Contribuciones científicas a la influencia que tienen los factores genéticos en la susceptibilidad a las EET en pequeños rumiantes

Las encefalopatías espongiformes trasmisibles afectan tanto a la especie humana como a los animales, y se caracterizan por un largo período de incubación y lesiones neurodegenerativas que conducen a la muerte del individuo. Estas enfermedades están causadas por el acumulo de una proteína anómala (PrPSc), sobre todo en el SNC, que se genera mediante la conversión conformacional de una glicoproteína de superficie celular (PrPC) que está presente en el hospedador de forma natural. La PrPSc es capaz de inducir la transformación de la PrPC en PrPSc, y esta conversión depende de la cadena de aminoácidos que componen la proteína, y por ello de la secuencia nucleotídica del gen que la codifica, el PRNP. De esta manera, la presencia de determinados polimorfismos en el marco de lectura abierto de este gen puede dar lugar a un cambio aminoacídico en dominios críticos de la PrPC, pudiendo influir en la conversión a la PrPSc. Sin embargo, no todos los animales con el mismo genotipo en el gen PRNP son igualmente susceptibles o desarrollan la patología de la misma manera, lo que puede sugerir la participación de otros genes. Debido a la demostrada influencia de los factores genéticos sobre las EET, en esta tesis se realizaron tres estudios con el objetivo común de contribuir a un mejorconocimiento de los aspectos genéticos en las encefalopatías espongiformes transmisibles en rumiantes y por lo tanto de su patogenia. La influencia del gen PRNP se ha estudiado ampliamente en la especie ovina, pero tras el diagnóstico de una cabra infectada de forma natural con EEB, se implementaron los estudios en la especie caprina. De esta manera, un gran número de cabras europeas fueron genotipadas y se encontraron determinados polimorfismos que podrían ser útiles a la hora de elaborar un programa de selección genética similar al del ovino. El análisis de este gen ha dado lugar a la descripción de más de 40 mutaciones que suponen un cambio aminoacídico y de 17 mutaciones silentes en esta especie. Además, diversos estudios realizados en cabras infectadas de forma natural y experimentalmente con el agente del scrapie han demostrado la capacidad de determinados polimorfismos para modular la susceptibilidad o resistencia de sus portadores a padecer la enfermedad. En el caso de la EEB, pocos estudios han abordado la resistencia genética en cabras. Algunos estudios de transmisión oral de EEB a cabras portadoras de las mutaciones R211Q y Q222K, revelan que mientras el primer polimorfismo extiende el período de incubación, solo el alelo K222 parece tener un efecto protector. Este hecho convierte al polimorfismo Q222K en uno de los principales candidatos para establecer un programa de mejora genética para erradicar las EET en cabras. Por ello, se realizó un primer estudio, en el cual se inoculó el agente de la EEB bovina por vía intracerebral a cabras portadoras de diferentes mutaciones en el codón 222, homocigotas glutamina y homocigotas lisina y dos animales inoculados con EEB caprina (segundo pase en cabra), uno Q222Q y otro heterocigoto Q222K, también portadores del polimorfismo G127S. Independientemente del genotipo en el codón 222, la presencia de PrPSc en el sistema nervioso central fue similar en todos los animales, a excepción del inoculado con EEB bovina de genotipo K222K, que no presentó PrPSc en corteza frontal y ganglios basales mediante ELISA y casi insignificante positividad mediante IHQ, lo que sugiere que en este animal el punto de inoculación intracerebral fue distinto al de los otros caprinos. En el sistema linforreticular, el genotipo de los animales tampoco influyó en el depósito de PrPSc, que no se detectó únicamente en un caprino inoculado con EEB caprina. En sistema nervioso periférico, el prion se identificó en las neuronas del plexo mioentérico del intestino así como en el músculo tríceps braquial, en husos neuromusculares y fascículos nerviosos, del animal Q222K/G127S inoculado con EEB caprina. En cuanto a la caracterización del agente causal, la técnica de inmunohistoquímica reveló que posee características similares a las del agente de la EEB bovina, caracterizado por un punteado muy leve, fino y difuso intraneuronal con el anticuerpo P4 y una señal más baja con el mismo anticuerpo, mediante la técnica de Western Blot. Con el objetivo de conocer la frecuencia alélica de los polimorfismos resistentes en la población de cabras autóctonas españolas, se realizó un estudio de genotipado con muestras de 1721 animales de la raza Moncaina. Se observó una alta variabilidad genética y se identificó la presencia de algunos polimorfismos descritos por otros estudios como resistentes a las EET, como los polimorfismos R211Q y Q222K. Sin embargo, las frecuencias de estos haplotipos fueron relativamente bajas, lo que demostró la necesidad de mantener y reproducir los animales para aumentar la frecuencia y consecuente resistencia genética de los rebaños. En la mayor parte de las especies afectadas por las enfermedades priónicas, la susceptibilidad y la patogénesis son moduladas por el gen PRNP. En los animales de las especies ovina y caprina, el control de la enfermedad está ligado de manera compleja a genotipos específicos. Sin embargo, no todos los animales con el mismo genotipo en el gen PRNP son igualmente susceptibles o desarrollan la patología de la misma manera, lo que puede sugerir la participación de otros genes. Por este motivo, en el último estudio se realizó un análisis de los polimorfismos identificados en el gen SPRN en ciervos de la especie ciervo rojo (cervus elaphus) y cabras de la Raza Alpina, y en la región promotora del gen PRNP en muestras de ciervos. No se conoce bien la influencia de los polimorfismos en el gen SPRN en ciervos y de los datos que se desprenden de este estudio se observó una alta variabilidad genética, con la presencia de tres polimorfismos con cambio aminoacídico y siete mutaciones silentes en el marco de lectura abierto y tres mutaciones en el fragmento 3`UTR. En los caprinos se observó cuatro mutaciones silentes en el fragmento ORF y dos en el 3`UTR, incluyendo un polimorfismo indel (602_606ins.CTCCC) anteriormente relacionado con la susceptibilidad al scrapie clásico. En la región promotora del gen PRNP en ciervos también se observó una gran variedad de polimorfismos, nueve de un solo nucleótido y tres de inserción/deleción. Los tres estudios desarrollados en la tesis doctoral cumplieron con los objetivos propuestos, contribuyendo ampliar el conocimiento de los factores genéticos que influyen en las encefalopatías espongiformes transmisibles que afectan a los rumiantes.<br /

BIOPSIA RETAL EM OVINOS E CAPRINOS PARA MONITORAMENTO E DIAGNÓSTICO ANTE MORTEM DE SCRAPIE: NÚMERO DE FOLÍCULOS LINFOIDES EM DUAS COLHEITAS CONSECUTIVAS

Este estudo teve por objetivo avaliar a quantidade de tecido linfoide associado à mucosa retal obtido pela técnica de biopsia retal e a possibilidade de se realizarem duas biopsias consecutivas, em diferentes intervalos de tempo, para monitoramento e diagnóstico ante mortem de scrapie. Para isso, foram estudados 56 ovinos e 32 caprinos. No dia zero, todos os animais foram submetidos a biopsias e, posteriormente, divididos em grupos. As colheitas foram realizadas aos dias sete, 14, 21 e 28 para os ovinos, e 14, 21 e 28 para os caprinos. De 176 amostras, 151 (85,8%) foram colhidas da mucosa retal e, em 25 (14,2%), houve falha de colheita. Considerando-se as amostras colhidas da mucosa retal (151), em 56,86% das amostras de ovinos e 51,61% de caprinos, no dia 0, havia ?3 folículos linfoides (FL). Na segunda colheita, 58,97% das amostras de ovinos possuíam ?3 FL e, para caprinos, 33,33%. Na comparação do número de FL entre a primeira e a segunda colheitas houve diferença (p<0,05) entre os dias 0 e 7 (com mais FL no dia 0) e 0 e 28 (com mais FL no dia 28) para ovinos, e entre os dias 0 e 28 (com mais FL no dia 0) para caprinos. Comparando-se as duas espécies, não houve diferença no número de FL nos dias 0, 14 e 21. No dia 28, a proporção de amostras com ?3 FL foi maior nos ovinos (p<0,05) que nos caprinos. Concluiu-se que a técnica de biopsia retal compreende método útil para a obtenção de tecido linfoide associado à mucosa para avaliação imuno-histoquímica voltada ao monitoramento e diagnóstico ante mortem de scrapie em ovinos e caprinos. Porém, a colheita inadequada e a obtenção de número insuficiente de FL podem ocasionar a necessidade de repetição da técnica, o que pode ser realizado após 14 dias da primeira colheita, sem redução no número de FL. Palavras-chave: doença priônica; encefalopatias espongiformes transmissíveis; imuno-histoquímica; pequenos ruminantes; tecido linfoide associado a mucosa retoanal

Comparative assessment of skin reactivity to thimerosal- or phenol-preserved Imunoleish® antigen in dogs with suspected American Tegumentary Leishmaniasis in an endemic area of the state of Rio de Janeiro, Brazil

The leishmanin skin test (LST), which is an in vivo test that assesses the cellular immune responses to Leishmania-derived antigens, is an important tool in the laboratory diagnosis of American tegumentary leishmaniasis (ATL). This study aimed to compare the results obtained in LST employing the Imunoleish® antigen preserved with thimerosal (AgT) or phenol (AgP) and serological techniques to detect a possible infection caused by Leishmania (Viannia) braziliensis in dogs. The study included 172 dogs from an area endemic for ATL in the municipality of Paracambi, state of Rio de Janeiro, Brazil. The results obtained with Imunoleish® antigen preserved with thimerosal (AgT) or phenol (AgP) and serological tests were compared. Each dog received, intradermally, 0.1 mL of each antigen on the inner side of the right (AgT) and left (AgP) thighs. Five (2.7%) dogs presented ATL lesions. Of these, two were reactive to both formulations and three were reactive only to AgT. Among the 172 dogs, 68 (39.5%) were reactive only to AgT, 16 (9.3%)  only to AgP, and 11 (6.4%) to both formulations. Twenty-one (12.2%) sera samples were reactive by immunofluorescent antibody test (IFAT) and 21 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, in only two dogs out of the five which Leishmania was isolated from, serological tests were positive. The LST and serological tests could be a useful tool in the diagnosis of L. (V.) braziliensis infection in dogs. Standardization of the techniques and reagents used could allow comparative studies on sensitivity, specificity, and positive and negative predictive values in dogs from different regions.Keywords: American Tegumentary Leishmaniasis, Leishmanin skin test, Diagnosis, Dogs, Host

Low sequence diversity of the prion protein gene (PRNP) in wild deer and goat species from Spain

Abstract The first European cases of chronic wasting disease (CWD) in free-ranging reindeer and wild elk were confirmed in Norway in 2016 highlighting the urgent need to understand transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in the context of European deer species and the many individual populations throughout the European continent. The genetics of the prion protein gene (PRNP) are crucial in determining the relative susceptibility to TSEs. To establish PRNP gene sequence diversity for free-ranging ruminants in the Northeast of Spain, the open reading frame was sequenced in over 350 samples from five species: Iberian red deer (Cervus elaphus hispanicus), roe deer (Capreolus capreolus), fallow deer (Dama dama), Iberian wild goat (Capra pyrenaica hispanica) and Pyrenean chamois (Rupicapra p. pyrenaica). Three single nucleotide polymorphisms (SNPs) were found in red deer: a silent mutation at codon 136, and amino acid changes T98A and Q226E. Pyrenean chamois revealed a silent SNP at codon 38 and an allele with a single octapeptide-repeat deletion. No polymorphisms were found in roe deer, fallow deer and Iberian wild goat. This apparently low variability of the PRNP coding region sequences of four major species in Spain resembles previous findings for wild mammals, but implies that larger surveys will be necessary to find novel, low frequency PRNP gene alleles that may be utilized in CWD risk control

RECTAL BIOPSY IN SHEEP AND GOATS FOR MONITORING AND ANTE-MORTEM DIAGNOSIS OF SCRAPIE: NUMBER OF LYMPHOID FOLLICLES IN TWO CONSECUTIVE COLLECTIONS

This study aimed to evaluate the amount of lymphoid tissue associated with the rectal mucosa obtained by rectal biopsy and the possibility of two consecutive biopsies at different time intervals, for monitoring and ante-mortem diagnosis of scrapie. Rectal mucosa samples were collected from 56 sheep and 32 goats in two steps. In the first step, on day 0, all animals were tested and, for the second step, the animals were divided into groups and each group was subjected to collection on different dates: for sheep 7, 14, 21, and 28 days after the first one and, for goats, on days 14, 21, and 28. From 176 samples, 151 (85.8%) were collected from the rectal mucosa, and in 25 (14.2%) there was a collection failure. Considering the rectal mucosa samples (151), 56.86% of the sheep samples and 51.61% of the goat samples, on day 0, had more then ≥3 lymphoid follicles (LF). In the second collection, 58.97% of the sheep samples showed ≥ 3 LF and 33.33% of the goat samples. Comparing the number of LF of the same animals between the first and second collections, there was a significant difference (p <0.05) between days 0 and 7 for sheep (with more FL on day 0) and days 0 and 28 (with more LF on day 28) and days 0 and 28 for goats (with more FL on day 0). There was no significant difference in the number of FL assessed on dates 0, 14, and 21 when comparing the different species, sheep and goats. On day 28, sheep samples showed a higher number (p <0.05) of LF than goats. It was concluded that rectal biopsy technique involves useful method for obtaining lymphoid tissue associate to mucosa for immunohistochemistry assessment to monitoring and ante-mortem diagnosis of scrapie in sheep and goats. However, inappropriate sampling or insufficient numbers of FL can generate the necessity to repeat the technique, which could be done 14 days after the first collection, without reduction in the number of the FL. Keywords: immunohistochemistry; prionic disease; recto-anal mucosa associated lymphoid tissue; small ruminants; transmissible spongiform encephalopathies. Enviado em: 14 julho de 2013 Aceito em: 20 abril de 2016 Introdução Encefalopatias espongiformes transmissíveis (ETTs) ou doenças priônicas são desordens neurológicas, progressivas e fatais que afetam animais e humanos. Associam-se ao acúmulo de proteína priônica alterada no sistema nervoso central (SNC) e as lesões histológicas compreendem principalmente vacuolização e morte neural(1). São muitas as enfermidades que compõem o grupo das ETTs, incluindo encefalopatia espongiforme bovina (EEB) em bovinos, scrapie em pequenos ruminantes e a doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ) em humanos(2). Segundo Detwiler e Baylis(3), a scrapie tem sido relatada em diversos países do mundo e está presente em muitas regiões produtoras de ovinos. É endêmica em vários países da Europa, Canadá e Estados Unidos, porém Austrália e Nova Zelândia são consideradas livres da doença(3,4). À semelhança do que ocorre nas demais EETs, na scrapie há acúmulo da isoforma anormal (PrPSc) da proteína priônica celular (PrPC) não apenas no SNC, mas também no sistema linforreticular (SLR) e, variavelmente, em outros tecidos e fluidos corporais(1). O acúmulo da PrPSc em tecidos linfoides levou ao desenvolvimento de procedimentos de biopsia para o diagnóstico ante mortem da scrapie em ovinos, utilizando tecidos acessíveis como a tonsila(5) e terceira pálpebra(6), e a técnica de imuno-histoquímica (IHQ). Por outro lado, a grande área de folículos linfoides presente no reto de ovinos(7) tornou a biopsia retal uma possibilidade de diagnóstico ante mortem da scrapie. Amostras da mucosa retal têm sido colhidas e analisadas por meio de provas de IHQ para avaliar a presença de PrPSc no tecido linfoide associado à mucosa retoanal (RAMALT, do inglês Recto-Anal Mucosa Associated Lymphoid Tissue)(8,9). No Brasil, o primeiro relato de scrapie foi em 1978, em um ovino Hampshire Down, importado da Inglaterra(10). Segundo a OIE, de 2008 a 2014 foram sacrificados 41 animais no país, em surtos de scrapie(11). Desde 2008, o diagnóstico de scrapie é realizado por meio da técnica de IHQ a partir de amostras do SNC e tecidos linfoides(12). Porém, no caso de tecidos linfoides associados à mucosa retal, pode haver necessidade de novas colheitas em curtos intervalos de tempo devido à escassez de tecido para o diagnóstico da doença que, segundo Leal et al.(13), deve ser de no mínimo três folículos linfoides (FL) por amostra. Visando ao reconhecimento de boas técnicas para o monitoramento e o diagnóstico ante mortem da scrapie, o presente estudo teve por objetivo avaliar a quantidade de tecido linfoide associado à mucosa retal obtido pela técnica de biopsia retal e com vistas à avaliação imuno-histoquímica, bem como a possibilidade de se realizarem dois procedimentos de biopsia consecutivos, em diferentes intervalos de tempo, em ovinos e caprinos

Monoclonal and polyclonal antibodies for ante- and post-mortem detection of PrPSc in sheep

Scrapie is a disease that affects sheep and goats and is characterized by the accumulation of an abnormal isoform (PrPSc) of the cellular prion protein, PrPC, in the central nervous system (CNS) and in lymphoid tissues. Detection of PrPSc in these tissues can be attempted by a variety of techniques, including immunohistochemistry (IHC) and western blotting (WB), for which a wide range of monoclonal and polyclonal antibodies are commercially available. The objective of this study was to test and compare the efficacy of monoclonal antibodiesF89/160.1.5, F99/97.6.1, and P4 and polyclonal antibodies M52 and R486 in the detection of PrPSc in lymphoid and CNS tissue samples by using IHC. Positive and negative control samples of sheep brain and tonsils were provided by the Animal Health and Veterinary Laboratories Agency (AHVLA, UK). The IHC examination of CNS samples with both monoclonal and polyclonal antibodies confirmed the granular deposition of PrPSc in the neurons of the positive control tissues. However, while the monoclonal antibodies did not produce positive reactions in the negative controls, the polyclonal antibodies showed some non-specific staining. The testing of positive control tonsil samples with polyclonal and monoclonal antibodies identified positive control-specific reactions, whereas the negative control tissues were IHC-negative with all antibodies, although P4 and the polyclonal antibodies produced some background staining. In summary, although the polyclonal antibodies may be more accessible, their use is not advisable because of possible false positive reactions. The polyclonal antibody M52 was able to identify PrPC in brain and spleen samples by WB but other lymphoid tissues were negative