Pseudomonas aeruginosa That Specifically Mediates Chemotaxis Toward α-Ketoglutarate

Pseudomonas aeruginosa is an ubiquitous pathogen able to infect humans, animals, and plants. Chemotaxis was found to be associated with the virulence of this and other pathogens. Although established as a model for chemotaxis research, the majority of the 26 P. aeruginosa chemoreceptors remain functionally un-annotated. We report here the identification of PA5072 (named McpK) as chemoreceptor for α-ketoglutarate (αKG). High-throughput thermal shift assays and isothermal titration calorimetry studies (ITC) of the recombinant McpK ligand binding domain (LBD) showed that it recognizes exclusively α-ketoglutarate. The ITC analysis indicated that the ligand bound with positive cooperativity (Kd1 = 301 μM, Kd2 = 81 μM). McpK is predicted to possess a helical bimodular (HBM) type of LBD and this and other studies suggest that this domain type may be associated with the recognition of organic acids. Analytical ultracentrifugation (AUC) studies revealed that McpK-LBD is present in monomer-dimer equilibrium. Alpha-KG binding stabilized the dimer and dimer self-dissociation constants of 55 μM and 5.9 μM were derived for ligand-free and αKG-bound forms of McpK-LBD, respectively. Ligand-induced LBD dimer stabilization has been observed for other HBM domain containing receptors and may correspond to a general mechanism of this protein family. Quantitative capillary chemotaxis assays demonstrated that P. aeruginosa showed chemotaxis to a broad range of αKG concentrations with maximal responses at 500 μM. Deletion of the mcpK gene reduced chemotaxis over the entire concentration range to close to background levels and wild type like chemotaxis was recovered following complementation. Real-time PCR studies indicated that the presence of αKG does not modulate mcpK expression. Since αKG is present in plant root exudates it was investigated whether the deletion of mcpK altered maize root colonization. However, no significant changes with respect to the wild type strain were observed. The existence of a chemoreceptor specific for αKG may be due to its central metabolic role as well as to its function as signaling molecule. This work expands the range of known chemoreceptor types and underlines the important physiological role of chemotaxis toward tricarboxylic acid cycle intermediates. [EN]FEDER funds and Fondo Social Europeo through grants from the Junta de Andalucía (grant CVI-7335) and the Spanish Ministry for Economy and Competitiveness (grant BIO2013-42297). MM was supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness Postdoctoral Research Program, Juan de la Cierva (JCI-2012-11815).Peer reviewe

Low prevalence of vancomycin-resistant enterococci in clinical samples from hospitalized patients of the Canary Islands, Spain

Over the last decade vancomycin-resistant enterococci (VRE) have emerged as nosocomial pathogens. The aim of this study was to determine the prevalence of VRE in clinical samples from hospitalized patients in the Canary Islands. From April to November 2000, 437 enterococci were isolated from patients hospitalized at the four main health care centers in those islands. Identification to the species level was performed with the GPS-TA (Vitek 1) or the Wider I system. A PCR assay was used to determine the genotype of glycopeptide resistance (vanA, vanB, vanC1, and vanC2/C3 genes). Only three (0.7%) VRE were detected: one vanA Enterococcus faecalis, and two vanC1 Enterococcus gallinarum. To our knowledge, this is the first VRE study carried out in the Canary Islands hospitals, and the results showed a low prevalence of VRE

Ceniza y lava: revelaciones científicas junto al volcán

Para la exposición se ha contado con el apoyo del Museo de la Ciencia y el Cosmos (La Laguna, Tenerife) del Cabildo de Tenerife, uno de los centros más visitados en la comunidad canaria por su enfoque interactivo de la divulgación científica. Ceniza y lava acerca el fenómeno geológico al público general para que experimente y comprenda la naturaleza, promoviendo la percepción de lo plausible en nuestro entorno y que adquiera conocimientos básicos para actuar. A diferencia de otros eventos divulgativos similares, esta exposición busca acercar a la población la experiencia investigadora implementada por tierra, mar y aire con sus hallazgos: materiales recopilados, metodologías utilizadas y conclusiones adquiridas, y lo hace de una manera inmersiva, interactiva y didáctica. La exhibición, programada del 29 de junio de 2023 al 30 de junio de 2024, permite ver, y en algunos casos manipular, materiales e instrumentos utilizados en las investigaciones y que por primera vez se han recopilado y museizado para ser exhibidos. Se compone de dos partes: 1) Ceniza y lava. En esta primera sala se recrea la erupción a través de diversos elementos: proyecciones impactantes, datos clave en una pared, línea del tiempo geológica de La Palma, visión nocturna de la erupción a gran escala, evolución diaria de las coladas sobre una reproducción 3D de la isla de 2 m de longitud y caleidoscopio inmersivo de un tubo lávico. 2) Revelaciones científicas. La transición de una sala a otra se realiza a través de una carpa, réplica de un puesto de mando avanzado que sirvió de zona de trabajo, reunión, atención a medios e incluso de descanso del personal investigador. En la segunda sala se accede a materiales, herramientas y descubrimientos realizados en la erupción desde las perspectivas de tierra, mar y aire. Esta exposición es fruto de la sinergia entre el personal científico de los centros CSIC en Canarias que se desplazó a la erupción y el de otras entidades como GE3BCN, el servicio de PRL del CSIC, el MUNA o el GES del Gobierno de Canarias, entre otros.Los equipos de investigación de los centros de la Delegación del CSIC en Canarias (IPNA, IEO e IGME) desempeñaron un papel crucial en la erupción de La Palma abordándola desde diferentes perspectivas: tierra, mar y aire. Su misión: entender el comportamiento del volcán y proporcionar información valiosa a las autoridades locales y equipos de emergencias para la toma de decisiones en gestión de desastres y protección de la población. Con idea de visibilizar este trabajo, esta labor se plasmó en una exposición 360° que es un testimonio poderoso de cómo la colaboración científica puede iluminar fenómenos naturales y su impacto en nuestra comunidad.FECYTOrganismo Autónomo de Museos y Centros de Tenerife (OAMC)Delegación del CSIC en CanariasPeer reviewedEnlace a la visita virtual de la exposición: https://meta.yonders.io/tour/museo-ciencia-y-cosmo

Informe final del escaneo de horizonte sobre futuras especies exóticas invasoras en España

73 p.La introducción de especies exóticas invasoras (EEI) es una de las principales causas de la pérdida de biodiversidad a nivel global, que provoca grandes costes socioeconómicos. Sin embargo, el número de nuevas introducciones continúa creciendo año tras año. Por lo tanto, urge identificar posibles futuras EEI con el objetivo de diseñar e implementar medidas que prevengan y mitiguen los efectos negativos de su introducción. Así, el objetivo de este estudio es prospectar qué especies exóticas no establecidas en España podrían llegar fácilmente en los próximos 10 años, establecerse y causar importantes impactos ecológicos. Para ello, se ha realizado un escaneo de horizonte, siguiendo la metodología establecida en trabajos previos, siendo el primero para el conjunto de las especies exóticas invasoras en España. Se añadieron en el análisis especies que no son autóctonas de España, incluyendo los archipiélagos de Canarias y Baleares, y que no están establecidas en España. Un total de 39 científicos, expertos en distintos grupos taxonómicos y ecosistemas, ha evaluado 933 especies. Con el objetivo de analizar el acuerdo entre las evaluaciones individuales de los expertos y su consistencia, se llevaron a cabo dos análisis de fiabilidad complementarios, cuyos resultados se discuten en este informe. Como resultado del escaneo, se obtuvo una lista priorizada de 105 especies (46 con riesgo muy alto y 59 con riesgo alto). La mayoría de estas especies (84,8%), sin embargo, no están incluidas actualmente en el Catálogo Español de Especies Exóticas Invasoras. Por lo tanto, se recomienda la realización de un análisis de riesgo más detallado de estas especies y, si se confirma el riesgo alto, la solicitud de su incorporación en dicho catálogo o en el Listado de especies alóctonas susceptibles de competir con las especies silvestres autóctonas, alterar su pureza genética o los equilibrios ecológicos. Del mismo modo, se propone la realización de escaneos de horizonte específicos para los archipiélagos de Canarias y Baleares, ya que muchas de las especies autóctonas de la Península no lo son de las islas y podrían tener un gran impacto si allí se introdujeran. Este informe también analiza la afinidad taxonómica (i.e. filo) y funcional (i.e. productor primario, depredador, omnívoro, herbívoro o filtrador) de las especies de la lista priorizada, su origen geográfico y las principales vías de introducción. Por último, discute los mecanismos de impacto de dichas especies.Ministerio de Ciencia e Innovació

Caracterización de un nuevo mutante termosensible de la RNasa E en el metabolismo del RNA de "Escherichia coli"

La endorribonucleasa E (RNasa E) de Escherichia coli, fue inicialmente descubierta como una enzima implicada en la maduración del RNA ribosómico (rRNA) 5S. Posteriormente, se demostró el papel multifuncional de la RNasa E en diferentes aspectos del metabolismo del RNA de E. coli, incluyendo la degradación de la mayoría de los RNA mensajeros (mRNAs), procesamiento de los extremos 3’ de los RNA transferentes (tRNAs), maduración del rRNA 16S, procesamiento y/o degradación de RNA reguladores pequeños (sRNAs), procesamiento de la subunidad de RNA (M1 RNA) de la RNasa P y control de la replicación de los plásmidos tipo ColE1 mediante la degradación de un RNA antisentido represor de la replicación denominado RNAI. Además de su importante papel en el metabolismo del RNA, se ha sugerido que la RNasa E forma parte del citoesqueleto de E. coli. La inactivación de esta enzima resulta en la producción de una morfología celular filamentosa e incapacidad para formar colonias en medio sólido. La acción de la RNasa E es esencial para la viabilidad de E. coli, y está conservada en la mayoría de las bacterias Gram negativas y en un número limitado de Gram positivas, lo cual la convierte en una potencial diana terapéutica. La RNasa E presenta un dominio N-terminal donde reside la actividad catalítica, una región central rica en argininas implicada en la unión al RNA (ARRBS) y una región C-terminal que sirve como plataforma de anclaje para otras proteínas implicadas en la degradación de mRNA, formando un complejo multiproteico denominado degradosoma. Sin embargo, solamente la región N-terminal de la RNasa E es necesaria para mantener la viabilidad celular, y es la región de la proteína más conservada durante la evolución. El análisis de los dos únicos mutantes termosensibles de la RNasa E de E. coli (rne-1 y rne-3071), caracterizados hasta hoy, han contribuido enormemente al conocimiento de la función de la RNasa E en E. coli. A pesar de los importantes progresos realizados en la determinación de la importancia funcional de la RNasa E en el metabolismo del RNA y la resolución de la estructura cristalina del dominio N-terminal catalítico, existe un limitado conocimiento de los residuos de aminoácidos y subdominios funcionales de la RNasa E implicados en la unión al sustrato, la especificidad de corte y su dependencia por el extremo 5’ monofosforilado del sustrato. La presente memoria de tesis describe el aislamiento y la caracterización in vivo de un nuevo mutante termosensible de la RNasa E, que presenta la sustitución de un aminoácido (Pro→Leu) en la posición 204 de la secuencia de aminoácidos de la RNasa E. El análisis de este mutante fue realizado tanto en su forma completa, rne-204, como en una forma truncada, rne645/204, la cual contiene los primeros 417 aminoácidos del dominio catalítico N-terminal, pero carece de la región ARRBS y de la región de andamiaje del degradosoma. Esta mutación está localizada en el domino N-terminal y dentro del subdominio denominado 5’sensor, el cual está implicado en el reconocimiento de los extremos 5’ de los sustratos de RNA de la RNasa E. Analizamos el efecto in vivo de dicha mutación sobre la tasa de crecimiento, la viabilidad celular, el procesamiento del 5S rRNA, la maduración de distintos tRNAs, así como las vidas medias de diversos mRNAs y la regulación de la propia RNasa E. Por otro lado, se examinó en estos mutantes el efecto en los niveles de expresión de los genes, ftsZ y ftsA, esenciales para la correcta división celular y cuyos transcritos primarios son procesados por la RNasa E, así como la morfología celular de estos mutantes en condiciones de temperatura permisiva y no permisiva. Los resultados obtenidos del estudio de estos mutantes demuestran que el subdominio 5’ sensor es importante para la actividad catalítica de la RNasa E y que la región C-terminal de andamiaje del degradosoma no es esencial, pero si necesaria para una eficiente degradación y procesamiento del RNA. Además, estos mutantes presentan un crecimiento dependiente de la temperatura acompañado de un defecto general del metabolismo del RNA y una pérdida de la autorregulación de la RNasa E. Sorprendentemente, el análisis microscópico de los mutantes reveló una relación entre el bloqueo de la citocinesis y la inactividad de la RNasa E

Detection of immune response activation by exogenous nucleic acids by a multiplex RT-PCR method

Transfection of mammalian cells or in vivo administration of nucleic acids can induce inflammatory cytokines and/or interferon response, which could significantly influence the ex vivo or in vivo applications of gene-targeting strategies based on nucleic acids. Further induction of the interferon and inflammatory related stress responses may result in off-target effects and toxicity. This work describes an original one-step multiplex reverse transcription polymerase chain reaction procedure, which allows testing the induction of interferon and proinflamatory related responses by nucleic acids in the cell system of choice. The developed procedure has been tested on mammalian cells transfected with ssRNA, dsRNA, enzymatically synthesized siRNA and synthetic oligodesoxyribonucleotides containing unmethylated cytosine-guanosine motifs. This procedure is a rapid and convenient screening assay that could be used routinely in both the clinical and the research laboratory to validate the stimulation of the immune system on mammalian cells by nucleic acids.This work was supported by grants BFU2009-08137 and BFU2012-31213 from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación, and grant 36472/05 from FIPSE to A. B-H. J.A.R-D. was funded by grant 36472/05 from FIPSE. Work at our laboratory is partially supported by FEDER funds from the EU.Peer reviewe

HIV RNA dimerisation interference by antisense oligonucleotides targeted to the 5' UTR structural elements

The HIV-1 genome consists of two identical RNA molecules non-covalently linked by their 5' unstranslatable regions (5' UTR). The high level of sequence and structural conservation of this region correlates with its important functional involvement in the viral cycle, making it an attractive target for antiviral treatments based on antisense technology. Ten unmodified DNA antisense oligonucleotides (ODNs) targeted against different conserved structural elements within the 5' UTR were assayed for their capacity to interfere with HIV-1 RNA dimerisation, inhibit gene expression, and prevent virus production in cell cultures. The results show that, in addition to the well-characterised dimerisation initiation site (DIS), targeting of the AUG-containing structural element may reflect its direct role in HIV-1 genomic RNA dimerisation in vitro. Similarly, blocking the 3' end sequences of the stem-loop domain containing the primer biding site interferes with RNA dimerisation. Targeting the apical portion of the TAR element, however, appears to promote dimerisation. ODNs targeted against the conserved polyadenylation signal [Poly(A)], the primer binding site (PBS), the major splicing donor (SD) or the major packaging signal (Psi), and AUG-containing structural elements led to a highly efficient inhibition of HIV-1 gene expression and virus production in cell culture. Together, these results support the idea that ODNs possess great potential as molecular tools for the functional characterisation of viral RNA structural domains. Moreover, the targeting of these domains leads to the potent inhibition of viral replication, underscoring the potential of conserved structural RNA elements as antiviral targets. © 2012 Elsevier B.V.Peer Reviewe

Inhibition of HIV-1 replication and dimerization interference by dual inhibitory RNAs

The 5'-untranslated region (5'UTR) of the HIV-1 RNA is an attractive target for engineered ribozymes due to its high sequence and structural conservation. This region encodes several conserved structural RNA domains essential in key processes of the viral replication and infection cycles. This paper reports the inhibitory effects of catalytic antisense RNAs composed of two inhibitory RNA domains: An engineered ribozyme targeting the 5' UTR and a decoy or antisense domain of the dimerization initiation site (DIS). These chimeric molecules are able to cleave the HIV-1 5'UTR efficiently and prevent viral genome dimerization in vitro. Furthermore, catalytic antisense RNAs inhibited viral production up to 90% measured as p24 antigen levels in ex vivo assays. The use of chimeric RNA molecules targeting different domains represents an attractive antiviral strategy to be explored for the prevention of side effects from current drugs and of the rapid emergence of escape variants of HIV-1.Peer Reviewe

In vitro and ex vivo selection procedures for identifying potentially therapeutic DNA and RNA molecules

It was only relatively recently discovered that nucleic acids participate in a variety of biological functions, besides the storage and transmission of genetic information. Quite apart from the nucleotide sequence, it is now clear that the structure of a nucleic acid plays an essential role in its functionality, enabling catalysis and specific binding reactions. In vitro selection and evolution strategies have been extremely useful in the analysis of functional RNA and DNA molecules, helping to expand our knowledge of their functional repertoire and to identify and optimize DNA and RNA molecules with potential therapeutic and diagnostic applications. The great progress made in this field has prompted the development of ex vivo methods for selecting functional nucleic acids in the cellular environment. This review summarizes the most important and most recent applications of in vitro and ex vivo selection strategies aimed at exploring the therapeutic potential of nucleic acids. © 2010 by the authors.Peer Reviewe

Inhibition of HIV-1 replication by RNA-based strategies

The major etiologic agent of the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), which belongs to the family of human retroviruses. This pandemic infection affects millions of people worldwide. The most efficient current treatment regimen for HIV-infected individuals combines two or more drugs targeting different HIV-specific enzymes. However, the emergence of multiple drug-resistant HIV-1 strains and the side effects of drug-based therapies make alternative approaches for the treatment of HIV infection and AIDS necessary. RNA-based antiviral approaches are among the most promising for developing long-term anti-HIV therapies. Anti-HIV-1 RNA-based strategies include ribozymes, antisense RNAs, RNA aptamers, RNA decoys, external guide sequences (EGS) for site-specific cleavage of RNA molecules with human ribonuclease P (RNase P), modified small nuclear RNA (RNAu) and small interfering RNAs (siRNAs). This review describes the main features and functions of viral and cellular targets as well as the different classes of RNA molecules that have been explored in developing therapeutic strategies against HIV infection. Many RNA-based strategies are already being tested in human clinical trials or are currently being developed for future trials.This work was supported by grants 34672/05 from FIPSE and BIO-265 from the Junta de Andalucía to AB-HPeer reviewe