 90-prosenttisessa (v/v) [DMIM]DMP:ssa, johon MCC oli osittain liuennut. Selluloosaa liuottavien ioninesteiden todettiin olevan emäksisiä vesiliuoksessa. Tämän työn tulosten perusteella ioninesteiden aiheuttama pH-arvon nousu ei kuitenkaan ollut sellulaasien inaktivoitumisen pääsyy. Sellulaasin kyky toimia korkeissa pH-arvoissa ei tehnyt sellulaasista tehokkaampaa selluloosan hydrolyysissä ioninestematriiseissa. Sen sijaan sellulaasien termostabiilisuus vaikutti johtavan kasvavaan ioninestetoleranssiin. Tutkittujen ioninesteiden havaittiin olevan hyvin haitallisia hiilihydraattianalytiikkamenetelmille. Työssä kehitettiin kapillarielektroforeesimenetelmä mono- ja oligosakkaridien analyysiin ioninestepitoisissa matriiseissa. Hydrolyysien saannot ja liuenneiden oligosakkaridien tuotejakaumat määriteltiin tällä menetelmällä ioninestepitoisista hydrolysaateista. Analyysien perusteella havaittiin, että ioninesteiden läsnäolo entsymaattisessa selluloosan hydrolyysissä sai tuotejakauman siirtymään pitempiin oligosakkarideihin joillakin sellulaaseilla. Elektroforeesimenetelmää käytettiin myös sello-oligomeerien hydrolyysin seuraamiseen Aspergillus nigerin β-glukosidaasilla ioninestematriiseissa. Tämä β-glukosidaasi havaittiin hyvin ioninesteherkäksi. Ioninesteiden havaittiin vaikuttavan T. reesein sellulaasien selluloosaan sitoutumiseen. Sellulaasien sitoutumista MCC:aan tutkittiin radioleimatuilla T. reesei Cel5A:lla (endoglukanaasi II), Cel7A:lla (cellobiohydrolaasi I) ja niiden katalyyttisillä domeeneillä puskuriliuoksissa [DMIM]DMP:n ja [EMIM]AcO:n läsnä ollessa. Cel7A pystyi sitoutumaan MCC:aan pelkällä katalyyttisellä domeenillaan, kun taas Cel5A oli hyvin riippuvainen hiilihydraatteja sitovasta modulistaan sitoutuakseen tehokkaasti selluloosaan. Korkea sitoutumisaste ei kuitenkaan ollut tarpeellinen Cel5A:lle, jotta se olisi toiminut selluloosan hydrolyysissä. [EMIM]AcO vaikutti [DMIM]DMP:a voimakkaammin sellulaasien selluloosaan sitoutumiseen. Yleisesti tutkittujen ioninesteiden todettiin vaikuttavan herkästi T. reesein hiilihydraatteja sitovien moduulien toimintaan