Dos herramientas bioinformáticas para el análisis de genomas de bacterias fitopatógenas

Comunicación seleccionada como presentación oral plenariaLos avances en tecnología de secuenciación han supuesto una cosiderable reducción en costo y tiempo a la hora de obtener genomas bacterianos completos. Es cada vez más frecuente, pues, secuenciar los genomas de las cepas bacterianas que son de particular interés, creciendo a su vez la necesidad de desarrollar herramientas computacionales para el análisis de las secuencias obtenidas. En lo que a bacterias patógenas se refiere, son de especial relevancia herramientas de detección de genes implicados en virulencia. En este contexto presentamos TTFShunter y ViRfAt, dos aplicaciones bioinformáticas que tienen como objeto facilitar la identificación genómica del arsenal de virulencia de bacterias secuenciadas. TTFShunter (http://bacterial-virulence-factors.cbgp.upm.es/T346Hunter) es una herramienta online de predicción de sistemas de secreción de tipo III, IV y VI (T3SS, T4SS y T6SS, respectivamente). Mediante exhaustivas búsquedas en la bibliografía científica, se construyó una base de datos de las secuencias genómicas correspondientes a los distintos componentes de los T3SS, T4SS y T6SS. Dada la secuencia de ADN de un genoma bacteriano, TTFShunter hace uso de la base de datos anterior para localizar regiones enriquecidas en dichos componentes. ViRfAt es también una aplicación web, en este caso de anotación de factores genómicos asociados a virulencia en planta. ViRfAt busca en genomas bacterianos una batería de factores de virulencia que incluye efectores, fitotoxinas, antibióticos, enzimas extracelulares, hormonas vegetales, adhesinas o sideróforos. Estos factores están incluidos en una base de datos manualmente curada, en cuya elaboración han participado diversos grupos de investigación nacionales expertos en bacterias fitopatógenas. Ambas herramientas presentan una sencilla interfaz web fácil de utilizar, donde una vez analizado el genoma de entrada los resultados se presentan gráficamente a través de un documento HTML intuitivo y fácilmente interpretable. TTFShunter y ViRfAt representan dos herramientas de gran ayuda a microbiológos para la identificación de factores bacterianos de virulencia en planta.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Bioinformatics and transcriptomics analyses of the HrpL regulon in Pseudomonas savastanoi pathovars of woody host.

The species Pseudomonas savastanoi, a member of the Pseudomonas syringae complex, includes four pathovars causing knots or excrescences in woody hosts: P. savastanoi pv. savastanoi (Psv), pv. fraxini (Psf), pv. nerii (Psn) and pv. retacarpa (Psr), comprising isolates from olive, ash, oleander and broom plants, respectively. One of the better characterized pathogenicity factor in this bacterial complex is the type III secretion system (T3SS) and its effector (T3E) repertoire. Transcription of the T3SS structural genes and most of its T3E genes is positively regulated HrpL. We have constructed ∆hrpL mutants in a model strain belonging to each of this four pathovars and analyzed the role of this gene in the pathogenicity of P. savastanoi. As previously reported for Psv and Psn, the hrpL gene is also necessary in Psf and Psr for both symptoms production during a compatible interaction and the induction of the hypersensitive response in a resistant host. To characterize the HrpL regulon, we are currently following two strategies (i) the bioinformatics identification of HrpL-dependent promoters in the genomes of several P. savastanoi pathovars and, (ii) a comparative RNAseq analysis of a wild-type Psv strain and its ∆hrpL mutant. The results obtained will be compared with those published for other P. syringae strains isolated from herbaceous hosts, in order to identify specific HrpL-dependent proteins involved in the interaction with woody hosts.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Biosynthesis of IAA in Pseudomonas savastanoi: a comparative genomic approach

Bacteria belonging to the Pseudomonas syringae complex cause diseases in a variety of woody and herbaceous plants. Pseudomonas savastanoi is a member of this complex and produces tumors or excrescences in the aerial parts of woody plants. The species is classified into four pathovars, i.e. savastanoi (Psv, olive), nerii (Psn, oleander), retacarpa (Psr, Spanish broom) and fraxini (Psf, ash). Our research group have carried out the sequencing, annotation and comparative analysis of the genomes of several strains belonging to these pathovars. These analyses have identified the set of genes belonging to the P. savastanoi pan-genome and the collection of pathovar- and strain-specific genes. Through the web app PIFAR (Plant-bacterium Interaction Factors Resource) we have determined the presence of potential virulence factors involved in the interaction of these pathovars with their hosts. Special attention was given to genes putatively involved in the production of indole-3-acetic acid (IAA), a pathogenicity factor in these bacteria. With the exception of Psf, P. savastanoi strains produce IAA from tryptophan through the indole-3-acetamide pathway (iaaM and iaaH genes). We have shown that a Psv iaaMH mutant drastically reduces IAA levels. However, this mutant produces amounts of this phytohormone similar to those synthesized by Psf strains. We are currently analyzing the role of several Psv genes in the biosynthesis of IAA through alternative pathways.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Análisis genómico y transcriptómico de los efectores del sistema de secreción tipo III en Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335

Presentación oralLa especie Pseudomonas savastanoi pertenece al complejo Pseudomonas syringae, el cual está constituido por un conjunto de bacterias fitopatógenas Gram (-) de alto interés agrícola y económico. Dentro de esta especie se han descrito hasta la fecha cuatro patovares capaces de infectar huéspedes leñosos: pv. savastanoi (aislados de olivo), pv. nerii (aislados de adelfa), pv. fraxini (aislados de fresno) y pv. retacarpa (aislados de retama). La cepa NCPPB 3335 del patovar savastanoi (Psv), establecida como modelo para el estudio de la interacción de Pseudomonas patógenas con plantas leñosas, es el agente causal de la tuberculosis del olivo, enfermedad caracterizada por la aparición de tumores en las partes aéreas de la planta. Uno de los factores de patogenicidad de Psv más relevante es el sistema de secreción tipo III (T3SS) y su repertorio de efectores (T3E). La disponibilidad de la secuencia de Psv NCPPB 3335 nos ha permitido la predicción bioinformática de los genes que codifican su T3SS y su repertorio de T3E en base a la homología con otros efectores previamente descritos. Esta cepa presenta un repertorio de efectores constituido por 28 T3E. Con el objetivo de analizar la expresión del repertorio de T3E en Psv, se ha llevado a cabo un análisis RNAseq comparativo entre la cepa silvestre Psv NCPPB 3335 y un mutante de la misma del gen hrpL, el cual codifica un activador transcripcional de los genes del T3SS y de la mayoría de sus T3E. Las secuencias procedentes de este RNAseq se están analizando actualmente y los resultados que se obtengan del mismo nos permitirá no sólo analizar la expresión de los T3E que hemos identificado en esta cepa, sino también caracterizar el regulón HrpL completo en la misma y quizás identificar nuevos posibles T3E. Los resultados obtenidos, se compararán con una predicción de promotores regulados por HrpL (hrp-box), que se llevará a cabo utilizando una herramienta bioinformática generada por nuestro equipo.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Comparative Analysis of the Type III Secretion System Effector Repertoires of Pseudomonas savastanoi Pathovars Pathogenic on Woody Hosts

Comunicación de tipo pósterThe species Pseudomonas savastanoi, a member of the Pseudomonas syringae complex, includes four pathovars causing knots or excrescences in woody hosts: P. savastanoi pv. savastanoi (Psv), pv. fraxini (Psf), pv. nerii (Psn) and pv. retacarpa (Psr), comprising isolates from olive, ash, oleander and broom plants, respectively. Pathogenicity of P. savastanoi is dependent, among other factors, on the type III secretion system (T3SS) and its effector (T3E) repertoire. Furthermore, a putative role in the interaction with woody hosts has been suggested for several of these T3E. The recent availability of the genome sequences of several P. savastanoi strains isolated from different hosts has facilitated bioinformatics predictions of their T3SS genes and T3E pools, the study of their distribution in other strains of the P. syringae complex isolated from woody hosts and the functional analysis of several of these secreted proteins. As previously reported for Psv, Psn and Psf, here we show that pathogenicity of Psr ICMP16945, is also dependent on the T3SS. Psv strains NCPPB 3335, ICMP4352 and PseNe107 share a core set of at least 22 T3E, 18 of which are also encoded in Psn ICMP16943, Psf ICMP7711 and Psr ICMP16945. However, these three strains encode truncated versions of 1-2 of these 18 T3E and, Psr ICMP16945 contains three pathovarspecific T3E. Our results also show that several T3E, including HopAO1, are phylogenetically clustered across the P. syringae complex according to the woody/herbaceous nature of their host of isolation, suggesting host specialization of these effectors in this complex.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tec

Identificación bioinformática y análisis funcional de factores de transcripción de Pseudomonas savastanoi potencialmente implicados en la infección de Mandevilla spp.

La bacteria fitopatógena Pseudomonas savastanoi, perteneciente al complejo Pseudomonas syringae, incluye 4 patovares aislados de diferentes plantas leñosas: pv. savastanoi (olivo), pv. nerii (adelfa), pv. fraxini (fresno) y pv. retacarpa (retama). Recientemente, se ha caracterizado en nuestro grupo un nuevo patovar causante de necrosis bacteriana en la planta ornamental dipladenia (Mandevilla spp.) (Caballo-Ponce, E, 2017, Tesis Doctoral). Estudios filogenéticos han demostrado la estrecha relación entre cepas del patovar nerii (Psn) y las aisladas de Mandevilla spp. (Psm), sin embargo, éstas difieren en el rango de huésped. En este trabajo hemos llevado a cabo un análisis bioinformático comparativo del repertorio de posibles factores de transcripción codificados en los genomas de la cepa Ph3 de Psm y de las cepas de Psn ICMP16943 (capaz de infectar dipladenia y adelfa) y ESC23 (infecta solamente adelfa). De la comparativa bioinformática de un total de 500 posibles factores de transcripción, se han seleccionado 9 de ellos: 3 factores exclusivos de Psm Ph3, 2 factores truncados en Psm Ph3 y 4 factores ausentes en las cepas capaces de infectar dipladenia (Psn ICMP16943 y Psm Ph3). La ausencia/presencia o el truncamiento de los genes codificadores de estos factores se ha comprobado en estas y otras cepas de P. savastanoi mediante técnicas de PCR y secuenciación. Actualmente estamos llevando a cabo la construcción de mutantes en los factores seleccionados para determinar su papel en la infección de dipladenia. Este trabajo pretende contribuir en el conocimiento de los determinantes genéticos implicados en la especificidad de huésped de los diversos patovares de la especie P. savastanoi.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Identificación bioinformática y análisis funcional de factores de transcripción de Pseudomonas savastanoi potencialmente implicados en la infección de Mandevilla spp.

La bacteria fitopatógena Pseudomonas savastanoi, perteneciente al complejo Pseudomonas syringae, incluye cuatro patovares aislados de diferentes plantas leñosas: pv. savastanoi (olivo), pv. nerii (adelfa), pv. fraxini (fresno) y pv. retacarpa (retama). Recientemente, se ha caracterizado en nuestro grupo un nuevo patovar (Psm) causante de necrosis bacteriana en la planta ornamental dipladenia (Mandevilla spp.) (Caballo-Ponce, E, 2017, Tesis Doctoral). Estudios filogenéticos han demostrado la estrecha relación existente entre cepas del patovar nerii (Psn) y las aisladas de Mandevilla spp., aun cuando éstas difieren en el rango de huésped. En este trabajo hemos llevado a cabo un análisis bioinformático comparativo del repertorio de posibles factores de transcripción (Fts) codificados en los genomas de la cepa Ph3 de Psm y de las cepas de Psn ICMP16943 y ESC23. La búsqueda se centró en aquellos Fts posiblemente implicados en la infección de dipladenia, seleccionando un total de nueve posibles Fts: tres factores exclusivos de Psm Ph3, dos factores truncados exclusivamente en Psm Ph3 y cuatro factores ausentes tanto en Psn ICMP16943 como Psm Ph3 (las dos cepas que infectan dipladenia). De entre los TFs identificados, hemos seleccionados tres que forman parte de un posible operón junto a otros genes implicados en quimiotaxis. Se han construido mutantes de este operón en cada uno de los tres genes codificadores de los Fts seleccionados y en dos genes codificadores de Methyl Chemotaxis proteins (MCP). Actualmente estamos analizando el papel de estos genes en la patogenicidad en plantas de dipladenia y su implicación en quimiotaxis. Este trabajo pretende contribuir en el conocimiento de los determinantes genéticos implicados en la especificidad de huésped de los diversos patovares de la especie P. savastanoi.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Sequence and Role in Virulence of the Three Plasmid Complement of the Model Tumor-Inducing Bacterium Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335

Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 is a model for the study of the molecular basis of disease production and tumor formation in woody hosts, and its draft genome sequence has been recently obtained. Here we closed the sequence of the plasmid complement of this strain, composed of three circular molecules of 78,357 nt (pPsv48A), 45,220 nt (pPsv48B), and 42,103 nt (pPsv48C), all belonging to the pPT23A-like family of plasmids widely distributed in the P. syringae complex. A total of 152 coding sequences were predicted in the plasmid complement, of which 38 are hypothetical proteins and seven correspond to putative virulence genes. Plasmid pPsv48A contains an incomplete Type IVB secretion system, the type III secretion system (T3SS) effector gene hopAF1, gene ptz, involved in cytokinin biosynthesis, and three copies of a gene highly conserved in plant-associated proteobacteria, which is preceded by a hrp box motif. A complete Type IVA secretion system, a well conserved origin of transfer (oriT), and a homolog of the T3SS effector gene hopAO1 are present in pPsv48B, while pPsv48C contains a gene with significant homology to isopentenyl-diphosphate delta-isomerase, type 1. Several potential mobile elements were found on the three plasmids, including three types of MITE, a derivative of IS801, and a new transposon effector, ISPsy30. Although the replication regions of these three plasmids are phylogenetically closely related, their structure is diverse, suggesting that the plasmid architecture results from an active exchange of sequences. Artificial inoculations of olive plants with mutants cured of plasmids pPsv48A and pPsv48B showed that pPsv48A is necessary for full virulence and for the development of mature xylem vessels within the knots; we were unable to obtain mutants cured of pPsv48C, which contains five putative toxin-antitoxin genes

The complete genome analysis of Bacillus amyloliquefaciens UMAF6614 and UMAF6639 reveals genetics features involved in biocontrol activity and bacterial fitness

Comunicación presentada en formato panel en la sesión "Biocontrol"The Bacillus amyloliquefaciens strains UMAF6614 and UMAF6639 were originally isolated from healthy leaf areas of melon plants naturally infected with the cucurbit powdery mildew fungus Podosphaera fusca. In previous works, we have demonstrated the multifaceted bicontrol activity of these strains based on: i) direct antagonism against fungal and bacterial pathogens of cucurbits, and ii) induction of plant defense mechanisms (ISR) and promotion of plant growth when applied to roots. With the idea to look for bacterial features responsible for the outstanding biocontrol activity of these strains we decided to sequence and analyze their genomes. Some of the most relevant findings obtained from initial genome analyses are: First, though initially identified as B. subtilis, a more robust phylogenetic analysis has confirmed the identification of both strains as B. amyloliquefaciens. Second, detection of bacterial features involved in diverse mechanisms of action and engaged in the biocontrol activity of these strains: the synthesis of secondary metabolites, production of phytohormones, or multicellular behavior as biofilm formation. Third, the development of new bioinformatics tools in combination with open access softwares have permitted to identify unique regions in either of our strains and non-conserved within the Bacillus genus. Ongoing studies are focused on elucidating the putative implication of these uncharacterized regions in the biocontrol activity of these strains.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Plan Nacional Plan I+D+I del antiguo Ministerio de Ciencia e Innovación (AGL2010-21848-CO2-01) e Incentivos a Proyectos de Excelencia de la Junta de Andalucía (P10-AGR-57-97), ambos cofinanciados con fondos FEDER (UE)

Análisis de los metabolitos secundarios producidos por los agentes de control biológico Bacillus amyloliquefaciens CECT 8237 Y CECT 8238

Las cepas de Bacillus amyloliquefaciens CECT 8237 (UMAF6639) y CECT 8238 (UMAF6614) han sido ampliamente estudiadas en trabajos previos de nuestro grupo por su reseñable capacidad de biocontrol. Desde un principio ha destacado su actividad antagonista frente a Podosphaera fusca y ciertas bacterias patógenas de cucurbitáceas, siendo la antibiosis mediada por lipopéptidos tales como iturinas y fengicinas, uno de los principales mecanismos de acción. La secuenciación de los genomas de ambas cepas nos ha permitido localizar un amplio grupo de genes implicados en la síntesis de otros antibióticos ya descritos con anterioridad en otras cepas del género Bacillus. Sin embargo, las cepas CECT 8237 y CECT 8238 siguen mostrando mayor capacidad de biocontrol que otros agentes de biocontrol, lo que nos lleva a pensar en la producción de otras moléculas activas. Por ello, hemos desarrollado herramientas bioinformáticas que han facilitado la identificación de regiones poco conservadas con respecto al género Bacillus, así como regiones presentes solo en las cepas de estudio. También se pudo determinar si la adquisición de estas regiones genómicas por parte de estas bacterias se debía a procesos de transferencia horizontal, debido a las variaciones en el patrón de tripletes de aminoácidos y/o en el contenido en GC de dichas zonas. Actualmente, se está realizando la caracterización de algunas de las regiones identificadas en la cepa CECT 8237, cuyos genes parecen estar implicados en la síntesis de nuevos antibióticos no descritos hasta la fecha. Todos estos resultados refuerzan la hipótesis de que la producción de antibióticos es el mecanismo de acción determinante en la actividad de biocontrol de estas bacterias.Este trabajo ha sido financiado por ayudas del Plan Nacional de I+D+I del Ministerio de Ciencia e Innovación (AGL2010-21848-CO2-01) e Incentivos a Proyectos de Excelencia de la Junta de Andalucía (P10-AGR-5797), ambos cofinanciados con fondos FEDER (UE) y una ayuda del Plan Propio de Investigación de la Universidad de Málaga, Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech