Efeitos citotóxicos da interação entre nanopartículas de prata e metais não essenciais em células de hepatocarcinoma humano (HEPG2)

Orientador :Prof. Dr. Francisco Filipak NetoCoorientador : Prof. Dr. Frank KjeldsenTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 28/03/2017Inclui referênciasResumo: Devido a intensa produção e incorporação de AgNP em produtos para consumo, espera-se que estas sejam, direta ou indiretamente, liberadas em ambiente naturais, o que representa uma via de exposição em potencial não apenas para a biota, mas também para humanos. Apesar de muitos estudos terem demonstrado o potencial tóxico de AgNP em células e organismos, a co-exposição com contaminantes onipresentes na natureza, como metais, pode induzir efeitos que não podem ser previstos a partir daqueles gerados por exposições isoladas. Nesta tese, as interações toxicológicas entre AgNP e Cd/Hg foram investigadas em células HepG2. No primeiro capítulo, ensaios bioquímicos, microscopia confocal e quantificação intracelular de metais indicaram que as co-exposições resultam em interações toxicológicas, sendo a associação de AgNP+Cd mais tóxica do que AgNP+Hg. Aumentos nos níveis de EROs citosólicas e mitocondrial foram observados após 2-4 h de exposição a AgNP+ Cd/Hg, porém esse efeito foi parcialmente revertido após 24 h de exposição a AgNP+Hg. Ainda, decréscimos da viabilidade celular, metabolismo, proliferação e atividade dos transportadores MDR foram mais pronunciados em células co-expostas aos contaminantes do que aos contaminantes individuais. As co-exposições levaram ao aumento da morte celular, principalmente por necrose, e aumento na concentração intracelular de Hg. Desta forma, interações toxicológicas resultam na potencialização da toxicidade de AgNP, Cd e Hg. Enquanto o aumento intracelular de Hg pode estar relacionado com a maior toxicidade de AgNP+Hg, essa lógica não é válida para os efeitos deletérios observados após a co-exposição a AgNP+Cd. Desta forma, o segundo capítulo foi conduzido de modo a explorar mais aprofundadamente os efeitos celulares e moleculares induzidos pela associação entre as AgNP e Cd. A viabilidade celular e relação ADP/ATP foram pouco alteradas após 4 h de exposição; no entanto, esses parâmetros foram substancialmente alterados após 24 h. Os resultados da análise proteômica seguiram o mesmo padrão: enquanto após 4 h as exposições aos contaminantes o proteoma total das células foi pouco alterado, após 24 h de exposição às AgNP e Cd, cerca de 7% e 2% do proteoma total foi desregulado, respectivamente, enquanto 43% deste foi alterado após co-exposição a AgNP+Cd. Resumidamente, a toxicidade desta associação parece estar envolvida com a inativação de Nrf-2, o que pode resultar na redução dos níveis da defesa antioxidante, e proteínas relacionadas aos proteossomos; redução dos níveis de proteínas envolvidas na via glicolítica e aumento nos níveis de proteínas envolvidas com a fosforilação oxidativa e metabolismo de lipídios, o que pode indicar uma tentativa de retorno às condições de homeostase energética. No entanto, essa estratégia de adaptação celular não foi suficiente para reestabelecer a homeostase de ADP/ATP e impedir a morte celular. De maneira geral, este estudo fornece as primeiras informações a respeito da interação toxicológica entre AgNP e metais não essenciais em modelo in vitro. Palavras-chave: AgNP, cádmio, mercúrio, co-exposição, interação, ensaios bioquímicos, proteômica.Abstract: Due to the increasing production and applications of AgNP in consumer products, AgNP are expected to be, directly or indirectly, released into natural environments, representing a potential threat to the biota and humans. An increasing number of studies have described the toxic potential of AgNP in cells and organisms. However, co-exposure of AgNP with ubiquitous contaminants, such as metals, may result in non-predictable outcomes. In this thesis, toxicological interactions of AgNP, Cd and Hg were investigated in HepG2 cells. In the first chapter, biochemical endpoints, confocal microscopy and intracellular metal concentration indicated that the co-exposures led to toxicological interactions, with AgNP + Cd being more toxic to HepG2 cells than AgNP + Hg. Early (2-4 h) increases of cytosolic and mitochondrial ROS were observed in the cells co-exposed to AgNP + Cd/Hg, in comparison to the control and individual contaminants, but the effect was partially reverted in AgNP + Hg at the end of 24 h-exposure. In addition, decreases of mitochondrial metabolism, cell viability, cell proliferation and ABC-transporters activity were also more pronounced in the co-exposure groups. Foremost, co-exposure to AgNP and metals potentiated cell death (mainly by necrosis) and Hg (but not Cd) intracellular levels. Therefore, toxicological interactions seem to increase the toxicity of AgNP, Cd and Hg. While an increase of Hg uptake might be related to the increase of toxicity after exposure to AgNP+Hg, this logic is not valid for the high toxicity observed after co-exposure to AgNP+Cd. Therefore, the second chapter was conducted to further explore cellular and molecular effects induced by this co-exposure. Cell viability and ADP/ATP ratio were slightly affected after the 4 h exposure to individual and combined exposures. However, these endpoints were strongly altered after 24 h co-exposure to AgNP+Cd compared to the control and individual exposures. The proteomics data followed the same trend: minor deregulation at 4 h-exposure in all groups and 7% (AgNP), 2% (Cd) and 43% (AgNP+Cd) at 24 h-exposure. Briefly, the toxicity induced by AgNP+Cd seems to be involved the inactivation of Nrf-2, which can result in down-regulation of antioxidant defense and proteasome related proteins, down-regulation of glycolysis related proteins and upregulation of oxidative phosphorylation and lipid metabolism proteins. This may indicate an attempt to reestablish homeostasis. Thus, the adaptation strategy was not able to restore ADP/ATP homeostasis and avoid cell death. Overall, this study provides the first insights into cellular outcomes after the co-exposure to AgNP and non-essential metals. Key words: AgNP, cadmium, mercury, co-exposure, interaction, biochemical endpoints, proteomics

Análise morfológica da espermateca de fêmeas adultas de loxosceles intermedia Mello-Leitão (1934) (Araneae: Sicariidea), após 24 horasda transferência de espermatozóides

Orientadora: Claudia Feijó Ortolani-MachadoMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências BiológicasResumo : A aranha marrom, Loxosceles intermedia, é uma espécie venenosa e cosmopolita, amplamente distribuída no município de Curitiba. Como esses animais colonizaram os ambientes antrópicos com sucesso, são considerados um problema de saúde pública na região. A grande distribuição dessas aranhas está relacionada com a sua resistência – podendo passar semanas sem alimento ou água - e a sua alta capacidade reprodutiva, uma vez que fêmea armazena os espermatozóides dos machos com os quais copulou em estruturas denominadas espermatecas. O objetivo deste trabalho foi descrever, anatômica e histologicamente, as espermatecas de L. intermedia, 24 horas após a cópula. Para tanto, foram realizados três métodos de análise: montagem total (MT), microscopia de luz (MO) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Fêmeas adultas foram coletadas e 24 horas após a cópula, anestesiadas e sacrificadas. Em seguida, o abdome foi fixado através da injeção de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 na região posterior, durante 15 minutos. Após esse período, sob microscópio estereoscópico, foram retirados o hepatopâncreas e ovários para a observação das espermatecas, que foram fixadas por mais 2 horas. Através da montagem total é possível analisar anatomicamente as espermatecas. Observou-se que a fêmea contém 2 espermatecas que se inserem próximas à fenda genital. Cada uma é formada por um ducto alongado, sinuoso e quitinizado, sendo encontrados poros em toda sua extensão. Em seu término, há um bulbo, de pequena dimensão se comparado ao comprimento do ducto, nos bulbos não foi detectado a presença de poros. Através deste método foi possível perceber claramente que o bulbo não é quitinizado. Em microscopia de luz, a região das espermatecas foi submetida ao protocolo padrão para emblocagem em historesina. Cortes seriados de 5µm foram corados com HE, azul de toluidina e PAS, e analisados ao microscópio de luz. Os resultados obtidos mostraram que a espermateca é revestida por um tecido glandular com núcleos basais. Foi detectada a presença de secreção espermatecal, composta por glicoproteínas básicas, na qual estão imersos espermatozóides, organizados em sincício, por toda a extensão das espermatecas. A MEV permitiu a observação dos poros nos ductos. Uma vez que esse órgão é capaz de manter espermatozóides por longos períodos após a cópula, o seu estudo é fundamental para limitar a reprodução de L. intermedia e, consequentemente, a incidência de acidentes loxoscélicos

Respostas biológicas de Prochilodus lineatus frente a nanopartículas agregadas de dióxido de titânio e óxido de zinco

Orientador : Prof. Dr. Francisco Filipak NetoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 25/02/2013Inclui referências : f. 59-64Área de concentração: Biologia celular e molecularResumo: A produção e consumo crescentes de produtos que contêm nanopartículas resultam na liberação direta ou indireta desses materiais nos ambientes naturais. Os nanometais, como o de zinco (Zn), titânio (Ti) e seus óxidos, estão entre as nanopartículas mais utilizadas, tendo aplicações em diversas áreas, e estima-se que ambos poderão vir a ser encontrados em ambientes aquáticos na ordem de microgramas por litro de água. No entanto, pouco se sabe a respeito de seus efeitos em animais aquáticos. Desta forma, este trabalho tem como objetivo investigar os efeitos de nanopartículas de TiO2 e ZnO em Prochilodus lineatus, espécie de teleósteo amplamente distribuída na America do Sul. Para tanto, os peixes foram expostos aos nanometais em bioensaios durante 5 e 30 dias às concentrações de 0,1 ?g/l, 1,0 ?g/l e 10 ?g/l de TiO2; 7 ?g/l, 70 ?g/l e 700 ?g/l de ZnO; e associação de TiO2 e ZnO nas concentrações de 1 ?g/l e 70 ?g/l, respectivamente. Após cada período de exposição, o fígado, cérebro, músculo e brânquias foram coletados e submetidos a análises histopatológicas, bioquímicas, com foco no estresse oxidativo e de neurotoxicidade. A caracterização das suspensões estoque indicou que as nanopartículas são instáveis e tendem a formar agregados em meio aquoso capazes de provocar efeitos nocivos em P. lineatus. A ocorrência de estresse oxidativo foi observada devido ao aumento nos níveis de carbonilação de proteínas após a exposição aguda ao ZnO no cérebro, subcrônica no fígado e após ambas nas brânquias. No fígado, o sistema antioxidante, representado pela glutationa, foi eficiente em eliminar as espécies reativas de oxigênio produzidas por TiO2; no entanto, as concentrações dessa molécula mantiveram-se inalteradas após as exposições ao ZnO. A AchE apresentou redução de atividade após exposição aguda no cérebro (nos grupos expostos à mistura de ZnO e TiO2 e a 7 e 700 ?g/l de ZnO) e no músculo após a exposição ao TiO2. Referente à histopatologia do fígado, diferença significativa entre o grupo exposto a 70 ?g/l de ZnO e o controle foi encontrada após a exposição subcrônica, enquanto a exposição aguda afetou animais expostos à 0,1 ?g/l de TiO2 e 700 ?g/l de ZnO. Quanto às misturas, foram observados efeitos contrários daqueles induzidos pelas partículas isoladas, no fígado e cérebro. A partir desses dados supõe-se que o material particulado pode ter sido absorvido pelos animais. Já para as brânquias, as lesões encontradas poderiam ser decorrentes do seu contato direto com os agregados nanoparticulados NPs. As respostas obtidas por esses biomarcadores permitem assumir que as nanopartículas de TiO2 e ZnO não são inócuas, mesmo em concentrações realísticas. P. lineatus. Palavras-chave: nanopatículas, ZnO, TiO2, peixes, EROAbstract: The increase in production and consumption of products that contain nanoparticles results, directly or indirectly, in the increased release of these materials into natural environments. Nanometals, such as zinc (Zn) and titanium (Ti), are among the most widely utilized nanoparticles, with applications in several areas so that they are expected to be found in aquatic environment at concentrations of micrograms per liter. However, little is known about their effects in aquatic animals. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of TiO2 and ZnO nanoparticles to Prochilodus lineatus, a widely distributed fish species in South America. Fish were exposed to either 0.1 ?g/l, 1.0 ?g/l and 10 ?g/l of TiO2; 7 ?g/l, 70 ?g/l and 700 ?g/l of ZnO; or the association of 70 ?g/l of ZnO and 1 ?g/l of TiO2 , for up to 5 and 30 days. After the exposure, liver, brain, muscle and gills were collected and submitted to biochemical and histopathological analyses. Characterization of the stock suspensions showed that these nanoparticles are unstable and tend to aggregate in water. However, these aggregates were capable to induce harmful effects in P. lineatus. Oxidative stress was confirmed by the increase of protein carbonyl levels in the brain, liver and gills. Glutathione was efficient in eliminating the reactive oxygen species produced by TiO2. On the other hand, no disturbances were observed in glutathione after ZnO exposure. AchE activity was reduced after acute exposure to 7 and 700 ?g/l of ZnO ZnO, as well as to the association in the brain, and after TiO2 acute exposure in the muscle. Liver histopathological analyses revealed significant differences between the control group and those acutely exposed to 0,1 ?g/l of TiO2 and 700 ?g/l of ZnO, as well as subchronically exposed to 70 ?g/l of ZnO, after. The association of ZnO and TiO2, induced the opsite effect in the liver and brain. Based on these data, we suppose that the nanoparticulated material may have been absorved by the fish. Conversely, gills damage may happen through in direct contact with the nanoparticles. Overall, the results of this work allow to assume that TiO2 and ZnO nanoparticles are not harmless to P. lineatus, even when present at realistic concentrations. Key words: nanoparticles, ZnO, TiO2, fish, RO

Co-exposure to silver nanoparticles and cadmium induce metabolic adaptation in HepG2 cells

<p>Although multiple studies have reported the toxicological effects and underlying mechanisms of toxicity of silver nanoparticles (AgNP) in a variety of organisms, the interactions of AgNP with environmental contaminants such as cadmium are poorly understood. We used biochemical assays and mass spectrometry-based proteomics to assess the cellular and molecular effects induced by a co-exposure of HepG2 cells to AgNP and cadmium. Cell viability and energy homeostasis were slightly affected after a 4-h exposure to AgNP, cadmium, or a combination of the two; these endpoints were substantially altered after a 24-h co-exposure to AgNP and cadmium, while exposure to one of the two contaminants led only to minor changes. Proteomics analysis followed the same trend: while a 4-h exposure induced minor protein deregulation, a 24-h exposure to a combination of AgNP and cadmium deregulated 43% of the proteome. The toxicity induced by a combined exposure to AgNP and cadmium involved (1) inactivation of Nrf2, resulting in downregulation of antioxidant defense and proteasome-related proteins, (2) metabolic adaptation and ADP/ATP imbalance, and (3) increased protein synthesis possibly to reestablish homeostasis. The adaptation strategy was not sufficient to restore ADP/ATP homeostasis and to avoid cell death.</p