Recombinant expression and activity of cationic antimicrobial peptides

Tese de doutoramento em Engenharia Química e BiológicaIn the past 60 years, antibiotics have been critical in the fight against infectious disease caused by microorganisms. The increasing bacterial resistance to antibiotics is a serious public health problem. Much research has been dedicated to the development of new classes of antibiotics to overcome this situation. Antimicrobial peptides (AMPs) are generally defined as peptides of less than 50 amino acid residues, bearing positive charge due to multiple lysine and arginine residues and with 50% or more of hydrophobic residues. AMPs have aroused great interest due to their broad spectrum of antimicrobial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria, fungi, protozoa and some viruses and their ability to overcome bacterial resistance. The major problem for the chemical production of AMPs is the elevated cost. Recombinant expression techniques for large-scale production of these peptides would represent an economically more viable approach. Therefore, strategies to produce AMPs at affordable cost are much required for the exploitation of their therapeutic potential. This was one of the main objectives of this thesis: the recombinant production and purification of two AMPs (Magainin-2 and LL37) using a family 3 carbohydrate-binding module (CBM3) from Clostridium thermocellum as fusion partner. The use of the CBM3 could reduce the purification costs using cellulose as affinity matrix. The other purpose was to evaluate the biological activities of recombinant LL37 and its therapeutic effects in mice models of wound healing, after topical application. The general introduction of this thesis is presented in chapter 1 and includes a bibliographic revision of: 1) the antimicrobial peptides; 2) a brief revision of carbohydrate-binding modules and their potential as fusion partners; 3) The frog AMP magainin-2; 4) the human AMP LL37; and 5) the wound healing process. In chapter 2, the expression of the AMP magainin-2 (MAG2) is described. MAG2 was fused to the N- and C-termini of the CBM3 containing a linker sequence (LK-CBM3), and formic acid recognition site between the two modules, for chemical cleavage. The recombinant protein MAG2- LK-CBM3 was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and LK-CBM3-MAG2 in E. coli M15 (pREP4). The N-terminal MAG2 from the first construction was successfully cleaved and purified from the fusion partner LK-CBM3. However, the peptide showed no antibacterial activity against E. coli K12. The negatively charged C-terminal aspartic acid left from the acid cleavage may be the cause for the absence of antimicrobial activity. The expression of C-terminal MAG2 from the second construct was not successful. The peptide may have suffered proteolysis during the recombinant expression. Chapter 3 describes the expression of the human LL37. The protein was also cloned to the N- and C-termini of LK-CBM3 and a formic acid recognition site was introduced between the two modules, allowing the isolation of LL37 after chemical cleavage. The recombinant proteins were expressed in E. coli BL21 (DE3) and solubilized with Triton X-100. The purification was achieved using cellulose CF11 fibers, taking advantage of the CBM3 specific affinity for cellulose; after hydrolysis with formic acid, LL37 was further purified by reverse-phase HPLC. Only the recombinant LL37 obtained from the C-terminally fused protein (LK-CBM3-LL37) showed antibacterial activity against E. coli K12, with a MIC of 180 !g/ml. The biological activity of the recombinant P-LL37 with a N-terminus proline resulting from the chemical cleavage was confirmed in chapter 4. Also, wound healing experiments were performed in dexamethasone-treated mice to study the effect of LL37 on angiogenesis and wound regeneration. P-LL37 neutralized the activation of macrophages by lipopolysaccharide (LPS) and induced proliferation, migration and tubule-like structures formation by endothelial cells. The topical application of synthetic or recombinant LL37 on mice wounds increased vascularization and re-epithelialization, accelerating the healing process. After the confirmation that P-LL37 preserves its biological activities and accelerated wound healing, we tested the adjuvant activity of CRAMP and P-LL37 using Candida albicans protease Sap2 as antigen. We also evaluated the wound healing effects of topically added LL37 on diabetic mice. These experiments are described in the chapter 5. The administration of CRAMP or P-LL37 with Sap2 did not increase the production of Sap2-specific serum IgG antibody, i.e. no adjuvant activity was detected for both peptides. The topical application of LL37 on diabetic mice wounds did not accelerate the healing process very significantly. However, histological analysis after 13 days showed encouraging results. In fact, they revealed that the wounds treated with LL37 were smaller and presented several new skin annexa that could originate new hair, which may translate a more effective tissue regeneration.Nos últimos 60 anos, os antibióticos têm sido cruciais no combate contra doenças infecciosas causadas por microrganismos. A resistência crescente destes microrganismos aos antibióticos tornou-se um sério problema de saúde pública. Para combater esta situação, muita investigação tem sido desenvolvida para produzir novos tipos de antibióticos. Os péptidos antimicrobianos (Antimicrobial Peptides - AMPs) são geralmente definidos como péptidos com menos de 50 aminoácidos, com carga positiva devido à presença de múltiplas lisinas e argininas e com mais de 50% de aminoácidos hidrofóbicos. Os AMPS têm gerado grande interesse pelo facto de apresentarem um largo espectro de atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos, protozoários e pela capacidade de ultrapassarem os mecanismos de resistência a antibióticos. A síntese química para a produção de AMPs apresenta custos elevados; alternativamente, as técnicas de expressão recombinante podem ser mais viáveis, economicamente, para uma produção em larga escala, permitindo assim a introdução desta nova geração de antibióticos na prática clínica. Este foi então um dos principais objectivos desta tese: a produção recombinante de dois péptidos antimicrobianos (Magainina-2 e LL37) usando como proteína de fusão um domínio de ligação a carbohidratos de família 3 (Carbohydrate-binding module - CBM3), proveniente de Clostridium thermocellum. A utilização deste CBM3 poderá reduzir os custos do processo de purificação usando celulose com matriz de afinidade. O outro objectivo consistiu na avaliação das propriedades biológicas do péptido recombinante LL37 e o seu potencial terapêutico na cicatrização de feridas após aplicação tópica. A introdução geral desta tese está apresentada no capítulo 1 e inclui uma revisão bibliográfica de: 1) péptidos antimicrobianos; 2) uma breve revisão dos CBMs e do seu potencial como proteínas de fusão; 3) o AMP de rã magainina-2; 4) o AMP humano LL37; e 5) o processo de cicatrização/regeneração de feridas. O capítulo 2 descreve a clonagem do AMP magainina-2 (MAG2) nos lados N- e C-terminal do CBM3, incluindo o espaçador (LK-CBM3). Foi ainda introduzido na construção, entre os dois módulos, um local de reconhecimento para hidrólise química com ácido fórmico. A proteína recombinante MAG2-LK-CBM3 foi expressa em Escherichia coli BL21 (DE3) e a proteína LKCBM3- MAG2 em E. coli M15 (pREP4). A MAG2 no N-terminal da primeira construção foi expressa, clivada e purificada com sucesso. No entanto, o péptido não apresentou atividade antimicrobiana contra E. coli K12. A presença de um resíduo carregado negativamente (aspartato) no lado C-terminal da MAG2, poderá causar a ausência de atividade. Este resíduo não está presente no péptido nativo, resultando da introdução da sequência aspartato-prolina na construção, para permitir a hidrólise ácida. A expressão da MAG2 no lado C-terminal do LK-CBM3 não teve sucesso. O péptido poderá ter sofrido proteólise durante a expressão em E. coli. No capítulo 3 descreve-se a expressão do AMP humano LL37. Este foi também clonado nos lados N- e C-terminal do LK-CBM3. De igual modo, introduziu-se o local para hidrólise química com ácido fórmico entre os dois módulos, para permitir a separação da LL37. As duas proteínas recombinantes foram expressas em E. coli BL21 (DE3) e solubilizadas com Triton X-100. A purificação foi efectuada usando fibras de celulose CF11, beneficiando da afinidade específica do CBM3 para este material; após hidrólise com ácido fórmico, LL37 foi purificada por RP-HPLC. A LL37 proveniente do C-terminal da proteína de fusão (LK-CBM3-LL37) foi a única a apresentar atividade antimicrobiana contra E. coli K12, com uma MIC de 180 !g/ml. As atividades biológicas do péptido recombinante P-LL37, com uma prolina no lado N-terminal resultante da hidrólise química, foram confirmadas no capítulo 4. Além disso, o efeito da LL37 na angiogénese e cicatrização de feridas foi avaliada em ratinhos tratados com dexametasona. PLL37 neutralizou a ativação de macrófagos por lipopolissacáridos e induziu a proliferação, migração e formação de vasos em células endoteliais. A aplicação tópica de LL37 sintética ou recombinante nas feridas de ratinhos aumentou a vascularização e re-epitelialização, acelerando o processo de cicatrização. Após ter sido confirmado que o péptido recombinante P-LL37 conserva as suas atividades biológicas e acelera o processo de cicatrização, foi testado o efeito adjuvante dos péptidos CRAMP e P-LL37 para efeitos de vacinação, usando a protease Sap2 de Candida albicans como antigénio. Além disso, foi avaliado o efeito da aplicação tópica de LL37 nas feridas de ratinhos diabéticos. Estas experiências estão descritas no capítulo 5. A administração de CRAMP ou PLL37 juntamente com Sap2 não aumentou a produção de anticorpos específicos anti-Sap2. Isto é, não foi detectada atividade adjuvante para nenhum dos dois péptidos. A aplicação tópica de LL37 nas feridas de ratinhos diabéticos não acelerou o processo de cicatrização de maneira muito significativa. No entanto, as análises histológicas das feridas após 13 dias revelaram dados encorajadores. De facto, estas análises mostraram que as feridas tratadas com LL37 eram menores e apresentavam vários anexos de pele que poderão originar novos pêlos, traduzindo uma mais eficiente regeneração dos tecidos

LL37, a human antimicrobial peptide with immunomodulatory properties

Cationic antimicrobial peptides (AMPs) represent the first line of defense against many invading pathogens. These small amphipathic peptides are part of the innate immune system and have a broad-spectrum activity against bacteria, fungi and viruses. In mammals, at least two distinct groups of AMPs are found. Defensins are the more representatives and cathelicidins form the second group. The hCAP18/LL37 is the only known human cathelicidin. The antimicrobial peptide is referred to as LL37, since it has a 37 amino acids sequence starting with two leucines. It is a 4.5 kDa, cationic (+6), amphipathic -helical peptide, with a broad spectrum of antimicrobial activity. Besides its antimicrobial properties LL37 plays a central role in innate immune responses and inflammation. It has been identified as a potent chemoattractant for mast cells, monocytes, T lymphocytes and neutrophils using formyl-peptide receptorlike 1 (FPRL1). LL37 also promotes wound healing, angiogenesis and arteriogenesis and acts as immune adjuvant.y FEDER funds through the Programa Operacional Factores de Competitividade – COMPETE and by national funds through the project PTDC/EDB/EBI/112170/2009 from the Fundação para a Ciência e Tecn

Escherichia coli expression and purification of LL37 fused to a family III carbohydrate-binding module from Clostridium thermocellum

The cathelicidin derived human peptide LL37 has a broad spectrum of antimicrobial and immunomodulatory activities. The large variety of biological activities makes LL37 a very promising candidate for clinical applications. The production of biologically active LL37 in large amounts with reduced costs can only be achieved using recombinant techniques. In this work, LL37 has been cloned to the N- and C-termini of a family III carbohydrate-binding module fused to the linker sequence (LK-CBM3) from Clostridium thermocellum; both constructions (LL37-LK-CBM3 and LK-CBM3-LL37) were cloned into the pET-21a vector. A formic acid recognition site was introduced between the two modules, allowing the isolation of LL37 after chemical cleavage. The recombinant proteins were expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and solubilized with Triton X-100. The purification was achieved using cellulose CF11 fibers, taking advantage of the CBM3 specific affinity for cellulose; after hydrolysis with formic acid, LL37 was further purified by reverse-phase HPLC, as confirmed by MALDI-TOF mass spectrometry. The production and purification methodology developed in this work compares advantageously to other protocols previously described, having fewer purification steps. Only the recombinant LL37 obtained from the C-terminally fused protein (LK-CBM3-LL37) showed antibacterial activity against E. coli K12, with a MIC of 180 μg/ml.University of Porto. Institute of Molecular Pathology and Immunology. Proteomics Unit (IPATIMUP)Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - SFRH/BD/27404/200

New hydrogel obtained by chitosan and dextrin-VA co-polymerization

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Textile depilling : superior finishing using cellulose-binding domains with residual enzymatic activity

Textile fabric depilling is an important industrial application of cellulases. The depilling effect and achievement of desirable touch properties are among the applications sought by users. This process, although effective, is associated with significant tensile strength loss. The depilling mechanism is still a subject of controversy. In this work, we introduce a new perspective in understanding of the depilling mechanism, specifically we consider the contribution of interfacial properties. Cellulose Binding Domains (CBDs) obtained by ultrafiltration after digestion with a protease, were used in depilling experiments. Compared with cellulose, the performance of CBDs was very positive. In fact, when using CBD with residual hydrolytic activity, it was possible to achieve superior depilling treatments

Textile depilling : use of enzymes and cellulose binding domains

Textile fabrics biopolishing is one of the most important industrial application of cellulases. These are widely used to remove fibrils and fuzz fibres from cotton fabrics, or to produce the “stone-washed” look of denim garments. The depilling effect and the achievement of desirable touch properties are among the applications sought by the users. This process, although effective, is associated to a significant tensile strength loss. The biopolishing mechanism is still the subject of controversy. Interfacial properties are not considered in the removing of the pills. It is believed that the hydrolytic activity of cellulases is the only responsible process for the biopolishing. In this work, we aim at introducing a new perspective in the understanding of the biopolishing mechanism, specifically we consider the contribution of interfacial properties. Cellulose Binding Domains (CBD) with a much lower hydrolytic activity than cellulases were produced in laboratory by ultrafiltration after digestion with a protease. Some were purified by ion-exchange chromatography to reduce even more catalytic activity. Cotton fabrics were treated with different cellulases and the CBD. Soluble sugars, tensile strength loss and pilling degree were measured to evaluate the effect of enzymes and CBD, to understand the tensile strength loss and to conclude if interfacial properties are important in the biopolishing process

RESSIGNIFICANDO O ENSINO DE GEOGRAFIA ATRAVÉS DE PRÁTICAS DE SOLO

Today in undergraduate courses, in which individuals are prepared for the exercise of teachers, much is discussed about the theory in the classroom, however, it leaves the practice aside, making the future teachers mostly have difficulty in applying methodologies. different ways to work in the classroom with students. Thus, through the Pedagogical Residency Program in Geography, it was possible to apply soil experiments, which appear as a way to show didactically various subjects involving the environment, as in the case of erosion, which will be highlighted in this article. In this way, the practices carried out served to facilitate the learning of students of elementary school II, from the 8th grade class of the municipal school Judith Barbosa de Paula Rêgo, located in the municipality of Queimadas - PB. Therefore, the objective of this work is to analyze the importance of soil practices in the teaching and learning process of elementary school students, based on the activities developed by the geographic pedagogical residency program. The collection of information was carried out through the survey and analysis of ideas brought by different references, in addition to the application of four questionnaires for students to answer before and after conducting soil experiments, in which an analysis of students' responses was made.Hoy en los cursos de pregrado, en los que las personas están preparadas para el ejercicio de los docentes, se discute mucho sobre la teoría en el aula, sin embargo, deja a un lado la práctica, lo que hace que los futuros docentes tengan dificultades para aplicar metodologías. diferentes formas de trabajar en el aula con los alumnos. Por lo tanto, a través del Programa de Residencia Pedagógica en Geografía, fue posible aplicar experimentos de suelo, que aparecen como una forma de mostrar didácticamente varios temas relacionados con el medio ambiente, como en el caso de la erosión, que se destacará en este artículo. De esta forma, las prácticas realizadas sirvieron para facilitar el aprendizaje de los alumnos de la escuela primaria II, de la clase de 8º grado de la escuela municipal Judith Barbosa de Paula Rêgo, ubicada en el municipio de Queimadas - PB. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es analizar la importancia de las prácticas de suelo en el proceso de enseñanza-aprendizaje de los estudiantes de primaria, en base a las actividades desarrolladas por el programa de residencia pedagógica geográfica. La recopilación de información se realizó a través de la encuesta y el análisis de ideas aportadas por diferentes referencias, además de la aplicación de cuatro cuestionarios para que los estudiantes respondan antes y después de realizar experimentos con el suelo, en los que se realizó un análisis de las respuestas de los estudiantes.Hoje nos cursos de licenciatura, no qual preparam-se indivíduos para o exercício de professores, muito se discute a teoria na sala de aula, porém, deixa a prática de lado, fazendo com que os futuros professores tenham em sua maioria dificuldade em aplicar metodologias diferentes para se trabalhar em sala de aula com os alunos. Sendo assim, através do Programa Residência Pedagógica de Geografia, foi possível aplicar experimentos de solos, que surgem como uma maneira de mostrar didaticamente diversos assuntos envolvendo o meio ambiente, como no caso da erosão, que será destaque neste artigo. Dessa forma as práticas realizadas serviram para facilitar o aprendizado dos alunos do ensino fundamental II, da turma do 8º ano da escola municipal Judith Barbosa de Paula Rêgo, localizada no município de Queimadas – PB. Logo o objetivo deste trabalho é analisar a importância das práticas de solos no processo de ensino aprendizagem dos alunos do ensino fundamental II, a partir das atividades desenvolvidas pelo programa residência pedagógica de geografia. A coleta de informações foi realizada através do levantamento e análise de ideias trazidas por diferentes referências, além da aplicação de quatro questionários para os alunos responderem antes e depois da realização dos experimentos de solos, no qual foi feita uma análise das respostas dos alunos

Turbulent velocity and temperature probability density functions in the Amazonian surface boudary layer

We present a statistical model for the distribution of increments of wind velocity and temperature of turbulence data measured in the atmospheric surface layer above the Amazonian forest, on a micrometeorological tower in Rebio-Jaru Reserve (10°04' S; 61°56' W) during LBA (Large Scale Biosphere Atmosphere Experiment in Amazonia) wet season campaign. The data were measured using 3D Campbell sonic anemometer and a Campbell fast response thermometer located at a height of 66 m (the forest canopy has a mean height of 35 m; but some of the higher tree branches may reach the height of 45 m), at a sampling rate of 60 Hz. The goal of this investigation is to detect noextensivity properties of the turbulent field in such a peculiar environment. To do this we calculate the probability density function (PDF) for wind velocity increments Vr(x) = V(x) - V(x+r) (and temperature increments) at different length scales r. The preliminary results show some evidence that the nonextensive thermostatistics modelling proposed by Tsallis (1988) provides a new and simple framework for explaining the statistical behavior of fully developed mechanical turbulence. We also investigate the relationship between intermittency and nonextensivity using a single parameter q, from Tsallis thermostatistics. The results of the wind velocity turbulent signals measured at the level of 66m show a very good agreement with the Tsallis model but the temperature signals show some discrepancy with respect to the proposed model. Physical discussions are proposed to explain our results.Neste trabalho é apresentado um modelo estatístico para a distribuição de incrementos de velocidade de vento e temperatura dos dados de turbulência medidos na camada limite superficial atmosférica sobre a floresta amazônia, em uma torre de micrometeorological instalada na Reserva Rebio-Jaru (10°04' S; 61°56' W) durante o LBA (Large Scale Biosphere Atmosphere Experiment in Amazonia), campanha da estação úmida. Os dados foram medidos usando um anemômetro sônico 3D Campbell e um termômetro Campbell de resposta rápida localizados a uma altura de 66 m (a copa da floresta tem uma altura média de 35 m, mas algumas árvores podem alcançar a altura de 45 m), amostrados a uma taxa de 60 Hz. O objetivo desta investigação é detectar propriedades não extensivas do campo turbulento em um ambiente peculiar. Para isto, foi calculada a função de densidade de probabilidade (PDF) para os incrementos da velocidade de vento Vr(x) = V(x) - V(x+r) (e incrementos de temperatura) em diferentes escalas de comprimento r. Os resultados preliminares mostram alguma evidência de que o modelo termoestatístico não extensivo proposto por Tsallis (1988) fornece uma teoria simples para explicar o comportamento estatístico da turbulência desenvolvida. Também foi investigada a relação entre intermitência e não extensividade usando um parâmetro simples q, a partir da termoestatística de Tsallis. Os resultados para os sinais turbulentos de velocidade do vento medidos ao nível de 66 m concordaram bem com o modelo de Tsallis, mas para a temperatura mostram alguma discrepância com relação ao modelo proposto. São apresentadas discussões físicas para explicar os resultados

AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS DE SUSTENTABILIDADE EM AGROECOSSISTEMAS NO MUNICÍPIO DE MASSARANDUBA, AGRESTE DA PARAÍBA

A agricultura familiar fornece a maior parte dos alimentos consumidos no Brasil, as unidades de produção encontram-se diversificadas em relação ao nível de tecnologia empregado, aos gêneros agrícolas cultivados, extensão das propriedades e perfil da mão de obra empregada na manutenção das atividades de manejo dos agroecossistemas. A região Nordeste do Brasil destaca-se por deter o maior número de estabelecimentos de produção de base familiar, dentre seus noves estados, destaca-se o estado da Paraíba, como um dos mais representativos na produção. Diante dessa realidade, surge a necessidade de estudos que evidenciem as características sociais, econômicas e ambientais desses agroecossistemas, dando ênfase no manejo e manutenção dos recursos naturais disponíveis nestes ambientes, apresentando assim, aspectos da sustentabilidade. Nesse contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar os parâmetros de sustentabilidade de dois agroecossistemas de base familiar situados no município de Massaranduba, Agreste da Paraíba, visando estabelecer um comparativo entre seus sistemas de manejo. Para o desenvolvimento da pesquisa utilizou-se o método MESMIS, que tem como característica o uso de uma série de indicadores de sustentabilidade, distribuídos nos aspectos sociais, econômicos e ambientais para avaliar a sustentabilidade em ambientes agrícolas. Os resultados mostram que o agroecossistema 1, onde se desenvolvem cultivos diversificados e em sistema consorciado sob condição de sequeiro, apresenta o maior número de pontos críticos no sistema de manejo. O agroecossistema 2 é especializado em olericultura orgânica em condição irrigada e apresentou o menor número de pontos críticos em seu manejo, evidenciando assim maior nível de sustentabilidade

Sustentabilidade de agroecossistemas da agricultura familiar no distrito de Lagoa de Jucá, Alcantil - PB

Este trabalho tem como objetivo analisar a sustentabilidade na agricultura familiar por meio da proposição e avaliação de indicadores envolvendo as dimensões econômica, social e ambiental. O método utilizado foi o MESMIS (Marco de Evolución de Sistemas de Manejo de Sustentabilidad), em que o modelo seguido foi o de avaliação proposto por Verona (2008), utilizado e adaptado por Gallo et al. (2014). A abordagem do presente estudo está classificada como qualitativa. Quanto aos objetivos, a pesquisa é de caráter exploratório e descritivo, conduzida a partir de pesquisa teórica e estudos de campo no período entre Março e Junho de 2021, em seis agroecossistemas da agricultura familiar no Distrito de Lagoa de Jucá, localizado no município de Alcantil, estado da Paraíba. Como resultados, constatou-se que os agroecossistemas em estudo não apresentam sustentabilidade recomendada, já que possuem problemas no tocante aos indicadores econômicos, ambientais e sociais. A dificuldade maior foi encontrada na propriedade da Família 6, onde o somatório chegou somente a 30 pontos, considerado um agroecossistema com elevado grau de impacto, isto é, muitos pontos fracos encontrados