Development of soft and rigid membrane nanotemplates for the mechanistic analysis of Dynamin I action on curved surfaces

141 p.En los últimos años se ha ido desvelando el rol activo de la curvaturade membrana en los procesos de reorganización de membranas celulares. Lamayoría de las membranas celulares presentan una cierta curvatura; dichacurvatura es moderada en los casos de orgánulos tubulares e incluso puedellegar a ser una curvatura extrema como es el caso de los poros de fisión yfusión. Experimentos in vitro en pequeñas vesículas unilamelares (SUVs) onanotubos lipídicos (NTs) muestran la efectividad de la curvatura demembrana en la segregación lipídica y formación de dominios activos entransformaciones morfológicas.El trabajo en esta tesis ha consistido en desarrollar herramientas invitro que nos ayuden a estudiar los procesos de elevada curvatura con laadecuada resolución espacial y temporal, y a su vez que nos permitanesclarecer los mecanismos de creación de curvatura de membrana y losprocesos de la remodelación celular. Los patrones lipídicos utilizados sepueden dividir en patrones blandos (NTs lipidicos) o patrones rígidos(nanoalambres de silicio (SiNWs) cubiertos de membrana).Los NT blandos utilizados poseen un diámetro luminal de variasdecenas de nanómetros y pueden tener desde unas decenas de nanómetroshasta micras de longitud. Los nanotubos más largos obtenidos a partir devesículas gigantes (GUVs), son más anchos pero permiten la visualizaciónsimultanea por microscopía de fluorescencia. Los nanotubos más cortos sonobtenidos a partir de bicapas lipídicas negras (BLMs), con mayor tensión quelos GUVs, por lo que poseen unos radios muy reducidos.La diferencia de radios de los NTs son el resultado de diversosparámetros mecánicos de la membrana que forma el tubo. Los parámetrosmecánicos que definen la geometría del NT son la rigidez a la flexión (k,definida por la composición lipídica) y la tensión lateral de la membrana (¿¿).En este trabajo la composición lipídica fue idéntica tanto para los GUVs comopara las BLMs, por lo que el radio de los NTs estaba regulado tan sólo por latensión lateral de la membrana origen.La determinación cuantitativa de los radios de los NTs se hacemediante el paso de una corriente eléctrica por el interior del NT demembrana. El NT de membrana ofrece una resistencia al paso de la corrienteque es función del área de la sección transversal del mismo, de tal forma queexiste una dependencia del radio del NT y de su longitud. Al incrementar oempequeñecer la longitud del NT obtenemos una respuesta en la medida deconductancia reduciéndose o agrandándose ésta. De esta forma se puedehallar el radio del NT.Para los NTs obtenidos a partir de GUVs se determinó que el voltajeafecta la forma del NT, dejando éste de ser cilíndrico. Se determina en estetrabajo que el radio del NT sufre una desviación !!" !!! ! que depende de lalongitud total del NT. De tal forma que el gradiente de voltaje que existe enel tubo origina una variación en la tensión lateral y esto da como resultadouna forma de ¿trompeta¿ en el NT.Las medidas de conductancia sobre un NT permiten calcular en tiemporeal y simultáneamente los parámetros mecánicos de la membrana del NT.Se procede al calculo de dichos parámetros para varias composicioneslipídicas conocidas en la literatura actualComo se puede apreciar en lo anteriormente descrito, esta técnicaofrece una medida directa de la geometría del NT así como de los parámetrosmecánicos que la determinan y sirve como una inestimable ayuda para elestudio de la creación de nuevos compartimentos de membrana promovidospor la presencia de proteínas de fisión.La segunda parte de esta tesis está dedicada al estudio del proceso defisión promovido por la proteína dinamina I (Dyn1), siendo ésta el prototipode proteína de fisión. La Dyn1 es una guanosina-5¿-trifosfatasa (GTPasa) decasi 900 amino ácidos y 100 KDa. La Dyn1 es la proteína de fisión másestudiada ya que esta íntimamente envuelta en los procesos de endocitosismediados por la clatrina. Se sabe que precisamente la Dyn1 es laresponsable de la fisión de las vesículas en estos procesos.Sobre el modus operandi de la Dyn 1 in vivo se sabe que necesita laexistencia de un cuello de membrana de elevada curvatura (cuellomimetizado in vitro por un NT) para polimerizar sus monómeros alrededor deeste, hidrolizar las moléculas de guanosina-5¿-trifosfato (GTP) y por últimogestionar la fisión de la membrana. En este trabajo se hacen referencia a dosde los diferentes estados conformacionales de la Dyn1, uno el estado en elque el polímero se ha enlazado a la molécula de GTP y lo llamaremos de aquíen adelante estado basal y un segundo estado pre-hidrólisis en el que laDyn 1 sigue enlazada al guanosina difosfato (GDP) y al P que se llamaráestado de transición. La naturaleza efímera de éstos estados imposibilita elestudio de estas configuraciones transitorias. Para posibilitar la obtención deinformación debemos de parar el proceso en estos estadios. Usando unamutación de la Dyn1 en combinación con de una fijación química(crosslinker), nuestros colaboradores (Laboratorio de la Dra. Sandra Schmid,en UT Southwestern, Texas, EEUU) han conseguido crear una mutante delestado de transición de la Dyn1. Ello nos permitió estudiar el papel que juegaesta configuración de la proteína en el proceso de fisión de la membrana.Cuando este mutante se añadió a los NT blandos, se observó la formación deun estado de hemifisión de la membrana, que nunca antes se habíadetectado in vitro. Cabe destacar que la formación del estado de hemifisiónde la membrana sólo fue posible en ausencia de GTP. La adición de GTPpromovió la desestabilización del andamiaje de la dinamina, disminuyendo sucapacidad de constricción de la membrana. Todo ello, unido a datosobtenidos por técnicas complementarias permitió proponer un mecanismodetallado de la fisión de la membrana por la dinamina, donde se da granimportancia a la inserción coordinada de los dominios PH de la dinaminadentro de la membrana para la formación del estado de hemifisión. La fisióncompleta es una consecuencia de la hidrólisis del GTP por la proteína y deldesensamblaje del polímero de dynamina sobre la membrana.En la última parte de la tesis se ha estudiado la interacción de la Dyn1con los NT rígidos formados por nanoalambres de silicona recubierdos debicapa lipídica. Éstas plantillas además de ser rígidas presentan la forma dehemicilindro, por lo que la dinamina no puede ensamblarse en un circulocompleto encima de ellas. Se observó la formación de oligómeros de Dyn1encima de éstos hemicilindros. Además, éstos oligómeros preservan lahabilidad de hidrolizar GTP. El rol de estos oligomeros in vivo se aclarará enfuturos estudios.CSIC-UPV/EHU; Fundación Biofísica Bizkai

Spatiotemporal Characteristics of the Largest HIV-1 CRF02_AG Outbreak in Spain: Evidence for Onward Transmissions

Background and Aim: The circulating recombinant form 02_AG (CRF02_AG) is the predominant clade among the human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) non-Bs with a prevalence of 5.97% (95% Confidence Interval-CI: 5.41–6.57%) across Spain. Our aim was to estimate the levels of regional clustering for CRF02_AG and the spatiotemporal characteristics of the largest CRF02_AG subepidemic in Spain.Methods: We studied 396 CRF02_AG sequences obtained from HIV-1 diagnosed patients during 2000–2014 from 10 autonomous communities of Spain. Phylogenetic analysis was performed on the 391 CRF02_AG sequences along with all globally sampled CRF02_AG sequences (N = 3,302) as references. Phylodynamic and phylogeographic analysis was performed to the largest CRF02_AG monophyletic cluster by a Bayesian method in BEAST v1.8.0 and by reconstructing ancestral states using the criterion of parsimony in Mesquite v3.4, respectively.Results: The HIV-1 CRF02_AG prevalence differed across Spanish autonomous communities we sampled from (p < 0.001). Phylogenetic analysis revealed that 52.7% of the CRF02_AG sequences formed 56 monophyletic clusters, with a range of 2–79 sequences. The CRF02_AG regional dispersal differed across Spain (p = 0.003), as suggested by monophyletic clustering. For the largest monophyletic cluster (subepidemic) (N = 79), 49.4% of the clustered sequences originated from Madrid, while most sequences (51.9%) had been obtained from men having sex with men (MSM). Molecular clock analysis suggested that the origin (tMRCA) of the CRF02_AG subepidemic was in 2002 (median estimate; 95% Highest Posterior Density-HPD interval: 1999–2004). Additionally, we found significant clustering within the CRF02_AG subepidemic according to the ethnic origin.Conclusion: CRF02_AG has been introduced as a result of multiple introductions in Spain, following regional dispersal in several cases. We showed that CRF02_AG transmissions were mostly due to regional dispersal in Spain. The hot-spot for the largest CRF02_AG regional subepidemic in Spain was in Madrid associated with MSM transmission risk group. The existence of subepidemics suggest that several spillovers occurred from Madrid to other areas. CRF02_AG sequences from Hispanics were clustered in a separate subclade suggesting no linkage between the local and Hispanic subepidemics

Development of soft and rigid membrane nanotemplates for the mechanistic analysis of Dynamin I action on curved surfaces

141 p.En los últimos años se ha ido desvelando el rol activo de la curvaturade membrana en los procesos de reorganización de membranas celulares. Lamayoría de las membranas celulares presentan una cierta curvatura; dichacurvatura es moderada en los casos de orgánulos tubulares e incluso puedellegar a ser una curvatura extrema como es el caso de los poros de fisión yfusión. Experimentos in vitro en pequeñas vesículas unilamelares (SUVs) onanotubos lipídicos (NTs) muestran la efectividad de la curvatura demembrana en la segregación lipídica y formación de dominios activos entransformaciones morfológicas.El trabajo en esta tesis ha consistido en desarrollar herramientas invitro que nos ayuden a estudiar los procesos de elevada curvatura con laadecuada resolución espacial y temporal, y a su vez que nos permitanesclarecer los mecanismos de creación de curvatura de membrana y losprocesos de la remodelación celular. Los patrones lipídicos utilizados sepueden dividir en patrones blandos (NTs lipidicos) o patrones rígidos(nanoalambres de silicio (SiNWs) cubiertos de membrana).Los NT blandos utilizados poseen un diámetro luminal de variasdecenas de nanómetros y pueden tener desde unas decenas de nanómetroshasta micras de longitud. Los nanotubos más largos obtenidos a partir devesículas gigantes (GUVs), son más anchos pero permiten la visualizaciónsimultanea por microscopía de fluorescencia. Los nanotubos más cortos sonobtenidos a partir de bicapas lipídicas negras (BLMs), con mayor tensión quelos GUVs, por lo que poseen unos radios muy reducidos.La diferencia de radios de los NTs son el resultado de diversosparámetros mecánicos de la membrana que forma el tubo. Los parámetrosmecánicos que definen la geometría del NT son la rigidez a la flexión (k,definida por la composición lipídica) y la tensión lateral de la membrana (¿¿).En este trabajo la composición lipídica fue idéntica tanto para los GUVs comopara las BLMs, por lo que el radio de los NTs estaba regulado tan sólo por latensión lateral de la membrana origen.La determinación cuantitativa de los radios de los NTs se hacemediante el paso de una corriente eléctrica por el interior del NT demembrana. El NT de membrana ofrece una resistencia al paso de la corrienteque es función del área de la sección transversal del mismo, de tal forma queexiste una dependencia del radio del NT y de su longitud. Al incrementar oempequeñecer la longitud del NT obtenemos una respuesta en la medida deconductancia reduciéndose o agrandándose ésta. De esta forma se puedehallar el radio del NT.Para los NTs obtenidos a partir de GUVs se determinó que el voltajeafecta la forma del NT, dejando éste de ser cilíndrico. Se determina en estetrabajo que el radio del NT sufre una desviación !!" !!! ! que depende de lalongitud total del NT. De tal forma que el gradiente de voltaje que existe enel tubo origina una variación en la tensión lateral y esto da como resultadouna forma de ¿trompeta¿ en el NT.Las medidas de conductancia sobre un NT permiten calcular en tiemporeal y simultáneamente los parámetros mecánicos de la membrana del NT.Se procede al calculo de dichos parámetros para varias composicioneslipídicas conocidas en la literatura actualComo se puede apreciar en lo anteriormente descrito, esta técnicaofrece una medida directa de la geometría del NT así como de los parámetrosmecánicos que la determinan y sirve como una inestimable ayuda para elestudio de la creación de nuevos compartimentos de membrana promovidospor la presencia de proteínas de fisión.La segunda parte de esta tesis está dedicada al estudio del proceso defisión promovido por la proteína dinamina I (Dyn1), siendo ésta el prototipode proteína de fisión. La Dyn1 es una guanosina-5¿-trifosfatasa (GTPasa) decasi 900 amino ácidos y 100 KDa. La Dyn1 es la proteína de fisión másestudiada ya que esta íntimamente envuelta en los procesos de endocitosismediados por la clatrina. Se sabe que precisamente la Dyn1 es laresponsable de la fisión de las vesículas en estos procesos.Sobre el modus operandi de la Dyn 1 in vivo se sabe que necesita laexistencia de un cuello de membrana de elevada curvatura (cuellomimetizado in vitro por un NT) para polimerizar sus monómeros alrededor deeste, hidrolizar las moléculas de guanosina-5¿-trifosfato (GTP) y por últimogestionar la fisión de la membrana. En este trabajo se hacen referencia a dosde los diferentes estados conformacionales de la Dyn1, uno el estado en elque el polímero se ha enlazado a la molécula de GTP y lo llamaremos de aquíen adelante estado basal y un segundo estado pre-hidrólisis en el que laDyn 1 sigue enlazada al guanosina difosfato (GDP) y al P que se llamaráestado de transición. La naturaleza efímera de éstos estados imposibilita elestudio de estas configuraciones transitorias. Para posibilitar la obtención deinformación debemos de parar el proceso en estos estadios. Usando unamutación de la Dyn1 en combinación con de una fijación química(crosslinker), nuestros colaboradores (Laboratorio de la Dra. Sandra Schmid,en UT Southwestern, Texas, EEUU) han conseguido crear una mutante delestado de transición de la Dyn1. Ello nos permitió estudiar el papel que juegaesta configuración de la proteína en el proceso de fisión de la membrana.Cuando este mutante se añadió a los NT blandos, se observó la formación deun estado de hemifisión de la membrana, que nunca antes se habíadetectado in vitro. Cabe destacar que la formación del estado de hemifisiónde la membrana sólo fue posible en ausencia de GTP. La adición de GTPpromovió la desestabilización del andamiaje de la dinamina, disminuyendo sucapacidad de constricción de la membrana. Todo ello, unido a datosobtenidos por técnicas complementarias permitió proponer un mecanismodetallado de la fisión de la membrana por la dinamina, donde se da granimportancia a la inserción coordinada de los dominios PH de la dinaminadentro de la membrana para la formación del estado de hemifisión. La fisióncompleta es una consecuencia de la hidrólisis del GTP por la proteína y deldesensamblaje del polímero de dynamina sobre la membrana.En la última parte de la tesis se ha estudiado la interacción de la Dyn1con los NT rígidos formados por nanoalambres de silicona recubierdos debicapa lipídica. Éstas plantillas además de ser rígidas presentan la forma dehemicilindro, por lo que la dinamina no puede ensamblarse en un circulocompleto encima de ellas. Se observó la formación de oligómeros de Dyn1encima de éstos hemicilindros. Además, éstos oligómeros preservan lahabilidad de hidrolizar GTP. El rol de estos oligomeros in vivo se aclarará enfuturos estudios.CSIC-UPV/EHU; Fundación Biofísica Bizkai

COVID-19 in hospitalized HIV-positive and HIV-negative patients : A matched study

CatedresObjectives: We compared the characteristics and clinical outcomes of hospitalized individuals with COVID-19 with [people with HIV (PWH)] and without (non-PWH) HIV co-infection in Spain during the first wave of the pandemic. Methods: This was a retrospective matched cohort study. People with HIV were identified by reviewing clinical records and laboratory registries of 10 922 patients in active-follow-up within the Spanish HIV Research Network (CoRIS) up to 30 June 2020. Each hospitalized PWH was matched with five non-PWH of the same age and sex randomly selected from COVID-19@Spain, a multicentre cohort of 4035 patients hospitalized with confirmed COVID-19. The main outcome was all-cause in-hospital mortality. Results: Forty-five PWH with PCR-confirmed COVID-19 were identified in CoRIS, 21 of whom were hospitalized. A total of 105 age/sex-matched controls were selected from the COVID-19@Spain cohort. The median age in both groups was 53 (Q1-Q3, 46-56) years, and 90.5% were men. In PWH, 19.1% were injecting drug users, 95.2% were on antiretroviral therapy, 94.4% had HIV-RNA < 50 copies/mL, and the median (Q1-Q3) CD4 count was 595 (349-798) cells/μL. No statistically significant differences were found between PWH and non-PWH in number of comorbidities, presenting signs and symptoms, laboratory parameters, radiology findings and severity scores on admission. Corticosteroids were administered to 33.3% and 27.4% of PWH and non-PWH, respectively (P = 0.580). Deaths during admission were documented in two (9.5%) PWH and 12 (11.4%) non-PWH (P = 0.800). Conclusions: Our findings suggest that well-controlled HIV infection does not modify the clinical presentation or worsen clinical outcomes of COVID-19 hospitalization

How do women living with HIV experience menopause? Menopausal symptoms, anxiety and depression according to reproductive age in a multicenter cohort

CatedresBackground: To estimate the prevalence and severity of menopausal symptoms and anxiety/depression and to assess the differences according to menopausal status among women living with HIV aged 45-60 years from the cohort of Spanish HIV/AIDS Research Network (CoRIS). Methods: Women were interviewed by phone between September 2017 and December 2018 to determine whether they had experienced menopausal symptoms and anxiety/depression. The Menopause Rating Scale was used to evaluate the prevalence and severity of symptoms related to menopause in three subscales: somatic, psychologic and urogenital; and the 4-item Patient Health Questionnaire was used for anxiety/depression. Logistic regression models were used to estimate odds ratios (ORs) of association between menopausal status, and other potential risk factors, the presence and severity of somatic, psychological and urogenital symptoms and of anxiety/depression. Results: Of 251 women included, 137 (54.6%) were post-, 70 (27.9%) peri- and 44 (17.5%) pre-menopausal, respectively. Median age of onset menopause was 48 years (IQR 45-50). The proportions of pre-, peri- and post-menopausal women who had experienced any menopausal symptoms were 45.5%, 60.0% and 66.4%, respectively. Both peri- and post-menopause were associated with a higher likelihood of having somatic symptoms (aOR 3.01; 95% CI 1.38-6.55 and 2.63; 1.44-4.81, respectively), while post-menopause increased the likelihood of having psychological (2.16; 1.13-4.14) and urogenital symptoms (2.54; 1.42-4.85). By other hand, post-menopausal women had a statistically significant five-fold increase in the likelihood of presenting severe urogenital symptoms than pre-menopausal women (4.90; 1.74-13.84). No significant differences by menopausal status were found for anxiety/depression. Joint/muscle problems, exhaustion and sleeping disorders were the most commonly reported symptoms among all women. Differences in the prevalences of vaginal dryness (p = 0.002), joint/muscle complaints (p = 0.032), and sweating/flush (p = 0.032) were found among the three groups. Conclusions: Women living with HIV experienced a wide variety of menopausal symptoms, some of them initiated before women had any menstrual irregularity. We found a higher likelihood of somatic symptoms in peri- and post-menopausal women, while a higher likelihood of psychological and urogenital symptoms was found in post-menopausal women. Most somatic symptoms were of low or moderate severity, probably due to the good clinical and immunological situation of these women

Espacios y destinos turísticos en tiempos de globalización y crisis

2 volúmenesXII Coloquio de Geografía del Turismo, Ocio y Recreación de la Asociación de Geógrafos Españoles. Colmenarejo (Madrid), del 17 al 19 de junio de 2010.Este libro ha sido editado con la colaboración económica del Ministerio de Ciencia e Innovación (ref. CS02010-10416-E)