Aproximación sintética de análogos estables del sideróforo piscibactina

[Resumen] La industria acuícola está siendo enormemente afectada por la aparición y propagación de enfermedades infecciosas en los peces, así como por la evolución y expansión de la resistencia bacteriana a los antibióticos actuales. Por tanto, surge la necesidad de buscar nuevas estrategias para prevenir y controlar esas enfermedades infecciosas con el fin de desarrollar nuevos fármacos más efectivos. La piscibactina (Pcb) es un sideróforo de tipo fenolato responsable de la captación de Fe3+ de las bacterias Photobacterium damselae subsp. piscicida y Vibrio anguillarum. Su baja estabilidad dificulta sus aplicaciones biotecnológicas, por lo que se hace indispensable la preparación de análogos estables de Pcb para poder desarrollarlas. En este trabajo se propone diseñar un nuevo análogo simplificado de Pcb con diferentes motivos estructurales deducidos mediante cálculos computacionales. Adicionalmente, se pretende llevar a cabo la preparación de un intermedio avanzado que pueda ser utilizado por el grupo de investigación en la síntesis de un análogo estable de Pcb que permita en un futuro desarrollar nuevas aplicaciones biotecnológicas. Los cálculos computacionales mostraron que los modelos moleculares propuestos son adecuados para su coordinación con el Ga3+. Dado que durante la síntesis del análogo simplificado de Pcb TZ_OZ_T (tiazolina-oxazolina-tiazol) tuvo lugar la oxidación del anillo de tiazolina, se decidió preparar el análogo T_OZ_T (tiazol-oxazolina-tiazol), obteniéndose un intermedio avanzado del mismo que permitirá completar su síntesis en el futuro. Todos los compuestos sintetizados se caracterizaron tanto por RMN como por espectrometría de masas.[Resumo] A industria acuícola está sendo enormemente afectada pola aparición e propagación de enfermidades infecciosas nos peixes, así como pola evolución e aparición da resistencia bacteriana aos antibióticos actuais. Polo tanto, surxe a necesidade de buscar novas estratexias para previr e controlar esas enfermidades infecciosas co fin de desenvolver novos fármacos más efectivos. A piscibactina (Pcb) é un sideróforo de tipo fenolato responsable da captación de Fe3+ das bacterias Photobacterium damselae subsp. piscicida e Vibrio anguillarum. A súa baixa estabilidade dificulta as súas aplicacións biotecnolóxicas, o que fai indispensable a preparación de análogos estables de Pcb para poder desenvolvelas. Neste trabajo proponse diseñar un novo análogo simplificado de piscibactina (Pcb) con diferentes motivos estructurais deducidos mediante cálculos computacionais. Adicionalmente, preténdese levar a cabo a preparación dun intermedio avanzado que poida ser utilizado polo grupo de investigación na síntese dun novo análogo estable de Pcb que permita nun futuro desarrollar novas aplicacións biotecnolóxicas. Os cálculos computacionais mostraron que os modelos moleculares propostos son axeitados para a súa coordinación co Ga3+. Dado que durante a síntese do análogo simplificado de Pcb T_OZ_T (tiazol-oxazolina-tiazol) tivo lugar a oxidación do anel de tiazolina, decidiuse preparar o análogo T_OZ_T (tiazol-oxazolina-tiazol) obtendo un intermedio avanzado do mesmo que permitirá completar a súa síntese no futuro. Todos os compostos sintetizados caracterizáronse tanto por RMN como por espectrometra de masas.[Abstract] The aquaculture industry is being greatly affected by the appearance and spread of fish infectious diseases and the evolution and spread of antimicrobial resistance to current antibiotics. Therefore, the search for new strategies to prevent and control these infectious diseases in order to develop new and more effective drugs, is urgently needed. Piscibactin (Pcb) is a phenolate-type siderophore responsible for Fe3+ uptake by the bacteria Photobacterium damselae subsp. piscicida and Vibrio anguillarum. Its low stability hampers its biotechnological applications, and so, the design of stable Pcb analogues is essential to develop them. In this work, the design of a new simplified analogue of Pcb with different structural motifs deduced by computational calculations is proposed. Additionally, another objective was the preparation of an advanced intermediate that can be used by the research group in the synthesis of a stable analogue of Pcb that allows in the future to develop new biotechnological applications. Computational calculations showed that the proposed molecular models are suitable for coordination with Ga3+. Since during the synthesis of the simplified analogue of Pcb TZ_OZ_T (thiazoline-oxazoline-thiazole), the oxidation of the thiazoline ring took place, the preparation of the analogue T_OZ_T (thiazole-oxazoline-thiazole) was adressed. In this way, an advanced intermediate was obtained which will allow the synthesis of that analogue in the future. All the synthetic compounds were characterized by both NMR and mass spectrometry techniquesTraballo fin de mestrado (UDC.CIE). Investigación química y química industrial. Curso 2022/202

Studies of furunculosis in zebrafish by "Aeromonas salmonicida" subsp. "salmonicida" labeled with the green fluorescent protein (GFP) and with a fluorescent probe of the siderophore amonabactin

[Resumen]: El pez cebra (Danio rerio) es un potencial organismo modelo en el estudio de las enfermedades que afectan a los peces en la acuicultura, así como en su tratamiento posterior. Este trabajo se centra en el estudio de la forunculosis en el pez cebra, patología provocada por Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida, que genera grandes pérdidas económicas en la industria acuícola. Se evaluó la mortalidad y las propiedades fluorescentes de A. salmonicida marcada con dos sondas fluorescentes en larvas de pez cebra. Las sondas empleadas son la proteína verde fluorescente (GFP) y un conjugado sideróforo amonabactina - sulforodamina B (AMB-SRB), cuyas propiedades se analizaron mediante microscopia de fluorescencia convencional y de barrido láser confocal. Se obtuvieron imágenes de la distribución de ambas sondas en las larvas de pez cebra y, en consecuencia, de A. salmonicida. Se demostró que la bacteria provoca un efecto nocivo sobre el pez cebra, llegando a provocar la muerte al exponerse a la mayor concentración ensayada. En cuanto a la fluorescencia de las sondas, la señal de ambas se observa en el tracto digestivo, mostrándose mayor intensidad con la bacteria marcada con GFP. Estos resultados son útiles para profundizar en el estudio de la forunculosis en peces de acuicultura.[Resumo]: O peixe cebra (Danio rerio) é un potencial organismo modelo no estudio das enfermidades que afectan aos peixes na acuicultura, así como no seu tratamento posterior. Este traballo céntrase no estudo da furunculose no peixe cebra, patoloxía provocada por Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida, que xera grandes pérdidas económicas na industria acuícola. Avaliouse a mortalidade e as propiedades fluorescentes de A. salmonicida marcada con dúas sondas fluorescentes en larvas de peixe cebra. As sondas empregadas son a proteína verde fluorescente (GFP) e un conxugado sideróforo amonabactina - sulforodamina B (AMB-SRB), cuxas propiedades foron analizadas mediante microscopia de fluorescencia convencional e de varrido láser confocal. Obtivéronse imaxes da distribución de ambas sondas nas larvas de peixe cebra e, en consecuencia, de A. salmonicida. Demostrouse que a bacteria provoca un efecto nocivo sobre o peixe cebra, chegando a provocar a morte ao exponerse á maior concentración probada. En canto á fluorescencia das sondas, o sinal de ambas obsérvase no tracto dixestivo, mostrándose maior intensidade coa bacteria marcada con GFP. Estes resultados son útiles para profundizar no estudo da furunculose en peixes de acuicultura.[Abstract]: The zebrafish (Danio rerio) is a potential model organism in the study of diseases that affect fish in aquaculture, as well as in their subsequent treatment. This work focuses on the study of furunculosis in zebrafish, a pathology caused by Aeromonas salmonicida subps. salmonicida, which generates large economic losses in the aquaculture industry. Mortality and fluorescent properties of A. salmonicida labeled with two fluorescent probes were evaluated in zebrafish larvae. The probes used are the green fluorescent protein (GFP) and the siderophore amonabactin - sulforhodamine B conjugate (AMBSRB), whose properties were analyzed by convencional and confocal laser scanning fluorescence microscopy. Images of the distribution of both probes in zebrafish larvae and, consequently, of A. salmonicida was obtained. The bacteria was shown to cause a harmful effect on zebrafish, leading to death upon exposure to the highest concentration tested. As for the fluorescence of the probes, the signal of both is observed in the digestive tract, showing great intensity with the bacteria labeled with GFP. These results are useful to deepen the study of furunculosis in aquaculture fish.Traballo fin de grao (UDC.CIE). Bioloxía. Curso 2021/202

Design and synthesis of a fluorescent probe based on amonabactin siderophore from the pathogenic bacterium "Aeromonas salmonicida" subsp. "salmonicida"

[Resumen]: La industria acuícola está siendo enormemente afectada por la aparición y propagación de enfermedades infecciosas en los peces y la elevada resistencia de las bacterias que las provocan a los antibióticos actuales. Por tanto, surge la necesidad de profundizar en el estudio de esas enfermedades infecciosas con el fin de desarrollar nuevos fármacos más efectivos. En este trabajo se propuso la síntesis de una sonda fluorescente (conjugado sideróforo-fluoróforo) para el posterior estudio de su internalización dentro de la bacteria y la monitorización de la forunculosis provocada por Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. El sideróforo seleccionado como vector de entrada en la bacteria es un análogo de amonabactinas responsable de la captación de Fe(III) de la bacteria patógena A. salmonicida, siendo el fluoróforo la sulforodamina B. El espaciador utilizado para conectar el sideróforo y el fluoróforo fue PEG2, distinto al empleado en estudios previos. El trabajo realizado permitió la obtención de un conjugado entre el sideróforo convenientemente protegido y el fluoróforo, la sulforodamina B, que fue caracterizado tanto por RMN como por espectrometría de masas. La eliminación de los grupos protectores del conjugado obtenido permitirá obtener la sonda fluorescente deseada.[Resumo]: A industria acuícola está sendo enormemente afectada pola aparición e propagación de enfermidades infecciosas nos peixes e a elevada resistencia das bacterias que as provocan aos antibióticos actuais. Por tanto, surxe a necesidade de profundizar no estudo desas enfermidades infecciosas co fin de desenvolver novos fármacos máis efectivos. Neste traballo propúxose a síntese dunha sonda fluorescente (conxugado sideróforo-fluoróforo) para o posterior estudo da súa internalización dentro da bacteria e a monitorización da forunculosis provocada por Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. O sideróforo seleccionado como vector de entrada na bacteria é un análogo de amonabactinas responsable da captación de Fe(III) da bacteria patóxena A. salmonicida, sendo o fluoróforo a sulforodamina B. O espaciador utilizado para conectar o sideróforo e o fluoróforo foi PEG2, distinto ao empregado en estudos previos. O traballo realizado permitiu a obtención dun conxugado entre o sideróforo convenientemente protexido e o fluoróforo, a sulfordamina B, que foi caracterizado tanto por RMN coma por espectrometría de masas. A eliminación dos grupos protectores do conxugado obtido permitirá obter a sonda fluorescente desexada.[Abstract]: The aquaculture industry is being severely affected by the emergence and spread of infectious diseases in fish and the high resistance of bacteria that cause them to current antibiotics. Therefore, there is a need to deepen the study of these infectious diseases in order to develop new and more effective drugs. In this work, the synthesis of a fluorescent probe (siderophore-fluorophore conjugate) was proposed for the subsequent study of its internalization within the bacterium and the monitoring of forunculosis caused by Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. The siderophore selected as an input vector in the bacterium is an analog of the amonabactins, which are involved in the uptake of Fe(III) by the pathogenic bacterium A. salmonicida and the fluorophore is sulforodamine B. The spacer used to connect the siderophore and the fluorophore was PEG2, different from the one used in previous studies. This work allowed to obtain a conjugate between the suitably protected siderophore and fluorophore, the sulforhodamine B, which was characterized by both NMR and mass spectrometry. The elimination of the protecting groups of the obtained conjugate will allow obtaining the desired fluorescent probe.Traballo fin de grao (UDC.CIE). Química. Curso 2021/202