Targeting unfolded protein response reverts ER stress and ER Ca2+ homeostasis in cardiomyocytes expressing the pathogenic variant of Lamin A/C R321X

Background: We previously demonstrated that an Italian family affected by a severe dilated cardiomyopathy (DCM) with history of sudden deaths at young age, carried a mutation in the Lmna gene encoding for a truncated variant of the Lamin A/C protein (LMNA), R321X. When expressed in heterologous systems, such variant accumulates into the endoplasmic reticulum (ER), inducing the activation of the PERK-CHOP pathway of the unfolded protein response (UPR), ER dysfunction and increased rate of apoptosis. The aim of this work was to analyze whether targeting the UPR can be used to revert the ER dysfunction associated with LMNA R321X expression in HL-1 cardiac cells. Methods: HL-1 cardiomyocytes stably expressing LMNA R321X were used to assess the ability of 3 different drugs targeting the UPR, salubrinal, guanabenz and empagliflozin to rescue ER stress and dysfunction. In these cells, the state of activation of both the UPR and the pro-apoptotic pathway were analyzed monitoring the expression levels of phospho-PERK, phospho-eIF2α, ATF4, CHOP and PARP-CL. In addition, we measured ER-dependent intracellular Ca2+ dynamics as indicator of proper ER functionality. Results: We found that salubrinal and guanabenz increased the expression levels of phospho-eIF2α and downregulated the apoptosis markers CHOP and PARP-CL in LMNA R321X-cardiomyocytes, maintaining the so-called adaptive UPR. These drugs also restored ER ability to handle Ca2+ in these cardiomyocytes. Interestingly, we found that empagliflozin downregulated the apoptosis markers CHOP and PARP-CL shutting down the UPR itself through the inhibition of PERK phosphorylation in LMNA R321X-cardiomyocytes. Furthermore, upon empagliflozin treatment, ER homeostasis, in terms of ER ability to store and release intracellular Ca2+ was also restored in these cardiomyocytes. Conclusions: We provided evidence that the different drugs, although interfering with different steps of the UPR, were able to counteract pro-apoptotic processes and to preserve the ER homeostasis in R321X LMNA-cardiomyocytes. Of note, two of the tested drugs, guanabenz and empagliflozin, are already used in the clinical practice, thus providing preclinical evidence for ready-to-use therapies in patients affected by the LMNA R321X associated cardiomyocytes

Role of Nuclear Lamin A/C in the Regulation of Nav1.5 Channel and Microtubules: Lesson From the Pathogenic Lamin A/C Variant Q517X

In this work, we studied an lmna nonsense mutation encoding for the C-terminally truncated Lamin A/C (LMNA) variant Q517X, which was described in patients affected by a severe arrhythmogenic cardiomyopathy with history of sudden death. We found that LMNA Q517X stably expressed in HL-1 cardiomyocytes abnormally aggregates at the nuclear envelope and within the nucleoplasm. Whole-cell patch clamp experiments showed that LMNA Q517X-expressing cardiomyocytes generated action potentials with reduced amplitude, overshoot, upstroke velocity and diastolic potential compared with LMNA WT-expressing cardiomyocytes. Moreover, the unique features of these cardiomyocytes were 1) hyper-polymerized tubulin network, 2) upregulated acetylated α-tubulin, and 3) cell surface Nav1.5 downregulation. These findings pointed the light on the role of tubulin and Nav1.5 channel in the abnormal electrical properties of LMNA Q517X-expressing cardiomyocytes. When expressed in HEK293 with Nav1.5 and its β1 subunit, LMNA Q517X reduced the peak Na+ current (INa) up to 63% with a shift toward positive potentials in the activation curve of the channel. Of note, both AP properties in cardiomyocytes and Nav1.5 kinetics in HEK293 cells were rescued in LMNA Q517X-expressing cells upon treatment with colchicine, an FDA-approved inhibitor of tubulin assembly. In conclusion, LMNA Q517X expression is associated with hyper-polymerization and hyper-acetylation of tubulin network with concomitant downregulation of Nav1.5 cell expression and activity, thus revealing 1) new mechanisms by which LMNA may regulate channels at the cell surface in cardiomyocytes and 2) new pathomechanisms and therapeutic targets in cardiac laminopathies

Functional characterization of a novel truncating mutation in Lamin A/C gene in a family with a severe cardiomyopathy with conduction defects

Background/Aims: Truncating LMNA gene mutations occur in many inherited cardiomyopathy cases, but the molecular mechanisms involved in the disease they cause have not yet been systematically investigated. Here, we studied a novel frameshift LMNA variant (p.D243Gfs*4) identified in three members of an Italian family co-segregating with a severe form of cardiomyopathy with conduction defects. Methods: HEK293 cells and HL-1 cardiomyocytes were transiently transfected with either Lamin A or D243Gfs*4 tagged with GFP (or mCherry). D243Gfs*4 expression, cellular localization and its effects on diverse cellular mechanisms were evaluated with western blotting, laser-scanning confocal microscopy and video-imaging analysis in single cells. Results: When expressed in HEK293 cells, GFP- (or mCherry)-tagged LMNA D243Gfs*4 colocalized with calnexin within the ER. ER mislocalization of LMNA D243Gfs*4 did not significantly induce ER stress response, abnormal Ca2+ handling and apoptosis when compared with HEK293 cells expressing another truncated mutant of LMNA (R321X) which similarly accumulates within the ER. Of note, HEK293-LMNA D243Gfs*4 cells showed a significant reduction of connexin 43 (CX43) expression level, which was completely rescued by activation of the WNT/β-catenin signaling pathway. When expressed in HL-1 cardiomyocytes, D243Gfs*4 significantly impaired the spontaneous Ca2+ oscillations recorded in these cells as result of propagation of the depolarizing waves through the gap junctions between non-transfected cells surrounding a cell harboring the mutation. Furthermore, mCh-D243Gfs*4 HL-1 cardiomyocytes showed reduced CX43-dependent Lucifer Yellow (LY) loading and propagation. Of note, activation of β-catenin rescued both LY loading and LMNA D243Gfs*4 -HL-1 cells spontaneous activity propagation. Conclusion: Overall, the present results clearly indicate the involvement of the aberrant CX43 expression/activity as a pathogenic mechanism for the conduction defects associated to this LMNA truncating alteration

Functional study of a KCNH2 mutant: Novel insights on the pathogenesis of the LQT2 syndrome

The K+ voltage-gated channel subfamily H member 2 (KCNH2) transports the rapid component of the cardiac delayed rectifying K+ current. The aim of this study was to characterize the biophysical properties of a C-terminus-truncated KCNH2 channel, G1006fs/49 causing long QT syndrome type II in heterozygous members of an Italian family. Mutant carriers underwent clinical workup, including 12-lead electrocardiogram, transthoracic echocardiography and 24-hour ECG recording. Electrophysiological experiments compared the biophysical properties of G1006fs/49 with those of KCNH2 both expressed either as homotetramers or as heterotetramers in HEK293 cells. Major findings of this work are as follows: (a) G1006fs/49 is functional at the plasma membrane even when co-expressed with KCNH2, (b) G1006fs/49 exerts a dominant-negative effect on KCNH2 conferring specific biophysical properties to the heterotetrameric channel such as a significant delay in the voltage-sensitive transition to the open state, faster kinetics of both inactivation and recovery from the inactivation and (c) the activation kinetics of the G1006fs/49 heterotetrameric channels is partially restored by a specific KCNH2 activator. The functional characterization of G1006fs/49 homo/heterotetramers provided crucial findings about the pathogenesis of LQTS type II in the mutant carriers, thus providing a new and potential pharmacological strategy

TRPML1-Induced Lysosomal Ca²⁺ Signals Activate AQP2 Translocation and Water Flux in Renal Collecting Duct Cells

Lysosomes are acidic Ca2+ storage organelles that actively generate local Ca2+ signaling events to regulate a plethora of cell functions. Here, we characterized lysosomal Ca2+ signals in mouse renal collecting duct (CD) cells and we assessed their putative role in aquaporin 2 (AQP2)-dependent water reabsorption. Bafilomycin A1 and ML-SA1 triggered similar Ca2+ oscillations, in the absence of extracellular Ca2+, by alkalizing the acidic lysosomal pH or activating the lysosomal cation channel mucolipin 1 (TRPML1), respectively. TRPML1-dependent Ca2+ signals were blocked either pharmacologically or by lysosomes’ osmotic permeabilization, thus indicating these organelles as primary sources of Ca2+ release. Lysosome-induced Ca2+ oscillations were sustained by endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ content, while bafilomycin A1 and ML-SA1 did not directly interfere with ER Ca2+ homeostasis per se. TRPML1 activation strongly increased AQP2 apical expression and depolymerized the actin cytoskeleton, thereby boosting water flux in response to an hypoosmotic stimulus. These effects were strictly dependent on the activation of the Ca2+/calcineurin pathway. Conversely, bafilomycin A1 led to perinuclear accumulation of AQP2 vesicles without affecting water permeability. Overall, lysosomal Ca2+ signaling events can be differently decoded to modulate Ca2+-dependent cellular functions related to the dock/fusion of AQP2-transporting vesicles in principal cells of the CD

DP71 and SERCA2 alteration in human neurons of a Duchenne muscular dystrophy patient

Cognitive deficit has been identified in one third of patients affected by Duchenne Muscular Dystrophy, primarily attributed to loss of the short Dp71 dystrophin, the major brain dystrophin isoform. In this study, we investigated for the first time the Dp71 and Dp71-associated proteins cellular localization and expression in human neurons obtained by differentiation from induced pluripotent stem cell line of a patient affected by cognitive impairment. We found structural and molecular alterations in both pluripotent stem cell and derived neurons, reduced Dp71 expression, and a Ca 2+ cytoplasmic overload in neurons coupled with increased expression of the SERCA2 pump in the dystrophic neurons. These results suggest that the reduction of Dp71 protein in the Duchenne muscular dystrophy neurons leads to alterations in SERCA2 and to elevated cytosolic Ca 2+ concentration with consequent potential disruption of the dystrophin proteins and Dp71-associated proteins

Cambiamenti climatici, infrastrutture e mobilità: Soluzioni e strategie per gli investimenti infrastrutturali in un contesto di adattamento ai cambiamenti climatici e di mitigazione delle emissioni di gas-serra - Rapporto della “Commissione cambiamenti climatici, infrastrutture e mobilità sostenibili”

Prefazione del Ministro Il cambiamento climatico è una delle sfide vitali per il futuro della società umana e del nostro pianeta. Per contrastarlo, è necessario un forte coordinamento delle politiche sia a livello nazionale sia internazionale, e un cambiamento negli stili di vita di ampie fasce della popolazione, specialmente di quella che vive nei paesi sviluppati, come dimostrato dalle conclusioni contenute nell’ultimo Rapporto dell’Intergovernmen-tal Panel on Climate Change (IPCC). La transizione ecologica è una priorità strategica dell’Unione europea che, con il Green Deal, il Next Generation EU e la recente proposta relativa al pacchetto di riforme “Fit for 55”, vuole diventare la prima grande area geopolitica del mondo a impatto climatico zero al 2050. L’Italia è in prima linea nella lotta al cambiamento climatico e sta mettendo in campo sforzi notevoli per accelerare la transizione energetica ed ecologica. Sin dall’inizio, il Governo Draghi ha rafforzato il posizionamento del nostro Paese rispetto gli impegni sottoscritti a livello globale ed europeo (Accordi di Parigi, Green Deal europeo e Agenda 2030 delle Nazioni Unite). La volontà del nostro Paese di giocare un ruolo da protagonista è emersa anche nel corso del G20 a presidenza italiana, che ha posto al centro dei negoziati temi quali l’economia circolare e la transizione energetica. Le infrastrutture e i sistemi di mobilità rivestono un ruolo cruciale nella trasformazione del sistema socio-economico all’insegna della sostenibilità, in quanto rappresentano un elemento decisivo dello sviluppo di un paese e sono direttamente connessi alle scelte quotidiane delle persone, delle imprese e delle pubbliche amministrazioni. Data la necessità di adottare un approccio integrato alla transizione ecologica, che non lasci indietro nessuno e assicuri coerenza di politiche e obiettivi, il Ministero delle Infrastrutture e della Mobilità Sostenibili (Mims) ha intrapreso un percorso di profondo cambiamento in linea con la sua nuova denominazione, che ho voluto proprio per sottolineare che la sostenibilità deve riguardare entrambi gli ambiti di competenza del Mims. Tale percorso consente di adeguare l’azione del governo nazionale ai principi concordati dai leader del G20 sotto la presidenza del Giappone, che definiscono “sostenibili” quelle infrastrutture in grado di massimizzare il loro impatto positivo da tutti i punti di vista (non solo quello economico), porre attenzione all’intero ciclo di vita dell’opera, internalizzare nel processo di selezione e progettazione i temi legati agli impatti ambientali, essere resilienti ai disastri naturali e ad altre tipologie di rischio, essere decise in base a una valutazione degli impatti sociali delle opere, essere selezionate e realizzate in base a processi di governance di qualità. Va infatti in questa direzione la definizione dei nuovi strumenti di progettazione e valutazione adottati dal Ministero, come le linee guida settoriali di valutazione degli investimenti in opere pubbliche, le linee guida per la redazione del Progetto di Fattibilità Tecnico-Economica (PFTE) emanate dal Consiglio Superiore dei Lavori Pubblici (CSLLPP) con l’introduzione della Relazione di Sostenibilità delle opere, e le linee guida sullo svolgimento del Dibattito Pubblico, richiesto per molte più iniziative rispetto al passato grazie alla riduzione delle soglie di valore delle opere oltre le quali il Dibattito Pubblico è obbligatorio. Su questa scia, gli investimenti per infrastrutture e mobilità previsti dalla Legge di Bilancio 2022-2024 hanno l’obiettivo di potenziare e modernizzare le infrastrutture e i sistemi di mobilità nazionali nell’ottica dello sviluppo sostenibile, proseguendo fino al 2030 lo sforzo di rilancio del Paese avviato con il Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR). Tali investimenti rientrano in una strategia di ampio respiro adottata dal Ministero, descritta nell’Allegato Infrastrutture al Documento di Economia e Finanza (DEF), “Dieci anni per trasformare l’Italia ”, presentato a luglio 2021, e ribadita con la Direttiva “ Indirizzi generali per l'attività amministrativa e la gestione per l’anno 2022 ”, in cui lo sviluppo di infrastrutture sostenibili e resilienti che tengano conto dei cambiamenti climatici rappresenta una delle quattro priorità politiche dell’azione del Mims. Nella prospettiva descritta, è evidente l’importanza del lavoro svolto dalla Commissione “Cambiamenti climatici, infrastrutture e mobilità sostenibili”, istituita ad aprile 2021. In questo Rapporto viene presentata un’analisi approfondita della dotazione infrastrutturale del nostro Paese e degli effetti su di essa e sulla domanda dei servizi di trasporto previsti nei prossimi anni dovuti ai cambiamenti climatici, all’accelerazione dell’utilizzo di tecnologie digitali, al reshoring della produzione e la regionalizzazione delle catene del valore globali, all’aumento delle disuguaglianze, all’invecchiamento della popolazione e alla crescente urbanizzazione. Il Rapporto avanza soluzioni e proposte che permetteranno, da un lato, di aumentare la sostenibilità e la resilienza del sistema infrastrutturale e della mobilità in un contesto di adattamento ai cambiamenti climatici e di mitigazione delle emissioni climalteranti, e dall’altro, di indirizzare il Paese verso uno sviluppo più sostenibile, inclusivo e competitivo, considerando anche le dinamiche innescate o accelerate dalla pandemia. La transizione ecologica rappresenta, infatti, una straordinaria opportunità per rilanciare la nostra economia, ma anche per stimolare una riflessione collettiva sulla visione dell’Italia che vogliamo costruire nei prossimi anni. Da questo punto di vista, il Rapporto rappresenta un unicum a livello nazionale. Come ben illustrato nel Rapporto, il cambiamento climatico non avrà solo effetti sull’ambiente, sulla bio-diversità e sul territorio, ma anche sulla vita e il benessere delle persone e delle attività produttive, determinando gravi conseguenze fisiche, economiche e sociali per il nostro Paese che vanta un patrimonio paesaggistico, artistico e culturale unico a livello mondiale, ma allo stesso tempo estremamente fragile, e presenta una conformazione territoriale particolarmente esposta ai rischi del cambiamento climatico e vulnerabile agli effetti di eventuali disastri naturali. Per adattare infrastrutture e sistemi di mobilità a questi cambiamenti, e far sì che anche questi contribuiscano al raggiungimento degli obiettivi di mitigazione delle emissioni climalteranti, è fondamentale compiere scelte radicali e urgenti, ma allo stesso tempo informate, ponderate e basate su analisi statistiche ed evidenze scientifiche. Le evidenze contenute in questo Rapporto rappresenteranno anche le basi per le attività del Centro per l’innovazione e la sostenibilità di infrastrutture e i sistemi di mobilità (Cismi) da me istituito all’interno del Mims per svolgere attività di studio, di ricerca e di sviluppo nel settore della sostenibilità delle infrastrutture e della mobilità, dell’innovazione tecnologica, organizzativa e dei materiali, nonché delle due strutture “trasversali” che si occuperanno della decarbonizzazione nel settore dei trasporti (Struttura per la transizione energetica della mobilità e delle infrastrutture, STEMI) e delle politiche urbane (Struttura di coordinamento per le politiche urbane, SCPU), in maniera complementare con le attività di indirizzo del Ministero all’interno del Comitato interministeriale per la Transizione Ecologica (CITE) e del Comitato interministeriale per le politiche urbane (CIPU). Inoltre, questo Rapporto ha evidenti connessioni con quello elaborato dalla Commissione “Finanza per le infrastrutture e la mobilità sostenibili” da me istituita, finalizzato a comprendere in che modo creare una partnership tra settore pubblico e settore privato per investire in soluzioni innovative capaci di trasformare l’Italia nel prossimo decennio.In conclusione, desidero ringraziare sentitamente il Prof. Carlo Carraro per aver coordinato i lavori di questa Commissione e i singoli esperti che, mettendo a disposizione le loro competenze e conoscenze, hanno contributo alla redazione di questo prezioso documento che rappresenta un pilastro fondamentale per guidare le scelte che il nostro Paese deve compiere per affrontare con successo le sfide derivanti dai cambiamenti climatici. Prof. Enrico Giovannini Ministro delle Infrastrutture e della Mobilità Sostenibil

Cambiamenti climatici, infrastrutture e mobilità. Soluzioni e strategie per investimenti sostenibili

L'impatto dei cambiamenti climatici sulle infrastrutture è ormai evidente anche in Italia. Per comprendere e affrontare il fenomeno e i suoi effetti è necessario individuare le soluzioni tecnologiche, fiscali, finanziarie ed economiche in grado di minimizzarne le conseguenze. Questo volume, che unisce un metodo scientificamente rigoroso alla volontà di avanzare proposte politicamente utili, mette insieme il lavoro di 53 esperti che per un anno hanno collaborato per comprendere il futuro non solo climatico, ma anche tecnologico e socio-economico del Paese, in quella che a oggi è la più estesa analisi degli impatti dei cambiamenti climatici in Italia e, soprattutto, delle soluzioni per farvi fronte. Si parla quindi di tecnologia - dal digitale all'elettrico, dalle smart cities all'idrogeno -, di fiscalità e mercati dei permessi di inquinamento, di investimenti e finanza, di resilienza e infrastrutture idriche, con un approccio interdisciplinare che permette di offrire, nella parte finale, concrete soluzioni di policy e di governance.This volume analyses impacts of climate change on transports and infrastrcutures and, simmetrically, how transports and infrastructures may impact climate change. Strategies for adaptation and mitigation in the transport sector are also identified

Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition)

In 2008, we published the first set of guidelines for standardizing research in autophagy. Since then, this topic has received increasing attention, and many scientists have entered the field. Our knowledge base and relevant new technologies have also been expanding. Thus, it is important to formulate on a regular basis updated guidelines for monitoring autophagy in different organisms. Despite numerous reviews, there continues to be confusion regarding acceptable methods to evaluate autophagy, especially in multicellular eukaryotes. Here, we present a set of guidelines for investigators to select and interpret methods to examine autophagy and related processes, and for reviewers to provide realistic and reasonable critiques of reports that are focused on these processes. These guidelines are not meant to be a dogmatic set of rules, because the appropriateness of any assay largely depends on the question being asked and the system being used. Moreover, no individual assay is perfect for every situation, calling for the use of multiple techniques to properly monitor autophagy in each experimental setting. Finally, several core components of the autophagy machinery have been implicated in distinct autophagic processes (canonical and noncanonical autophagy), implying that genetic approaches to block autophagy should rely on targeting two or more autophagy-related genes that ideally participate in distinct steps of the pathway. Along similar lines, because multiple proteins involved in autophagy also regulate other cellular pathways including apoptosis, not all of them can be used as a specific marker for bona fide autophagic responses. Here, we critically discuss current methods of assessing autophagy and the information they can, or cannot, provide. Our ultimate goal is to encourage intellectual and technical innovation in the field