Sódio, frutose, ou sódio e frutose? : efeitos sobre a pressão arterial, diurese e reatividade vascular em ratos

Orientador : Prof. Dr. José Eduardo da Silva SantosTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa: Curitiba, 23/03/2016Inclui referências : f. 111-138Área de concentraçãoResumo: A hipertensão arterial sistêmica (HAS) permanece como um dos maiores riscos para morbidade e mortalidade cardiovascular e seu controle ainda é um desafio para a área da saúde. A inclusão de alimentos industrializados à dieta resultou em aumento significativo no consumo de sal e mais recentemente de açúcares, entre eles a frutose. Dada a importância da dieta na função cardiovascular, este trabalho buscou investigar a influência do acréscimo de NaCl 4%, frutose 6% e a associação e NaCl 4% com frutose 6% à dieta de ratos Wistar, a qual foi implementada a partir do desmame por um período de 6 semanas. Em nosso modelo experimental as diferentes dietas não modificaram parâmetros metabólicos importantes como o peso e o índice glicêmico. Mas, a pressão arterial média (PAM), mensurada em ratos anestesiados no final do tratamento foi maior em ratos expostos à dieta NaCl 4%/Frutose 6%. Além disso, a pressão arterial sistólica (PAS), avaliada semanalmente a partir da quarta semana em ratos sem o efeito de anestésicos, revelou-se elevada nos grupos tratados com NaCl 4%/Frutose 6% e Frutose 6%, assim como a frequência cardíaca. A combinação NaCl 4%/Frutose 6% também elevou a pressão de perfusão vascular renal basal, e o consumo das diferentes dietas levou a uma hiper-reatividade do leito vascular renal à fenilefrina. A pressão de perfusão do leito vascular mesentérico (LVM) ao final do tratamento manteve-se inalterada em todos os grupos. Porém o tratamento com dieta NaCl 4%/Frutose 6% e Frutose 6% tornou o leito hipo-reativo à fenilefrina. Frente a esses resultados, passamos a investigar a reatividade vascular da artéria aorta no grupo Frutose 6%. A ação vasodilatadora da acetilcolina foi menos potente no grupo tratado com Frutose 6%, enquanto o efeito vasodilatador do nitroprussiato de sódio mostrou-se aumentado, o que foi evitado com a remoção do endotélio vascular. Em aortas de ratos expostos à dieta Frutose 6% observamos hipo-reatividade aos efeitos constritores induzidos pela adição da fenilefrina, angiotensina I e angiotensina II, efeito este que foi revertido pela remoção do endotélio vascular, bem como pela presença do inibidor não seletivo da óxido nítrico sintase o L-NAME e do inibidor da guanilato ciclase solúvel (ODQ), assim como pelo sequestrador de óxido nítrico o carboxi-PTIO. A hipo-reatividade à fenilefrina também ocorreu em anéis de aorta (com endotélio funcional) do grupo Frutose 6% mantidos em meio livre de cálcio. Por sua vez, o inibidor da Rho-kinase Y-27632 reduziu a contração máxima induzida pela fenilefrina em anéis de aorta de ratos expostos à dieta padrão, mas não modificou a hipo-reatividade em artéria aorta de ratos tratados com Frutose 6%, e teve sua curva de relaxamento deslocada para a esquerda em anéis de aorta desse mesmo grupo. A expressão ou atividade da SERCA2 ou da RhoA não foi diferente entre os grupos controle e Frutose 6%. Por outro lado a dieta Frutose 6% reduziu a expressão da ROCK I. A utilização do inibidor não seletivo de canais de potássio (TEA) e do inibidor de canais de potássio ativados por voltagem (4-AP) restaurou a ii contração induzida pela fenilefrina no grupo exposto à Frutose 6%. A hipo-reatividade dependente de endotélio à fenilefrina foi restaurada na presença do tempol sequestrador de ânion superóxido e da apocinina inibidor da atividade da NADPH oxidase. A dieta Frutose 6% também comprometeu a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e da glutationa (GSH), e elevou os níveis da hidroperoxidação lipídica. Nossos resultados mostraram que a associação de quantidades moderadas de Frutose 6% e a associação de NaCl 4%/Frutose 6% à dieta foram capazes de elevar a pressão arterial de ratos. Além disso, a dieta Frutose 6% comprometeu a biologia vascular que parece ser em decorrência de maior produção de NO pelo endotélio vascular resultando em produção de espécies reativas de nitrogênio (ERNs).Abstract: Hypertension remains one of the biggest risk factors for cardiovascular morbidity and mortality and its control remains a challenger for the health control. Consumption of processed food resulted in a significant increase in the consumption of salt and more recently increased consumption of sugars, including fructose. Given the importance of diet in cardiovascular function this study investigated the influence of the addition of moderate amounts of sodium and fructose. For this, Wistar male rats (21 days old) received chow containing NaCl 4%, Fructose 6% and the association of NaCl 4%/Fructose 6% and standard chow for 6 weeks. In our experimental model the different diets did not alter important metabolic parameters such as the weight gain and glycemic index. But, mean arterial pressure (MAP) measured in anesthetized rats, at the end of treatment was greater in rats exposed to diet containing NaCl 4%/Fructose 6% and systolic blood pressure (SBP) assessed weekly from the fourth week in rats without the influence of anesthetics, was elevated in both, rats exposed to NaCl 4%/Fructose 6% and Fructose 6% diet, as well as heart rate. The association of NaCl 4% and Fructose 6% in diet also increases the baseline of vascular renal perfusion pressure, and the consumption of the different diets lead to hyperactivity of vascular renal to phenylephrine. The perfusion pressure in the mesenteric vascular bed (MVB) remained unchanged in all groups at the end of treatment. However, when the MVB was exposed to phenylephrine in increasing concentration we noted that consumption of NaCl 4%/Fructose 6% and Fructose 6% diets induced hypo-contractility of mesenteric vascular bed. When considering these results we now investigated the vascular reactivity in aorta from Fructose 6% diet group. The relaxation induced by acetylcholine was less potent in the group treated with Fructose 6%, the opposite was observed with the addition of sodium nitroprusside, where the vasorelaxant response was more potent in the Fructose 6% feed rats. Interestingly when vascular endothelium was gently removed the vasorelaxant response was similar in both groups. In aortic rings obtained from rats exposed to Fructose 6% diet, we observed hypo-reactivity for cumulative addition of phenylephrine, angiotensin I and angiotensin II, in aortic rings with functional vascular endothelium and this was reversed by removing the vascular endothelium as well as by the inhibitor of nitric oxide synthase (L-NAME), soluble guanylate cyclase inhibitor (ODQ) and nitric oxide scavenger (carboxi-PTIO). We also noticed that the hypo contractility to phenylephrine remained even in free calcium preparations, but still remained dependent on the presence of functional endothelium. Preincubation of Y-27632 reduced the maximal contraction elicited by phenylephrine in control rings, but did not change the hypo-reactivity in aorta of rats treated with Fructose 6%. The relaxation induced by Y-27632 was more potent in aorta obtained from Fructose 6% diet group. The expression of SERCA2 and RhoA were similar in both groups. Moreover, Fructose 6% diet reduced the expression of ROCK I. The hypo-responsiveness to phenylephrine was restored in the presence of iv a nonspecific inhibitor of potassium channel (TEA) and the selective voltage dependent potassium channel blocker (4-AP). The hypo-responsiveness endothelium dependent was reversed by tempol (superoxide scavenger) and apocynin (NADPH oxidase inhibitor). The fructose diet also compromises the activity of antioxidant enzymes, like superoxide dismutase (SOD), and glutathione (GSH) and raises the levels of lipid hydroperoxidation in aorta from Fructose 6% diet group. Our results indicated that the amount of dietary fructose necessary to raise blood pressure in normotensive and healthy rats is substantially below the commonly used 60% fructose adopted in previous studies. Furthermore, Fructose 6% diet compromised vascular biology which seems to be due to higher production of nitric oxide and increased production of reactive nitrogen species

Efeito vasorrelaxante e hipotensivo de extratos e frações obtidos da planta Scutia buxifolia : participação do óxido nítrico e de canais de potássio

Orientador: Prof. Dr. José Eduardo da Silva-SantosCo-orientadora: Profª. Drª. Cândida L. KassuyaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa: Curitiba, 15/07/2011Inclui referênciasResumo: A especie Scutia buxifolia e uma arvore que pertence a familia Rhamnaceae. E nativa da America do Sul, sendo encontrada principalmente no estado do Rio Grande do Sul, Uruguai e Argentina. E conhecida como gcoronilha h. A casca da S. buxifolia e utilizada popularmente na forma de infusao como antihipertensiva e diuretica. Apesar do uso popular nao encontramos na literatura cientifica estudos que possam validar ou nao a utilizacao desta planta para tais fins. Em nosso trabalho fizemos estudos in vitro e in vivo para avaliarmos a possivel atividade biologica do extrato bruto hidroalcoolico da casca e das folhas e de suas respectivas fracoes, diclorometano (DCM), acetato de etila (AcOEt) e butanolica (BuOH) da S. buxifolia. Foram utilizados ratos Wistar e SHR machos (280-320g). Nos estudos in vitro, o extrato bruto hidroalcoolico da casca e das folhas promoveram um relaxamento maximo de 59,49 } 12,33% e de 79,70 } 10%, respectivamente, em aneis de aorta com endotelio, previamente contraidas por fenilefrina (1 ƒÊM), que nao foi reduzido a em preparacoes de aorta sem endotelio funcional. Todas as fracoes testadas promoveram relaxamento em aneis de aorta com e sem endotelio. Entretanto, as fracoes AcOEt e BuOH (50 ƒÊg/ml) das cascas da S. buxifolia promoveram um relaxamento maximo de 73,84 } 4,95% e 94,21 } 7,30%, respectivamente. A remocao do endotelio reduziu significativamente (em 50%) esse efeito. O mecanismo de acao envolvido no relaxamento vascular foi investigado com a utilizacao da fracao BuOH da casca da S. buxifolia, fracao que apresentou maior atividade e demonstrou maior dependencia do endotelio para causar vasodilatacao. A incubacao de L-NAME (100 ƒÊM) ou de ODQ (10 ƒÊM), inibidores da enzima oxido nitrico sintase e guanilato ciclase soluvel, respectivamente, aboliu o relaxamento dependente de endotelio causado pela fracao BuOH. Em aneis de aorta com endotelio, o efeito vasorrelaxante causado pela fracao BuOH nao foi reduzido pela incubacao previa de atropina (1 ƒÊM; antagonista de receptor muscarinico da acetilcolina), HOE-140 (1 ƒÊM; antagonista seletivo de receptor B2 da bradicinina), pirilamina (1 ƒÊM; antagonista seletivo para receptor H1 da histamina), tetraetilamonio (TEA, 10 mM; um bloqueador nao seletivo de canais de K+), ou glibenclamida (GLI, 10 ƒÊM; bloqueador seletivo de canais de K+ sensiveis ao ATP). Em aneis de aorta sem endotelio funcional a fracao BuOH (10, 30 e 100 ƒÊg/ml) nao modificou a resposta contratil ao calcio ou a fenilefrina em meio livre de calcio extracelular, bem como nao alterou a mobilizacao intracelular de calcio medida pelo efeito contratil induzido pela fenilefrina em liquido nutritivo desprovido de calcio. Entretanto, o relaxamento maximo promovido pela fracao BuOH em aneis de aorta sem endotelio funcional foi significativamente reduzido pelos bloqueadores de canais de K+ TEA (10 mM), GLI (10 ƒÊM), 4-aminopiridina (1 mM; inibidor seletivo de canal de K+ regulados por voltagem) e iberiotoxina (IbTX, 100 nM; inibidor seletivo de canal de K+ de alta condutancia regulado por Ca2+). A administracao oral da fracao BuOH (10 mg/kg) aumentou o volume de urina excretado e reduziu a pressao arterial media xiv (PAM) de ratos Wistar normotensos. Curiosamente, a fracao BuOH nao reduziu a PAM de animais normotensos quando administrada por intravenosa, mas apresentou efeito hipotensor significativo em ratos espontaneamente hipertensos e em animais normotensos infundidos continuamente com fenilefrina, sendo neste ultimo o qual foi abolido pelo inibidor de guanilato ciclase ODQ. Alem disso, a fracao BuOH nao reduziu a PAM em ratos infundidos com L-NAME. Nossos resultados sugerem que a fracao butanolica da casca do tronco da S. buxifolia possui um ou mais componentes capazes de causar vasodilatacao in vitro e in vivo, ambos pormecanismos que envolvem a ativacao da enzima oxido nitrico sintase e a estimulacao da enzima guanilato ciclase.Abstract: Scutia buxifolia (Rhamnaceae,) is a tree popularly known as "coronilha". It’s barks are popularly used in the form of infusion as antihypertensive and diuretic. Despite the popular use in the scientific literature we found no studies that can validate or not the use of this plant for such purposes. This study discloses that the crude extracts of leaves and bark of Scutia buxifolia are able to cause a concentration-dependent relaxation in phenylephrine-contract rat aortic rings. Among the fractions tested, the n-butanolic (BuOH) fraction of bark of S. buxifolia had the strongest activity, causing full relaxation (95-100%) in rat aortic rings with functional endothelium, and partial relaxation in endothelium-denuded vessels (35-45%). The non-selective nitric oxide synthase inhibitor L-NAME, as well as the soluble guanylate cyclase inhibitor ODQ, but not the cyclooxygenase inhibitor indomethacin, vanished BuOH fraction-induced endothelium-dependent relaxation. However, the membrane receptor antagonists atropine, HOE-140, and pyrilamine had any effect. Incubation of the non-selective K+ channel blocker tetraethylammonium (TEA), or the ATP-sensitive K+ channel blocker glibenclamide did not change the vasorelaxation induced by BuOH fraction in those rings with functional endothelium. On the other hand, in endothelium-denuded preparations, TEA and glibenclamide, as well as the voltage-sensitive K+ channel blocker 4-aminopyridine, and the high conductance Ca2+ -activated K+ channel blocker iberiotoxin were able to reduce the maximum relaxation elicited by BuOH fraction. Taken together, our results suggest that the n-butanolic fraction of bark of S. buxifolia possess one or more substances able to cause vascular relaxation in rat aortic rings, through both endothelium-dependent and -independent mechanism. The endothelial action of this BuOH fraction is fully related to stimulation of nitric oxide production, and subsequent activation of the soluble guanylate cyclase, while the direct action in the vascular smooth muscle (endothelium-independent relaxation) is, at least in part, mediated by potassium channel opening, mainly the highconductance calcium-activated subtype. Oral administration of the BuOH fraction (10 mg/kg) increased the volume of urine excreted and reduced mean arterial pressure of normotensive Wistar rats. Interestingly, the BuOH fraction did not reduce MAP of normotensive rats when administered intravenously, but showed significant hypotensive effect in spontaneously hypertensive and normotensive animals continuously infused with phenylephrine, being the latter which was abolished by the xvi guanylate cyclase inhibitor ODQ. In addition, the BuOH fraction did not reduce MAP in rats infused with L-NAME. Our results suggest that the butanolic fraction of the bark of S. buxifolia has one or more components capable of causing vasodilatation in vitro and in vivo, both through mechanisms that involve the activation of the enzyme nitric oxide synthase and stimulation of the enzyme guanylate cyclase

Sódio, frutose, ou sódio e frutose? : efeitos sobre a pressão arterial, diurese e reatividade vascular em ratos

Orientador : Prof. Dr. José Eduardo da Silva SantosTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa: Curitiba, 23/03/2016Inclui referências : f. 111-138Área de concentraçãoResumo: A hipertensão arterial sistêmica (HAS) permanece como um dos maiores riscos para morbidade e mortalidade cardiovascular e seu controle ainda é um desafio para a área da saúde. A inclusão de alimentos industrializados à dieta resultou em aumento significativo no consumo de sal e mais recentemente de açúcares, entre eles a frutose. Dada a importância da dieta na função cardiovascular, este trabalho buscou investigar a influência do acréscimo de NaCl 4%, frutose 6% e a associação e NaCl 4% com frutose 6% à dieta de ratos Wistar, a qual foi implementada a partir do desmame por um período de 6 semanas. Em nosso modelo experimental as diferentes dietas não modificaram parâmetros metabólicos importantes como o peso e o índice glicêmico. Mas, a pressão arterial média (PAM), mensurada em ratos anestesiados no final do tratamento foi maior em ratos expostos à dieta NaCl 4%/Frutose 6%. Além disso, a pressão arterial sistólica (PAS), avaliada semanalmente a partir da quarta semana em ratos sem o efeito de anestésicos, revelou-se elevada nos grupos tratados com NaCl 4%/Frutose 6% e Frutose 6%, assim como a frequência cardíaca. A combinação NaCl 4%/Frutose 6% também elevou a pressão de perfusão vascular renal basal, e o consumo das diferentes dietas levou a uma hiper-reatividade do leito vascular renal à fenilefrina. A pressão de perfusão do leito vascular mesentérico (LVM) ao final do tratamento manteve-se inalterada em todos os grupos. Porém o tratamento com dieta NaCl 4%/Frutose 6% e Frutose 6% tornou o leito hipo-reativo à fenilefrina. Frente a esses resultados, passamos a investigar a reatividade vascular da artéria aorta no grupo Frutose 6%. A ação vasodilatadora da acetilcolina foi menos potente no grupo tratado com Frutose 6%, enquanto o efeito vasodilatador do nitroprussiato de sódio mostrou-se aumentado, o que foi evitado com a remoção do endotélio vascular. Em aortas de ratos expostos à dieta Frutose 6% observamos hipo-reatividade aos efeitos constritores induzidos pela adição da fenilefrina, angiotensina I e angiotensina II, efeito este que foi revertido pela remoção do endotélio vascular, bem como pela presença do inibidor não seletivo da óxido nítrico sintase o L-NAME e do inibidor da guanilato ciclase solúvel (ODQ), assim como pelo sequestrador de óxido nítrico o carboxi-PTIO. A hipo-reatividade à fenilefrina também ocorreu em anéis de aorta (com endotélio funcional) do grupo Frutose 6% mantidos em meio livre de cálcio. Por sua vez, o inibidor da Rho-kinase Y-27632 reduziu a contração máxima induzida pela fenilefrina em anéis de aorta de ratos expostos à dieta padrão, mas não modificou a hipo-reatividade em artéria aorta de ratos tratados com Frutose 6%, e teve sua curva de relaxamento deslocada para a esquerda em anéis de aorta desse mesmo grupo. A expressão ou atividade da SERCA2 ou da RhoA não foi diferente entre os grupos controle e Frutose 6%. Por outro lado a dieta Frutose 6% reduziu a expressão da ROCK I. A utilização do inibidor não seletivo de canais de potássio (TEA) e do inibidor de canais de potássio ativados por voltagem (4-AP) restaurou a ii contração induzida pela fenilefrina no grupo exposto à Frutose 6%. A hipo-reatividade dependente de endotélio à fenilefrina foi restaurada na presença do tempol sequestrador de ânion superóxido e da apocinina inibidor da atividade da NADPH oxidase. A dieta Frutose 6% também comprometeu a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e da glutationa (GSH), e elevou os níveis da hidroperoxidação lipídica. Nossos resultados mostraram que a associação de quantidades moderadas de Frutose 6% e a associação de NaCl 4%/Frutose 6% à dieta foram capazes de elevar a pressão arterial de ratos. Além disso, a dieta Frutose 6% comprometeu a biologia vascular que parece ser em decorrência de maior produção de NO pelo endotélio vascular resultando em produção de espécies reativas de nitrogênio (ERNs).Abstract: Hypertension remains one of the biggest risk factors for cardiovascular morbidity and mortality and its control remains a challenger for the health control. Consumption of processed food resulted in a significant increase in the consumption of salt and more recently increased consumption of sugars, including fructose. Given the importance of diet in cardiovascular function this study investigated the influence of the addition of moderate amounts of sodium and fructose. For this, Wistar male rats (21 days old) received chow containing NaCl 4%, Fructose 6% and the association of NaCl 4%/Fructose 6% and standard chow for 6 weeks. In our experimental model the different diets did not alter important metabolic parameters such as the weight gain and glycemic index. But, mean arterial pressure (MAP) measured in anesthetized rats, at the end of treatment was greater in rats exposed to diet containing NaCl 4%/Fructose 6% and systolic blood pressure (SBP) assessed weekly from the fourth week in rats without the influence of anesthetics, was elevated in both, rats exposed to NaCl 4%/Fructose 6% and Fructose 6% diet, as well as heart rate. The association of NaCl 4% and Fructose 6% in diet also increases the baseline of vascular renal perfusion pressure, and the consumption of the different diets lead to hyperactivity of vascular renal to phenylephrine. The perfusion pressure in the mesenteric vascular bed (MVB) remained unchanged in all groups at the end of treatment. However, when the MVB was exposed to phenylephrine in increasing concentration we noted that consumption of NaCl 4%/Fructose 6% and Fructose 6% diets induced hypo-contractility of mesenteric vascular bed. When considering these results we now investigated the vascular reactivity in aorta from Fructose 6% diet group. The relaxation induced by acetylcholine was less potent in the group treated with Fructose 6%, the opposite was observed with the addition of sodium nitroprusside, where the vasorelaxant response was more potent in the Fructose 6% feed rats. Interestingly when vascular endothelium was gently removed the vasorelaxant response was similar in both groups. In aortic rings obtained from rats exposed to Fructose 6% diet, we observed hypo-reactivity for cumulative addition of phenylephrine, angiotensin I and angiotensin II, in aortic rings with functional vascular endothelium and this was reversed by removing the vascular endothelium as well as by the inhibitor of nitric oxide synthase (L-NAME), soluble guanylate cyclase inhibitor (ODQ) and nitric oxide scavenger (carboxi-PTIO). We also noticed that the hypo contractility to phenylephrine remained even in free calcium preparations, but still remained dependent on the presence of functional endothelium. Preincubation of Y-27632 reduced the maximal contraction elicited by phenylephrine in control rings, but did not change the hypo-reactivity in aorta of rats treated with Fructose 6%. The relaxation induced by Y-27632 was more potent in aorta obtained from Fructose 6% diet group. The expression of SERCA2 and RhoA were similar in both groups. Moreover, Fructose 6% diet reduced the expression of ROCK I. The hypo-responsiveness to phenylephrine was restored in the presence of iv a nonspecific inhibitor of potassium channel (TEA) and the selective voltage dependent potassium channel blocker (4-AP). The hypo-responsiveness endothelium dependent was reversed by tempol (superoxide scavenger) and apocynin (NADPH oxidase inhibitor). The fructose diet also compromises the activity of antioxidant enzymes, like superoxide dismutase (SOD), and glutathione (GSH) and raises the levels of lipid hydroperoxidation in aorta from Fructose 6% diet group. Our results indicated that the amount of dietary fructose necessary to raise blood pressure in normotensive and healthy rats is substantially below the commonly used 60% fructose adopted in previous studies. Furthermore, Fructose 6% diet compromised vascular biology which seems to be due to higher production of nitric oxide and increased production of reactive nitrogen species