Terapia génica para la hormona tímica timulina en modelos de timodeficiencia

La timulina es una hormona producida exclusivamente por las células epiteliales tímicas; consiste en un nonapéptido biológicamente inactivo (facteur thymique sérique o FTS) coordinado al ión Zn+2 en una relación equimolecular 1:1, lo cual le confiere su actividad biológica característica. La timulina participa en la diferenciación de los linfocitos T y en la modulación de varias de sus funciones. Los niveles circulantes de esta hormona se encuentran disminuidos durante el envejecimiento normal y en patologías tales como el SIDA y el síndrome de DiGeorge, una enfermedad caracterizada por la ausencia congénita del timo y de las glándulas parótidas. La secreción de timulina está influenciada por una compleja trama endocrina que incluye a la mayoría de las hormonas adenohipofisarias y periféricas. Recíprocamente, existe evidencia de que además de su acción inmunomoduladora, la timulina posee actividad hipofisotrófica in vitro y, por lo tanto, puede actuar directamente sobre la adenohipófisis in vivo, modulando la respuesta de la glándula a secretagogos o inhibidores hipotalámicos. En los últimos años, un número creciente de estudios coloca a la timulina como un mediador fisiológico (el primero descripto) del eje timo-cerebro-hipófisis. Además, existe evidencia de que la timulina estimula la liberación de citoquinas de ciertos tipos de linfocitos y de que posee actividad antiinflamatoria y analgésica en el sistema nervioso central y en modelos de inducción de la inflamación, a nivel periférico y local. La actividad endocrina y antiinflamatoria de este metalopéptido ha generado un creciente interés en la posibilidad de implementar estrategias de terapia génica para timulina en situaciones de disfunción tímica o en patologías cerebrales asociadas a procesos inflamatorios. Desafortunadamente, hasta el momento no se ha logrado clonar el gen de la timulina. Esta situación nos condujo a diseñar una secuencia sintética de ADN codificante para un análogo biológicamente activo de timulina, metFTS, la cual fue clonada en vectores de expresión apropiados, a fin de caracterizar las propiedades biológicas de dicho análogo tanto in vitro como in vivo. Una vez demostrada la funcionalidad del gen sintético diseñado, se construyó un vector adenoviral recombinante (RAd-FTS) portador de dicho gen sintético para implementar estrategias de terapia génica in vivo en modelos animales de timodeficiencia. Uno de estos modelos, el ratón congénitamente atímico (nude), exhibe ciertas deficiencias reproductivas que parecen estar directamente vinculadas a su carencia de hormonas tímicas circulantes. En efecto, pocos días después del nacimiento, tanto el ratón nude como el ratón normal neonatalmente timectomizado, desarrollan, además de un severo cuadro de inmunodeficiencia, una serie de alteraciones degenerativas en las glándulas tiroides, adrenales y expresan severas deficiencias en su función reproductiva. El vector adenoviral RAd-FTS logró una restauración prolongada de los niveles de timulina circulante cuando fue inyectado intramuscularmente en ratas y ratones adultos timectomizados. Asimismo, la terapia génica neonatal para timulina en la hembra nude, logró restaurar los niveles de timulina sérica y prevenir las alteraciones a nivel hipotalámo-gonadotropo-ovárico que típicamente ocurren en estos mutantes en la adultez. Consecuentemente, estos resultados señalan a la timulina como el mediador fisiológico, o al menos uno de los mediadores, de la influencia perinatal del timo sobre la maduración del eje hipotálamo-hipófisogonadal. Dicha influencia podría ejercerse a través del sistema neuroendocrino y/o directamente a nivel ovárico. Nuestros resultados se suman a la evidencia de que la timulina juega un rol fisiológico relevante como mediadora de la influencia perinatal del timo sobre la maduración del eje reproductivo y sugieren que terapia génica con el gen sintético para la timulina puede constituir una estrategia terapéutica efectiva para el abordaje de déficits reproductivos asociados con disfunciones endocrinas del timo.Facultad de Ciencias Exacta

Terapia génica para la hormona tímica timulina en modelos de timodeficiencia

La timulina es una hormona producida exclusivamente por las células epiteliales tímicas; consiste en un nonapéptido biológicamente inactivo (facteur thymique sérique o FTS) coordinado al ión Zn+2 en una relación equimolecular 1:1, lo cual le confiere su actividad biológica característica. La timulina participa en la diferenciación de los linfocitos T y en la modulación de varias de sus funciones. Los niveles circulantes de esta hormona se encuentran disminuidos durante el envejecimiento normal y en patologías tales como el SIDA y el síndrome de DiGeorge, una enfermedad caracterizada por la ausencia congénita del timo y de las glándulas parótidas. La secreción de timulina está influenciada por una compleja trama endocrina que incluye a la mayoría de las hormonas adenohipofisarias y periféricas. Recíprocamente, existe evidencia de que además de su acción inmunomoduladora, la timulina posee actividad hipofisotrófica in vitro y, por lo tanto, puede actuar directamente sobre la adenohipófisis in vivo, modulando la respuesta de la glándula a secretagogos o inhibidores hipotalámicos. En los últimos años, un número creciente de estudios coloca a la timulina como un mediador fisiológico (el primero descripto) del eje timo-cerebro-hipófisis. Además, existe evidencia de que la timulina estimula la liberación de citoquinas de ciertos tipos de linfocitos y de que posee actividad antiinflamatoria y analgésica en el sistema nervioso central y en modelos de inducción de la inflamación, a nivel periférico y local. La actividad endocrina y antiinflamatoria de este metalopéptido ha generado un creciente interés en la posibilidad de implementar estrategias de terapia génica para timulina en situaciones de disfunción tímica o en patologías cerebrales asociadas a procesos inflamatorios. Desafortunadamente, hasta el momento no se ha logrado clonar el gen de la timulina. Esta situación nos condujo a diseñar una secuencia sintética de ADN codificante para un análogo biológicamente activo de timulina, metFTS, la cual fue clonada en vectores de expresión apropiados, a fin de caracterizar las propiedades biológicas de dicho análogo tanto in vitro como in vivo. Una vez demostrada la funcionalidad del gen sintético diseñado, se construyó un vector adenoviral recombinante (RAd-FTS) portador de dicho gen sintético para implementar estrategias de terapia génica in vivo en modelos animales de timodeficiencia. Uno de estos modelos, el ratón congénitamente atímico (nude), exhibe ciertas deficiencias reproductivas que parecen estar directamente vinculadas a su carencia de hormonas tímicas circulantes. En efecto, pocos días después del nacimiento, tanto el ratón nude como el ratón normal neonatalmente timectomizado, desarrollan, además de un severo cuadro de inmunodeficiencia, una serie de alteraciones degenerativas en las glándulas tiroides, adrenales y expresan severas deficiencias en su función reproductiva. El vector adenoviral RAd-FTS logró una restauración prolongada de los niveles de timulina circulante cuando fue inyectado intramuscularmente en ratas y ratones adultos timectomizados. Asimismo, la terapia génica neonatal para timulina en la hembra nude, logró restaurar los niveles de timulina sérica y prevenir las alteraciones a nivel hipotalámo-gonadotropo-ovárico que típicamente ocurren en estos mutantes en la adultez. Consecuentemente, estos resultados señalan a la timulina como el mediador fisiológico, o al menos uno de los mediadores, de la influencia perinatal del timo sobre la maduración del eje hipotálamo-hipófisogonadal. Dicha influencia podría ejercerse a través del sistema neuroendocrino y/o directamente a nivel ovárico. Nuestros resultados se suman a la evidencia de que la timulina juega un rol fisiológico relevante como mediadora de la influencia perinatal del timo sobre la maduración del eje reproductivo y sugieren que terapia génica con el gen sintético para la timulina puede constituir una estrategia terapéutica efectiva para el abordaje de déficits reproductivos asociados con disfunciones endocrinas del timo.Facultad de Ciencias Exacta

Regenerative Medicine for the Aging Brain

In the central nervous system, cholinergic and dopaminergic (DA) neurons are among the cells most susceptible to the deleterious effects of age. Thus, the basal forebrain cholinergic system is known to undergo moderate neurodegenerative changes during normal aging as well as severe atrophy in Alzheimer’s disease (AD). Parkinson’s disease (PD), a degeneration of nigro-striatal DA neurons is the most conspicuous reflection of the vulnerability of DA neurons to age. In this context, cell reprogramming offers novel therapeutic possibilities for the treatment of these devastating diseases. In effect, the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells demonstrated that adult mammalian cells can be reprogrammed to a pluripotent state by the overexpression of a few embryonic transcription factors (TF). This discovery fundamentally widened the research horizon in the fields of disease modeling and regenerative medicine. Although it is possible to re-differentiate iPSCs to specific somatic cell types, the tumorigenic potential of contaminating iPSCs that failed to differentiate, increases the risk for clinical application of somatic cells generated by this procedure. Therefore, reprogramming approaches that bypass the pluripotent stem cell state are being explored. A method called lineage reprogramming has been recently documented. It consists of the direct conversion of one adult cell type into another by transgenic expression of multiple lineage-specific TF or microRNAs. Another approach, termed direct reprogramming, features several advantages such as the use of universal TF system and the ability to generate a rejuvenated multipotent progenitor cell population, able to differentiate into specific cell types in response to a specific differentiation factors. These novel approaches offer a new promise for the treatment of pathologies associated with the loss of specific cell types as for instance, nigral DA neurons (in PD) or basal forebrain cholinergic neurons in the early stages of AD. The above topics are reviewed here.Fil: López León, Micaela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata ; ArgentinaFil: Reggiani, Paula Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata ; ArgentinaFil: Hereñú, Claudia Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata ; ArgentinaFil: Goya, Rodolfo Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata ; Argentin

Expresión génica simultánea y regulada del péptido tímico timulina y la green fluorescent protein utilizando un sistema adenoviral Tet-Off

Introducción: Una de las cuestiones clave en la implementación exitosa de terapias génicas radica en la capacidad de regular la expresión consistentemente. Con este propósito, y a fin de ampliar nuestros estudios en timulina y su papel en el desarrollo del eje hipotálamo-hipófiso-ovárico, construimos un sistema bivectorial regulable Tet-Off que expresa, simultáneamente, los transgenes para green fluorescent protein (GFP) y metFTS (análogo de timulina). Objetivos: Estudiar la funcionalidad y regulabilidad de nuestro sistema in vitro y evaluar la expresión in vivo mediante su inyección en músculos y ventrículos cerebrales de ratas. Materiales y métodos: El sistema experimental consta de dos adenovectores recombinantes (RAd): el RAd-(GFPTRE- FTS)bidir, unidad de respuesta en la cual la transcripción de los transgenes se encuentra controlada por un promotor bidireccional inducible por doxiciclina, y el RAd-tTA, unidad transactivadora que expresa la proteína regulatoria tTA. El sistema control no expresa metFTS. La expresión de GFP se determinó por microscopía y fluorometría. La timulina bioactiva fue medida por un bioensayo de rosetas. Resultados y conclusión: El sistema construido mostró ser activo tanto en experimentos in vitro, donde células CHOK1 incubadas con ambos RAds mostraron una eficiente expresión de los transgenes, pudiendo inhibirse por el agregado de doxiciclina al medio de cultivo; como in vivo, donde se dosaron niveles significativamente aumentados de timulina sérica y en LCR en ratas inyectadas intramuscular e intracerebrovectricularmente con ambos RAds, respectivamente. La utilización del gen de la GFP en nuestro sistema sirvió para comprobar, sencilla y rápidamente, la transcripción del gen de la timulina.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plat

Regenerative medicine for the aging brain

In the central nervous system, cholinergic and dopaminergic (DA) neurons are among the cells most susceptible to the deleterious effects of age. Thus, the basal forebrain cholinergic system is known to undergo moderate neurodegenerative changes during normal aging as well as severe atrophy in Alzheimer’s disease (AD). Parkinson’s disease (PD), a degeneration of nigro-striatal DA neurons is the most conspicuous reflection of the vulnerability of DA neurons to age. In this context, cell reprogramming offers novel therapeutic possibilities for the treatment of these devastating diseases. In effect, the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells demonstrated that adult mammalian cells can be reprogrammed to a pluripotent state by the overexpression of a few embryonic transcription factors (TF). This discovery fundamentally widened the research horizon in the fields of disease modeling and regenerative medicine. Although it is possible to re-differentiate iPSCs to specific somatic cell types, the tumorigenic potential of contaminating iPSCs that failed to differentiate, increases the risk for clinical application of somatic cells generated by this procedure. Therefore, reprogramming approaches that bypass the pluripotent stem cell state are being explored. A method called lineage reprogramming has been recently documented. It consists of the direct conversion of one adult cell type into another by transgenic expression of multiple lineage-specific TF or microRNAs. Another approach, termed direct reprogramming, features several advantages such as the use of universal TF system and the ability to generate a rejuvenated multipotent progenitor cell population, able to differentiate into specific cell types in response to a specific differentiation factors. These novel approaches offer a new promise for the treatment of pathologies associated with the loss of specific cell types as for instance, nigral DA neurons (in PD) or basal forebrain cholinergic neurons in the early stages of AD. The above topics are reviewed here.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plat

Cambios morfológicos en la población somatotropa inducidos por terapia génica neonatal con el vector RAd-FTS en ratones nude

Se ha detectado un eje bidireccional timo-pituitario, hallándose receptores de GH en las células epiteliales tímicas. La GH estimularía la secreción de timulina, mientras que los niveles bajos de timulina circulante en período prenatal inducirían hipopituitarismo. El presente estudio tiene por objetivo: implementar una terapia génica mediante el vector adenoviral RAd-FTS en ratones inmunodeficientes, con el fin de prevenir cambios en la población somatotropa

Transferência gênica assistida por campos magnéticos: Estudos em células gliais

Las nanopartículas magnéticas (MNP) complejadas con vectores génicos pueden, en presencia de un campo magnético externo, amplificar sustancialmente la eficiencia de la transferencia génica. Esta técnica, denominada magnetofección, es de gran interés en el campo de la terapia génica. En este estudio se caracterizó la mejora de transferencia génica en células gliales B92 utilizando complejos constituidos por diferentes proporciones de MNP asociadas a dos vectores adenovirales, a saber: los complejos entre las MNP denominadas PEI-Mag2 asociadas al adenovector RAd-GFP que expresa la proteína fluorescente verde GFP o al adenovector RAd-DsRed que expresa la proteína fluorescente roja DsRed2. Se demostró que para ambos vectores, a medida que la relación MNP/partícula viral física (PVF) va aumentando, la amplificación de la transfección también aumenta hasta que se llega a una relación MNP/PVF a partir de la cual el factor de amplificación alcanza un plateau. Se determinó que para el complejo PEI-Mag2/RAd-GFP la relación a partir de la cual se alcanza el plateau es de aproximadamente 0,5 fg Fe/PVF mientras que para el complejo PEI-Mag2/RAd-DsRed, esta relación corresponde a aproximadamente 71 fg Fe/PVF. Se concluye que los dos complejos magnéticos estudiados representan promisorias herramientas para mejorar la eficiencia en la terapia génica en células cerebrales.Fil: Pardo, Joaquin. Consejo Nacional de Invest.cientif.y Tecnicas. Centro Cientifico Tecnol.conicet - la Plata. Instituto de Invest.bioquimicas de la Plata;Fil: Sosa, Yolanda Elena. Consejo Nacional de Invest.cientif.y Tecnicas. Centro Cientifico Tecnol.conicet - la Plata. Instituto de Invest.bioquimicas de la Plata;Fil: Reggiani, Paula Cecilia. Consejo Nacional de Invest.cientif.y Tecnicas. Centro Cientifico Tecnol.conicet - la Plata. Instituto de Invest.bioquimicas de la Plata;Fil: Arciniegas, M. I.. Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Exactas; Argentina;Fil: Sanchez, Francisco Homero. Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Exactas; Argentina;Fil: Goya, Rodolfo Gustavo. Consejo Nacional de Invest.cientif.y Tecnicas. Centro Cientifico Tecnol.conicet - la Plata. Instituto de Invest.bioquimicas de la Plata

Modulation of microglia and presynaptic protein expression after mesenchymal stem cells treatment in a rat model of Alzheimer's disease

Objectives: Sporadic Alzheimer´s disease (sAD) is the most prevalent neurodegenerative pathology with no effective therapy until date. This disease prompts hippocampal degeneration, which in turn affects multiple cognitive domains and daily-life activities. In this study, we hypothesized that long-lasting therapy with human mesenchymal stem cells (MSC) would have a restorative effect on the behavioral alterations and cognitive decline characteristic of sAD, as they have shown neurogenic and immunomodulatory activities.Methods: We treated intracerebroventricular streptozotocin-injected (icv-STZ) rats, a commonly used animal model of sAD, with 1 × 106 MSC in a tail vein (24 days post-icv-SZT), every 18 days. At the end of the study (3 months post-icv-STZ), we evaluated their cognitive function together with morphological and biochemical changes in the hippocampus.Results: We observed cognitive deficits, microgliosis, and decreased on presynaptic proteins (SYT1, SYT2, and SYP) and GABAergic neuron marker (GAD65) in the brains of icv-STZ rats. Interestingly, MSC therapy significantly improved its spatial memory and decreased the anxiety, ameliorated microglial activation, and enhanced SYT1, SYP, and GAD65 levels. Additionally, we found significant negative correlation between the hippocampal reactive microglia with the expression of SYT1, SYT2, SYP, and GAD67 proteins, suggesting the modulation of synaptic transmission by glial cells.Conclusion: These findings, showing that intravenous injection of human MSCs restores behavioral and hippocampal alterations in experimental sAD, support the potential use of MSC therapy for the treatment of neurodegenerative diseases.Fil: Zappa Villar, María Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: López Hanotte, Juliette. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Pardo, Joaquin. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Morel, Gustavo Ramón. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: García, Mariana Gabriela. Universidad Austral. Facultad de Ciencias Biomédicas. Laboratorio de Terapia Genética; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Reggiani, Paula Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; Argentin

Modelo experimental de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratas inducido por la inyección intracerebroventricular de estreptozotocina

La enfermedad de Alzheimer esporádica (EAE) es la patología neurodegenerativa más frecuente, se acompaña de un progresivo déficit de memoria, deterioro cognitivo y cambios de personalidad. Asimismo, se caracteriza por la formación de placas neuríticas y ovillos neurofibrilares intraneuronales, degeneración neuronal y alteración del metabolismo energético cerebral, La combinación de un diagnóstico temprano y una terapia efectiva resulta imprescindible para frenar el progresivo aumento de casos dado por la mayor expectativa de vida. Para contribuir a superar esta problemática numerosos modelos animales in vitro e in vivo están siendo estudiados. Un modelo animal propuesto para el estudio de la EAE consiste en la administración intracerebroventricular (icv) de una droga diabetogénica, la estreptozotocina (STZ). En este contexto, nuestro objetivo general es el desarrollo de estrategias terapéuticas de avanzada que nos permitan prevenir y/o subsanar los cambios degenerativos que ocurren en el cerebro con Alzheimer experimental.Facultad de Ciencias Médica

Modelo experimental de enfermedad de Alzheimer esporádica en ratas inducido por la inyección intracerebroventricular de estreptozotocina

La enfermedad de Alzheimer esporádica (EAE) es la patología neurodegenerativa más frecuente, se acompaña de un progresivo déficit de memoria, deterioro cognitivo y cambios de personalidad. Asimismo, se caracteriza por la formación de placas neuríticas y ovillos neurofibrilares intraneuronales, degeneración neuronal y alteración del metabolismo energético cerebral, La combinación de un diagnóstico temprano y una terapia efectiva resulta imprescindible para frenar el progresivo aumento de casos dado por la mayor expectativa de vida. Para contribuir a superar esta problemática numerosos modelos animales in vitro e in vivo están siendo estudiados. Un modelo animal propuesto para el estudio de la EAE consiste en la administración intracerebroventricular (icv) de una droga diabetogénica, la estreptozotocina (STZ). En este contexto, nuestro objetivo general es el desarrollo de estrategias terapéuticas de avanzada que nos permitan prevenir y/o subsanar los cambios degenerativos que ocurren en el cerebro con Alzheimer experimental.Facultad de Ciencias Médica