PAMAM6 dendrimers and DNA: pH dependent "beads-on-a-string" behavior revealed by small angle X-ray scattering

DNA interactions with polycations are not only important for our understanding of chromatin compaction but also for characterizing DNA-binding proteins involved in transcription, replication and repair. DNA is known to form several types of liquid-crystalline phases depending, among other factors, on polycation structure and charge density. Theoretical studies and simulations have predicted the wrapping of DNA around spherical positively charged polycations. As a potential mimic of the histone octamer or other DNA wrapping proteins, poly(amido amine) generation 6 (PAMAM6) dendrimers have been chosen for our study. The self-assembly of DNA induced by PAMAM6 has been investigated using small angle X-ray scattering (SAXS) in order to reveal the assemblies' structure dependence on the pH of the environment and on dendrimers concentration. We demonstrate that at pH 8.5 dense phases are formed and characterized by a 2D-columnar hexagonal lattice which is transformed into a 3D hexagonal lattice with increasing dendrimer concentration (charge ratio N/P). Moreover, a systematic analysis of the scattering data collected from diluted samples at pH 8.5 and 5.5 have led us to propose a wrapping scenario of DNA around PAMAM6 at pH 5.5.Comment: 12 pages, 7 figure

DNA-Kompaktion

DNA-Kompaktion bezeichnet die Kondensation von langen DNA-Molekülen zu extrem dicht gepackten Aggregaten mit komplexer Nanostruktur. Induziert wird dieser Vorgang im Allgemeinen durch kationische Wechselwirkungspartner. Trotz der bereits erzielten großen Fortschritte auf dem Weg zu einem vollständigen Verständnis der zugrundeliegenden Wechselwirkungsmechanismen stellt das komplexe Wechselspiel der zahlreichen beteiligten Reaktionspartnern Wissenschafter noch immer vor eine Vielzahl unbeantworteter Fragen. Insbesondere der hierarchische Aufbau des Chromatins, bei dem die DNA zunächst auf Histon-Oktamere aufwickelt und anschließend unter Beteiligung von Linker-Histonen zu höheren Organisationsstufen überführt wird, ist weitgehend ungeklärt.In der vorliegenden Arbeit werden biomimetische Untersuchungen des denkbar einfachsten Modellsystems für die DNA-Kompaktion vorgestellt. Dieses besteht nur aus Dendrimeren, die als gleichmäßig geladene, bis zu 10nm große, kationische Kugeln beschrieben werden können, und polydispersen DNA-Molekülen mit einer unspezifischen Basensequenz. Zur Untersuchung werden Röntgen-Diffraktionsmessungen eingesetzt. Die Durchführung der Messungen im kontinuierlichen Fluss in Mikrofluidik-Bauteilen unter Ausnutzung hydrodynamischer Fokussierungseffekte gewährt einen kontrollierten und zeitaufgelösten Zugang zu verschiedenen Stadien des Selbstorganisationsprozesses. Dadurch können insbesondere transiente Zwischenstadien der Reaktion verfolgt und ein quantitatives Verständnis der Kompaktionsmechanismen erzielt werden. Der hohe Grad der Kontrolle über die Größe und die Ladung der Dendrimere ermöglicht es, verschiedene DNA-Kompaktionsszenarien gezielt einzustellen und im Detail zu analysieren.Die Vielfalt der natürlich vorkommenden DNA-Kompaktionspartnern reicht von kleinen organischen Kationen wie Spermidin und Spermin in Viren bis hin zu den wesentlich größeren Histon-Oktameren in eukaryotischen Zellen. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass sich Dendrimere ausgesprochen gut dazu eignen, dieses gesamte Spektrum zu reproduzieren. Trotz seiner starken Vereinfachung ist das Dendrimer/DNA-Modellsystem in der Lage, charakteristische Züge der natürlich auftretenden DNA-Kompaktion wiederzugeben. Besonders hervorzuheben ist dabei die Wechselwirkung von DNA mit PAMAM 6-Dendrimeren, die zu einem Aufwickeln der DNA um die in Bezug auf Ladung und Größe mit Histon-Oktameren vergleichbaren PAMAM 6 führt. Die gebildeten PAMAM 6/DNA-Einheiten zeigen eine erstaunliche Übereinstimmung in Größe und Gestalt mit nukleosomalen Kernpartikeln. Für Dendrimere mit einer mittleren Größe von ca. 3nm kann unter Verwendung von mikrofluidischen Methoden ein neuartiger DNA-Kompaktionsmechanismus unterhalb des isoelektrischen Punktes beobachtet werden. Dieser unterscheidet sich grundlegend von den bereits bekannten Salz- oder Makroion-induzierten DNA-Kondensationsformen.Neben den Untersuchungen zur DNA-Kompaktion ist die Abhängigkeit der Dendrimerkonformation von der Ladung der Moleküle experimentell genau quantifiziert worden. Dabei sind vorhersagbare, ladungsabhängige Änderungen der Dendrimerkonformation beobachtet worden. Diese Beobachtungen beseitigen die Diskrepanz, die bisher in der Literatur zwischen theoretischen Vorhersagen und experimentellen Beobachtungen bestand.Zusätzlich zu den künstlichen Modell-Proteinen wurde auch die Wechselwirkung von natürlich vorkommenden Linker-Histonen H1 mit DNA im Mikrofluss zeitaufgelöst untersucht. Die aufgezeichnete Röntgen-Streubilder belegen einen zweistufigen Wechselwirkungsmechanismus: Auf ein zunächst unspezifisches Anlagern der Proteine an die DNS folgt eine Reorganisation der Moleküle im gebildeten Komplex. Die erzielten Ergebnisse legen nahe, dass eine durch die DNA induzierte vollständige Faltung der endständigen H1-Proteinketten für den beobachteten Phasenübergang der H1/DNA-Komplexe verantwortlich ist.Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse leisten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des hierarchischen Aufbaus von Chromatin. Es ist davon auszugehen, dass die zugrundeliegenden Konzepte einen experimentellen Zugang zu weiteren relevanten Protein/DNA-Systeme gewähren werden. Darüber hinaus besitzen die hier untersuchten Systeme biotechnologische Bedeutung und es wird erwartet, dass sie zur Entwicklung zukünftiger Transfektionsvektoren beitragen werden

Rapid prototyping of X-ray microdiffraction compatible continuous microflow foils

Microfluidics meets microdiffraction: A straightforward and inexpensive method of fabricating long-lifetime, X-ray-microdiffraction compatible, ultrathin microfluidic devices with an overwhelming versatility with respect to channel design elements is presented (see image). To illustrate the analytic power and geometric flexibility of these microflow foils, X-ray microdiffraction measurements on shear-induced alignment effects in the smectic liquid crystal n-octyl-4-cyanobiphenyl are shown

Raman and surface enhanced Raman microscopy of microstructured PEI/DNA multilayers

We analyze microstructured multilayer films of poly(ethyleneimine) (PEI) and DNA by employing Raman and surface enhanced Raman spectroscopy (SERS). The microstructuring of the samples allows a simultaneous measurement of signal and reference in a single analytic process. Silver nanoparticles are implemented in the microstructured multilayers for SERS measurements. The recorded SERS spectra of PEI/DNA are dominated by the Raman bands of the DNA bases which show a larger mean enhancement than bands belonging to DNA backbone vibrations. Our results show that the combination of SERS and microstructured multilayer films provides an adapted way to characterize the polyelectrolytes as well as to measure the enhancement factor and the distance dependence for the SERS active silver nanoparticles. Furthermore, microstructured polyelectrolyte films containing SERS active nanoparticles are used for sensing molecules

Structural and dynamic properties of linker histone H1 binding to DNA

Found in all eukaryotic cells, linker histones H1 are known to bind to and rearrange nucleosomal linker DNA. In vitro, the fundamental nature of H1?DNA interactions has attracted wide interest among research communities-from biologists to physicists. Hence, H1?DNA binding processes and structural and dynamical information about these self-assemblies are of broad importance. Targeting a quantitative understanding of H1 induced DNA compaction mechanisms, our strategy is based on using small-angle x-ray microdiffraction in combination with microfluidics. The usage of microfluidic hydrodynamic focusing devices facilitates a microscale control of these self-assembly processes, which cannot be achieved using conventional bulk setups. In addition, the method enables time-resolved access to structure formation in situ, in particular, to transient intermediate states. The observed time dependent structure evolution shows that the H1?DNA interaction can be described as a two-step process: an initial unspecific binding of H1 to DNA is followed by a rearrangement of molecules within the formed assemblies. The second step is most likely induced by interactions between the DNA and the H1's charged side chains. This leads to an increase in lattice spacing within the DNA?protein assembly and induces a decrease in the correlation length of the mesophases, probably due to a local bending of the DNA

Highly Packed and Oriented DNA Mesophases Identified Using in Situ Microfluidic X-ray Microdiffraction

DNA condensation in vivo usually requires proteins and/or multivalent salts. Here, we explore the in vitro compaction of DNA by cationic dendrimers having an intermediate size and charge. The dynamic assembly of DNA-dendrimer mesophases is discernible due to the laminar flow in a specially designed X-ray compatible microfluidic device. The setup ensures a nonequilibrium ascent of reactant concentration, and the resulting progression of DNA compaction was detected online using microfocused small-angle X-ray diffraction. The evolution of a DNA-dendrimer columnar square mesophase as a function of increasing dendrimer content is described. Additionally, in regions of maximum shear, an unexpected high-level perpendicular ordering of this phase is recorded. Furthermore, these assemblies are found to be in coexistence with a densely packed DNA-only mesophase in regions of excess DNA. The latter is reminiscent of dense packing found in bacteriophage and chromosomes, although surprisingly, it is not stabilized by direct dendrimer contact