Direct Visualization of the Action of Triton X-100 on Giant Vesicles of Erythrocyte Membrane Lipids

The raft hypothesis proposes that microdomains enriched in sphingolipids, cholesterol, and specific proteins are transiently formed to accomplish important cellular tasks. Equivocally, detergent-resistant membranes were initially assumed to be identical to membrane rafts, because of similarities between their compositions. in fact, the impact of detergents in membrane organization is still controversial. Here, we use phase contrast and fluorescence microscopy to observe giant unilamellar vesicles (GUVs) made of erythrocyte membrane lipids (erythro-GUVs) when exposed to the detergent Triton X-100 (TX-100). We clearly show that TX-100 has a restructuring action on biomembranes. Contact with TX-100 readily induces domain formation on the previously homogeneous membrane of erythro-GUVs at physiological and room temperatures. the shape and dynamics of the formed domains point to liquid-ordered/liquid-disordered (Lo/Ld) phase separation, typically found in raft-like ternary lipid mixtures. the Ld domains are then separated from the original vesicle and completely solubilized by TX-100. the insoluble vesicle left, in the Lo phase, represents around 2/3 of the original vesicle surface at room temperature and decreases to almost 1/2 at physiological temperature. This chain of events could be entirely reproduced with biomimetic GUVs of a simple ternary lipid mixture, 2:1:2 POPC/SM/chol (phosphatidylcholine/sphyngonnyelin/cholesterol), showing that this behavior will arise because of fundamental physicochemical properties of simple lipid mixtures. This work provides direct visualization of TX-100-induced domain formation followed by selective (Ld phase) solubilization in a model system with a complex biological lipid composition.Brazilian Research foundationsFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)TNCT-FaxCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Univ Estadual Campinas, Inst Biol, Dept Bioquim, Campinas, SP, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Biofis, São Paulo, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Biofis, São Paulo, BrazilFAPESP: 2009/0904-1FAPESP: 2012/10442-8FAPESP: 2010/18516-5CNPq: 479993/2011-4CNPq: 472054/2011-2Web of Scienc

Structural properties of charged lipid dispersions of dimyristoyl phosphatidylglycerol: variations with temperature and ionic strength of the medium.

A dependência com a temperatura da intensidade de luz espalhada por dispersões aquosas do lipídio aniônico DMPG (dimiristoil fosfatidilglicerol) foi estudada para diferentes forças iônicas. A transição principal, gel - líquido cristal, pode ser bem monitorada por um decréscimo abrupto na turbidez. Como esperado, a temperatura da transição de fase principal (Tm) aumenta com o aumento da força iônica. Para baixa força iônica, uma segunda transição com a temperatura para o DMPG, chamada de pós-transição, pode ser monitorada tanto por um aumento no espalhamento de luz quanto por um decréscimo na condutividade. Análises de Zimm plot indicam que abaixo de Tm os lipossomos tendem a se agregar, resultando em um segundo coeficiente de virial, A2, negativo, e em uma grande massa molecular da partícula. Na transição de fase, juntamente com uma diminuição na turbidez, ocorre um aumento na condutividade da amostra, A2 torna-se positivo e a massa molecular da partícula diminui, indicando um estado não agregado. Além disso, na pós-transição (Tp) A2 torna-se muito pequeno, e a massa molecular aumenta novamente. Ambas as transições são reversíveis. Opostamente à transição principal, a pós-transição não pôde ser detectada por marcadores de spin situados tanto na superfície da membrana quanto em seu interior. Considerando um aumento na área por cabeça polar do lipídio após a transição principal, e o modelo de Stern-Gouy-Chapman, foi possível mostrar que a transição causa um aumento no grau de dissociação da vesícula, aumentando portanto a concentração de íons em solução. Entretanto, dentro da estrutura desse modelo simples, foi necessário considerar diferentes constante de associação Na+-DMPG nas fases gel e líquido cristal, para explicar um aumento na repulsão entre as vesículas com a transição principal. Os mecanismos que governam a pós-transição são ainda menos claros.The temperature dependence of the intensity of light scattered by aqueous dispersions of the anionic lipid DMPG (dimyristoyl phosphatidylglycerol) was studied at different ionic strengths. The lipid main transition, gel-liquid crystal, can be well monitored by a sharp decrease in turbidity. As expected, the temperature of the main transition (Tm) was found to increase with the increase of the ionic strength. For low ionic strength, a DMPG second temperature transition, named post-transition, can be monitored by both an increase in light scattering and a decrease in conductivity. Zimm plot analysis indicates that bellow Tm the liposomes tend to aggregate, yielding a negative second virial coefficient A2, and particles of large molecular weight. At the phase transition, parallel to the decrease in turbidity, there is an increase in the sample conductivity, A2 becomes positive and the particle molecular weight decreases, indicating a non-aggregated state. Moreover, at the post-transition (Tp) A2 becomes very small, and the molecular weight increases again. Both the main and post transitions were found to be reversible. Opposite to the main transition, the post-transition could not be detected by spin labels placed either at the membrane surface, or in the bilayer core. Considering an increase in area per lipid headgroup upon the main transition, and the Stern-Gouy- Chapman model, it was possible to show that the main transition increases the vesicle degree of dissociation, hence increasing the ion concentration in solution. However, within the framework of that simple model, it was necessary to consider different Na+- DMPG association constants, in the gel and liquid phases, to explain an increase in vesicles repulsion upon the main transition. The mechanisms governing the posttransition are even less clear

Peculiar thermal behavior of aqueous dispersions of the anionic phospholipid DMPG

Dispersões aquosas do fosfolipídio aniônico DMPG (dimiristoilfosfatidil glicerol) apresentam um comportamento térmico muito peculiar e interessante, principalmente em baixa força iônica. Neste trabalho, mostramos que o DMPG em baixa força iônica apresenta dois regimes com comportamentos térmicos muito distintos, dependendo da concentração lipídica. Acima de uma certa faixa de concentração c\' (c\' = 0,4 ± 0,2 mM), a transição principal gel - cristal-líquido do DMPG não se dá de uma forma brusca, em um intervalo estreito de temperatura, como em muitos dispersões lipídicas, mas apresenta uma região de transição gel - cristal-líquido delimitada por temperaturas aqui denominadas Tmon e Tmoff. Na condição de força iônica mais estudada (tampão Hepes + 2 mM NaCl), Tmon = 17, 5 °C e Tmoff - 35 ºC. Essa região é chamada, no presente trabalho, de fase intermediária, por estar entre as fases gel e fluida, e por conter propriedades específicas, tais como baixo espalhamento de luz e de raio-X de baixo ângulo, e alta condutividade elétrica e viscosidade. A extensão em temperatura da fase intermediária diminui com o aumento da força iônica e concentração lipídica, até que uma temperatura de transição de fase única, centrada em T\"\" é observada. As diversas técnicas utilizadas neste trabalho (espalhamento de luz, calorimetria diferencial de varredura, ressonância paramagnética eletrônica, anisotropia de fluorescência, espalhamento de raio-X de baixo ângulo e microscopia ótica), sugerem que em T mon ocorre um aumento considerável no potencial eletrostático de superfície, levando a um aumento da repulsão entre cabeças polares adjacentes e possivelmente entre vesículas. Esse processo dispararia o início da fusão das cadeias hidrocarbônicas e só seria completado acima de Tmoff. A fase intermediária é caracterizada por um empacotamento não usual da membrana, que pode ser causado pela presença de regiões de altíssima curvatura com grande mobilidade e, possivelmente, com uma maior densidade superficial de cargas. Por outro lado, o comportamento térmico do DMPG abaixo de c\' é bem distinto. A fase intermediária não está presente e o sistema apresenta uma transição de fase centrada em uma única temperatura, Tm. O valor de Tm cresce de 27,5 °C em 0,1 mM DMPG para 41°C em 5 µM DMPG. Um valor tão alto de Tm no regime concentrado foi obtido somente em pH baixo, quando o DMPG encontra-se em seu estado protonado. Foi observado que o valor de T nv contrário ao esperado em dispersões lipídicas carregadas, diminui consideravelmente com o aumento da concentração de NaCl. Propusemos, então, que abaixo de c\' ocorre uma mudança acentuada na superfície da bica ma da, tendo como conseqüência um enorme aumento da afinidade por prótons dos grupos fosfato do DMPG, levando à neutralização completa da superfície lipídica em tomo de 5 µM. Os resultados obtidos no presente trabalho são muito interessantes do ponto de vista do estudo físico-químico de agregados anfifílicos carregados. Além disso, as propriedades do fosfolipídio aniônico DMPG podem ter alguma relevância biológica em domínios específicos de membranas de procariontes.Aqueous dispersions of the anionic phospholipid DMPG (dimyristoylphosphatidyl glycerol) present a very interesting and peculiar thermal behavior, mainly at low ionic strength. In this work, we show that DMPG at low ionic strength presents two regimes with very different thermal behaviors, depending on the lipid concentration. Above a certain concentration range c\' (c\' = 0,4 ± 0,2 mM), the gel-fIuid main transition of DMPG does not occur in a narrow temperature interval, as shown by many lipid dispersions, but rather presents a gel-fIuid transition region de!imited by temperatures here called Tmon and T moff. At the standard iOIÚC strength condition used (Hepes buffer + 2 mM NaCI), Tmon = 17.5 °C and Tmoff ~35 ºC This region is called intermediate phase in the present work, since it occurs between the gel and fIuid phases, and due to its specific properties, such as low light and small angle X-ray scattering, and high electrical conductivity and viscosity. The temperature extension of the interrnediate phase decreases with the increase in iOIÚC strength and lipid concentration, till a single main phase transition, centered at T DV is observed. The different techniques used in this work (light scattering, differential scanrung calorimetry, electron spin resonance, fluorescence anisotropy, small angle X-ray scattering and optical microscopy), suggest that a considerable increase in the electrostatic surface potential occurs at Tmon, leading to an increase in the repulsion between adjacent headgroups, and possibly between vesicles. This process would trigger the beginrúng of the melting of the hydrocarbon chains, which would finish above TmolE. The intermediate phase is characterized by a non-usual membrane packing, that could be caused by the presence of highly curved regions presenting a loose packing, possibly with higher surface charge density. On the other hand, the thermal behavior of DMPG below é is very different. The intermediate phase is not present and the system displays a main phase transition centered at a unique temperature, Tm The value of Tm increases from 27.5 °C at 0.1 mM DMPG to 41°C at 5 µM DMPC. Such a high T m value was only found in concentrated DMPG dispersion at low pH, when DMPG is in its protonated state. We observed that the T m value, contrary to the expected for charged lipid dispersions, decreases significantly with the increase in NaCI concentration. We propose, then, that below c\' the surface bilayer markedly changes, resulting in a huge increase in the proton affinity to the DMPG phosphate groups, which would lead to a complete neutralization of the lipid surface around 5 µM. The results presented here are very interesting concerning the physical chernistry of charged amphiphilic aggregates. Furthermore, the properties of the anionic phospholipid DMPG might have some biological relevance in specific domains of prokaryotic membranes

Peculiar thermal behavior of aqueous dispersions of the anionic phospholipid DMPG

Dispersões aquosas do fosfolipídio aniônico DMPG (dimiristoilfosfatidil glicerol) apresentam um comportamento térmico muito peculiar e interessante, principalmente em baixa força iônica. Neste trabalho, mostramos que o DMPG em baixa força iônica apresenta dois regimes com comportamentos térmicos muito distintos, dependendo da concentração lipídica. Acima de uma certa faixa de concentração c\' (c\' = 0,4 ± 0,2 mM), a transição principal gel - cristal-líquido do DMPG não se dá de uma forma brusca, em um intervalo estreito de temperatura, como em muitos dispersões lipídicas, mas apresenta uma região de transição gel - cristal-líquido delimitada por temperaturas aqui denominadas Tmon e Tmoff. Na condição de força iônica mais estudada (tampão Hepes + 2 mM NaCl), Tmon = 17, 5 °C e Tmoff - 35 ºC. Essa região é chamada, no presente trabalho, de fase intermediária, por estar entre as fases gel e fluida, e por conter propriedades específicas, tais como baixo espalhamento de luz e de raio-X de baixo ângulo, e alta condutividade elétrica e viscosidade. A extensão em temperatura da fase intermediária diminui com o aumento da força iônica e concentração lipídica, até que uma temperatura de transição de fase única, centrada em T\"\" é observada. As diversas técnicas utilizadas neste trabalho (espalhamento de luz, calorimetria diferencial de varredura, ressonância paramagnética eletrônica, anisotropia de fluorescência, espalhamento de raio-X de baixo ângulo e microscopia ótica), sugerem que em T mon ocorre um aumento considerável no potencial eletrostático de superfície, levando a um aumento da repulsão entre cabeças polares adjacentes e possivelmente entre vesículas. Esse processo dispararia o início da fusão das cadeias hidrocarbônicas e só seria completado acima de Tmoff. A fase intermediária é caracterizada por um empacotamento não usual da membrana, que pode ser causado pela presença de regiões de altíssima curvatura com grande mobilidade e, possivelmente, com uma maior densidade superficial de cargas. Por outro lado, o comportamento térmico do DMPG abaixo de c\' é bem distinto. A fase intermediária não está presente e o sistema apresenta uma transição de fase centrada em uma única temperatura, Tm. O valor de Tm cresce de 27,5 °C em 0,1 mM DMPG para 41°C em 5 µM DMPG. Um valor tão alto de Tm no regime concentrado foi obtido somente em pH baixo, quando o DMPG encontra-se em seu estado protonado. Foi observado que o valor de T nv contrário ao esperado em dispersões lipídicas carregadas, diminui consideravelmente com o aumento da concentração de NaCl. Propusemos, então, que abaixo de c\' ocorre uma mudança acentuada na superfície da bica ma da, tendo como conseqüência um enorme aumento da afinidade por prótons dos grupos fosfato do DMPG, levando à neutralização completa da superfície lipídica em tomo de 5 µM. Os resultados obtidos no presente trabalho são muito interessantes do ponto de vista do estudo físico-químico de agregados anfifílicos carregados. Além disso, as propriedades do fosfolipídio aniônico DMPG podem ter alguma relevância biológica em domínios específicos de membranas de procariontes.Aqueous dispersions of the anionic phospholipid DMPG (dimyristoylphosphatidyl glycerol) present a very interesting and peculiar thermal behavior, mainly at low ionic strength. In this work, we show that DMPG at low ionic strength presents two regimes with very different thermal behaviors, depending on the lipid concentration. Above a certain concentration range c\' (c\' = 0,4 ± 0,2 mM), the gel-fIuid main transition of DMPG does not occur in a narrow temperature interval, as shown by many lipid dispersions, but rather presents a gel-fIuid transition region de!imited by temperatures here called Tmon and T moff. At the standard iOIÚC strength condition used (Hepes buffer + 2 mM NaCI), Tmon = 17.5 °C and Tmoff ~35 ºC This region is called intermediate phase in the present work, since it occurs between the gel and fIuid phases, and due to its specific properties, such as low light and small angle X-ray scattering, and high electrical conductivity and viscosity. The temperature extension of the interrnediate phase decreases with the increase in iOIÚC strength and lipid concentration, till a single main phase transition, centered at T DV is observed. The different techniques used in this work (light scattering, differential scanrung calorimetry, electron spin resonance, fluorescence anisotropy, small angle X-ray scattering and optical microscopy), suggest that a considerable increase in the electrostatic surface potential occurs at Tmon, leading to an increase in the repulsion between adjacent headgroups, and possibly between vesicles. This process would trigger the beginrúng of the melting of the hydrocarbon chains, which would finish above TmolE. The intermediate phase is characterized by a non-usual membrane packing, that could be caused by the presence of highly curved regions presenting a loose packing, possibly with higher surface charge density. On the other hand, the thermal behavior of DMPG below é is very different. The intermediate phase is not present and the system displays a main phase transition centered at a unique temperature, Tm The value of Tm increases from 27.5 °C at 0.1 mM DMPG to 41°C at 5 µM DMPC. Such a high T m value was only found in concentrated DMPG dispersion at low pH, when DMPG is in its protonated state. We observed that the T m value, contrary to the expected for charged lipid dispersions, decreases significantly with the increase in NaCI concentration. We propose, then, that below c\' the surface bilayer markedly changes, resulting in a huge increase in the proton affinity to the DMPG phosphate groups, which would lead to a complete neutralization of the lipid surface around 5 µM. The results presented here are very interesting concerning the physical chernistry of charged amphiphilic aggregates. Furthermore, the properties of the anionic phospholipid DMPG might have some biological relevance in specific domains of prokaryotic membranes

Structural properties of charged lipid dispersions of dimyristoyl phosphatidylglycerol: variations with temperature and ionic strength of the medium.

A dependência com a temperatura da intensidade de luz espalhada por dispersões aquosas do lipídio aniônico DMPG (dimiristoil fosfatidilglicerol) foi estudada para diferentes forças iônicas. A transição principal, gel - líquido cristal, pode ser bem monitorada por um decréscimo abrupto na turbidez. Como esperado, a temperatura da transição de fase principal (Tm) aumenta com o aumento da força iônica. Para baixa força iônica, uma segunda transição com a temperatura para o DMPG, chamada de pós-transição, pode ser monitorada tanto por um aumento no espalhamento de luz quanto por um decréscimo na condutividade. Análises de Zimm plot indicam que abaixo de Tm os lipossomos tendem a se agregar, resultando em um segundo coeficiente de virial, A2, negativo, e em uma grande massa molecular da partícula. Na transição de fase, juntamente com uma diminuição na turbidez, ocorre um aumento na condutividade da amostra, A2 torna-se positivo e a massa molecular da partícula diminui, indicando um estado não agregado. Além disso, na pós-transição (Tp) A2 torna-se muito pequeno, e a massa molecular aumenta novamente. Ambas as transições são reversíveis. Opostamente à transição principal, a pós-transição não pôde ser detectada por marcadores de spin situados tanto na superfície da membrana quanto em seu interior. Considerando um aumento na área por cabeça polar do lipídio após a transição principal, e o modelo de Stern-Gouy-Chapman, foi possível mostrar que a transição causa um aumento no grau de dissociação da vesícula, aumentando portanto a concentração de íons em solução. Entretanto, dentro da estrutura desse modelo simples, foi necessário considerar diferentes constante de associação Na+-DMPG nas fases gel e líquido cristal, para explicar um aumento na repulsão entre as vesículas com a transição principal. Os mecanismos que governam a pós-transição são ainda menos claros.The temperature dependence of the intensity of light scattered by aqueous dispersions of the anionic lipid DMPG (dimyristoyl phosphatidylglycerol) was studied at different ionic strengths. The lipid main transition, gel-liquid crystal, can be well monitored by a sharp decrease in turbidity. As expected, the temperature of the main transition (Tm) was found to increase with the increase of the ionic strength. For low ionic strength, a DMPG second temperature transition, named post-transition, can be monitored by both an increase in light scattering and a decrease in conductivity. Zimm plot analysis indicates that bellow Tm the liposomes tend to aggregate, yielding a negative second virial coefficient A2, and particles of large molecular weight. At the phase transition, parallel to the decrease in turbidity, there is an increase in the sample conductivity, A2 becomes positive and the particle molecular weight decreases, indicating a non-aggregated state. Moreover, at the post-transition (Tp) A2 becomes very small, and the molecular weight increases again. Both the main and post transitions were found to be reversible. Opposite to the main transition, the post-transition could not be detected by spin labels placed either at the membrane surface, or in the bilayer core. Considering an increase in area per lipid headgroup upon the main transition, and the Stern-Gouy- Chapman model, it was possible to show that the main transition increases the vesicle degree of dissociation, hence increasing the ion concentration in solution. However, within the framework of that simple model, it was necessary to consider different Na+- DMPG association constants, in the gel and liquid phases, to explain an increase in vesicles repulsion upon the main transition. The mechanisms governing the posttransition are even less clear

Extensive Bilayer Perforation Coupled with the Phase Transition Region of an Anionic Phospholipid

At low ionic strength dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG) exhibits a broad phase transition region characterized by several superimposed calorimetric peaks. Peculiar properties, such as sample transparency, are observed only in the transition region. In this work we use differential scanning calorimetry (DSC), turbidity. and optical microscopy to study the narrowing of the transition region with the increase of ionic strength (0-500 mM NaCl). Upon addition of salt, the temperature extension of the transition region is reduced, and the number of calorimetric peaks decreases until a single cooperative event at T(m) = 23 degrees C is observed in the presence of 500 mM NaCl. The transition region is always coupled with a decrease in turbidity, but a transparent region is detected within the melting process only in the presence of up to 20 mM NaCl. The vanishing of the transparent region is associated with one of the calorimetric peaks. Optical microscopy of giant vesicles shows that bilayers first rupture when the transition region is reached and Subsequently lose optical contrast. Fluorescence microscopy reveals a blurry and undefined image in the transparent region, suggesting a different lipid self-assembly. Overall sample turbidity can be directly related to the bilayer optical contrast. Our observations are discussed in terms of the bilayer being perforated along the transition region. In the narrower temperature interval of the transparent region, dependent on the ionic strength, the perforation is extensive and the bilayer completely loses the optical contrast.FAPESPFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Universidade de São Paulo USPUniversidade de São Paulo (USP)CNPqConselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq

Observing the Solubilization of Lipid Bilayers by Detergents with Optical Microscopy of GUVs

The solubilization of lipid bilayers by detergents was studied with optical microscopy of giant unilamellar vesicles (GUVs) composed of palmitoyl oleoyl phoshatidylcholine (POPC). A solution of the detergents Triton X-100 (TX-100) and sodium dodecyl sulfate (SDS) was injected with a micropipette close to single GUVs. The solubilization process was observed with phase contrast and fluorescence microscopy and found to be dependent on the detergent nature. In the presence of TX-100, GUVs initially showed an increase in their surface area, due to insertion of TX-100 with rapid equilibration between the two leaflets of the bilayer. Then, above a solubility threshold, several holes opened, rendering the bilayer a lace fabric appearance, and the bilayer gradually vanished. On the other hand, injection of SDS caused initially an increase in the membrane spontaneous curvature, which is mainly associated with incorporation of SDS in the outer layer only. This created a stress in the membrane, which caused either opening of transient macropores with substantial decrease in vesicle size or complete vesicle bursting. In another experimental setup, the extent of solubilization/destruction of a collection of GUVs was measured as a function of either TX-100 or SDS concentration.FAPESPFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)INCT-FCxinctFCxCNPqConselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq