3 research outputs found
Analysis of pathogenetic processes of an eye disorder
0\. Titel 0
1\. Zusammenfassung 1
2\. Einleitung 2
2.1. Expressionsanalysen 2
2.2. Die Technologie der cDNS-Mikroarrays 7
2.3. Anwendungsmöglichkeiten der Mikroarray-Technologie 17
2.4. Aufbau, Funktion und Erkrankung der menschlichen Netzhaut 19
2.5. Fragestellung 24
3\. Material 25
3.1. Biologisches Material 25
3.2. Enzyme 29
3.3. Kits 29
3.4. Längenstandards, Vektor und Primer 30
3.5. Fein- und Biochemikalien 31 3.6. Lösungen und Puffer 33
3.7. Verbrauchsmaterialien 36
3.8. EDV-Programme 37
3.9. Geräte 37
3.5. Fein- und Biochemikalien 31
4\. Methoden 38
4.1. Herstellung von cDNS-Mikroarrays 38
4.2. Herstellung der Targets 41
4.3. Hybridisierung und Waschen 51
4.4. Bildgewinnung und Datenanalyse 53
4.5. Clusteranalyse 54
5\. Ergebnisse 55
5.1. Optimierung wesentlicher Schritte der cDNS-Mikroarray Technologie 55
5.2. Vergleich von Nylon-Arrays mit Glas-Mikroarrays 62
5.3. Charakterisierung von Subtraktionsbanken durch cDNS-Mikroarrays 65
5.4. Optimierung für Expressionsanalysen mit limitiertem Augenmaterial 70
5.5. Genexpressionsstudie in der ND-Knockout Maus 77
6\. Diskussion 85
6.1. Optimierung wesentlicher Schritte der cDNS-Mikroarray Technologie 85
6.2. Vergleich von cDNS-Mikroarrays mit Nylonfilter-Arrays als
Screeningmethode 87
6.3. Differenzielles Screening der Subtraktionsbank 88
6.4. Optimierung für Expressionsanalysen mit limitiertem Augenmaterial 89
6.5. Komplexität und Anreicherung der Targets 91
6.6. Analyse der Genexpression in der ND-Knockout Maus 92
6.7. Ausblick 98
7\. Literaturverzeichnis 100
8\. Abkürzungsverzeichnis 112
9\. Abbildungsverzeichnis 115
10\. Tabellenverzeichnis 116
11\. Anhang 117
11.1. Haushaltsgene 117
11.2. Retina-spezifische und Apoptose-relevante Gene 119
11.3. Pools für das Redundanz-Screening und Anzahl detektierter Gene 120
11.4. Hybridisierung vollständiger cDNS und Anzahl detektierter Gene 121
11.5. Klone, die bestätigt differenziell exprimierte Gene repräsentieren 121
11.6. Expressionsmuster der RNS-Targets im Zeitverlauf 122
11.7. Expressionsmuster der SMART-Targets im Zeitverlauf 124
12\. Wissenschaftliche Beiträge 128
13.1. Kongressbeiträge 128
13.2. Publikationen 129
13.3. Array-Kurse 129
13\. Danksagung 130cDNS-Mikroarrays stellen ein modernes Verfahren zum Studium der Genexpression
dar, die eine vergleichende Analyse des transkriptionellen Zustandes einer
Zelle oder eines Gewebes ermöglichen. Tausende von Genen können dadurch
simultan in ihrer Expressionsstärke erfasst werden. Gleichzeitig werden
komplexe genetische Veränderungen besonders gut visualisiert. Die biologische
Fragestellung dieser Arbeit war darauf ausgerichtet, Expressionsanalysen an
limitiertem Ausgangsmaterial von Knockout-Mäusen mit einer seltenen
Augenkrankheit durchzuführen. Dabei handelt es sich um die Norrie Krankheit,
eine X-chromosomal-rezessive Erkrankung, die durch degenerative Veränderungen
in der Netzhaut gekennzeichnet ist. Grundlage für die Expressionsanalysen
stellte eine cDNS-Subtraktionsbank dar. Diese war insbesondere für gering
exprimierte Gene angereichert, die in den Augen von Norrie-Knockout Mäusen
fehlen oder auf einem sehr geringen Niveau exprimiert sind. Eine effektive
Screening Methode ermöglichte die Mikroarray-basierte Charakterisierung von
über 3000 cDNS-Klonen aus dieser Bank. Die Vielzahl an identifizierten
Photorezeptor-spezifischen Genen wurde durch zusätzliche Augen-spezifische und
Apoptose-relevante Gene aus einer Klon-Sammlung vervollständigt. Dadurch waren
parallele Expressionsanalysen mit über 5000 Elementen möglich. Zur
Hybridisierung mußten fluoreszent markierte Targets hergestellt werden, wobei
die sehr geringen Mengen an RNS ? wie sie aus dem Auge einer Maus gewonnen
werden können ? eine besondere Schwierigkeit darstellten. Methodisch völlig
unterschiedliche Verfahren wurden verglichen und dahingehend beurteilt ob sie
die initialen Transkript-Verhältnisse aufrechterhalten. In einer umfangreichen
Studie wurde die zeitliche Änderung der Genexpression während der
Krankheitsprogression der Norrie Krankheit erfaßt. Die Augen-RNS von jeweils
drei Tierpaaren (ND-Knockout und Wildtyp) von sieben verschiedenen
Altersstadien (0,5 bis 24 Monate) wurden jeweils mit zwei methodisch
unterschiedlichen Techniken fluoreszenzmarkiert und auf die Mikroarrays
hybridisiert. Die sehr umfangreichen Datensätze wurden durch Clusteranalyse
ausgewertet, wodurch zeitliche Veränderungen der Genexpression identifiziert
und visualisiert werden konnten. Dadurch war es erstmalig möglich,
pathogenetische Prozesse der Krankheitsprogression in ND-Mäusen auf
Transkript-Niveau zu analysieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass
die kontinuierliche Expression des ND-Gens eine wichtige Bedeutung für die
funktionelle und strukturelle Integrität der retinalen Zell-Schichten,
insbesondere für Photorezeptorzellen hat.cDNA-microarrays are a modern tool for gene expression profiling enabling the
comparison of transcriptional activities between different cells or tissues.
With microarrays thousands of genes can be analyzed in parallel and
differentially expressed genes can easily be visualized. Focus of this work
was to elucidate the molecular process of norrie disease using minimal
starting material from the eyes of knockout mice. Norrie disease (ND) is an
X-linked recessive eye disorder with characteristic degenerations in the
retina. This research work is based on a cDNA subtraction library enriched for
genes that are completely absent or expressed on a low abundance level in the
eyes of ND-mice. An efficient microarray-based screening method was developed
to characterize more than 3000 clones of this library, yielding that most of
the identified genes were photoreceptor-specific. This set was extended by the
addition of further eye-specific and apoptosis related genes enabling
expression profiling with more than 5000 elements in parallel. A limiting
factor to generate fluorescently labelled targets was the very low amount of
RNA as it can be obtained from the eye of a mouse. A wide variety of different
labelling methods was optimized and compared in order to maintain the initial
composition of transcripts in a cell. In a considerably large study time-
dependent changes of gene expression due to disease progression of norrie
disease were analysed. For this purpose the eyes of three different animal
pairs (wild type and knockout) of seven different ages (two weeks to two
years) were taken to consider biological replicas. To consider experimental
variations RNA-derived targets were generated with several techniques with and
without amplification. Subsequent hybridization of these targets produced huge
amounts of data which were processed by the means of cluster analysis. Thereby
differences in gene expression were identified and visualized. For the first
time pathogenetic changes during disease progression of ND could be analyzed
on a transcriptional level. The results of this work demonstrate that the
continuous expression of the ND gene plays an important role for functional
and structural integrity of retinal cell layers, especially of photoreceptor
cells
Expressionsanalysen mit cDNS-Mikroarrays : Aufklärung der Pathogenesemechanismen einer seltenen Augenkrankheit Expressionprofiling using cDNA microarrays
Zusammenfassung
cDNS-Mikroarrays stellen ein modernes Verfahren zum Studium der Genexpression dar, die eine vergleichende Analyse des transkriptionellen Zustandes einer Zelle oder eines Gewebes ermöglichen. Tausende von Genen können dadurch simultan in ihrer Expressionsstärke erfasst werden. Gleichzeitig werden komplexe genetische Veränderungen besonders gut visualisiert. Die biologische Fragestellung dieser Arbeit war darauf ausgerichtet, Expressionsanalysen an limitiertem Ausgangsmaterial von Knockout-Mäusen mit einer seltenen Augenkrankheit durchzuführen. Dabei handelt es sich um die Norrie Krankheit, eine X-chromosomal-rezessive Erkrankung, die durch degenerative Veränderungen in der Netzhaut gekennzeichnet ist. Grundlage für die Expressionsanalysen stellte eine cDNS-Subtraktionsbank dar. Diese war insbesondere für gering exprimierte Gene angereichert, die in den Augen von Norrie-Knockout Mäusen fehlen oder auf einem sehr geringen Niveau exprimiert sind. Eine effektive Screening Methode ermöglichte die Mikroarray-basierte Charakterisierung von über 3000 cDNS-Klonen aus dieser Bank. Die Vielzahl an identifizierten Photorezeptor-spezifischen Genen wurde durch zusätzliche Augen-spezifische und Apoptose-relevante Gene aus einer Klon-Sammlung vervollständigt. Dadurch waren parallele Expressionsanalysen mit über 5000 Elementen möglich. Zur Hybridisierung mußten fluoreszent markierte Targets hergestellt werden, wobei die sehr geringen Mengen an RNS ? wie sie aus dem Auge einer Maus gewonnen werden können ? eine besondere Schwierigkeit darstellten. Methodisch völlig unterschiedliche Verfahren wurden verglichen und dahingehend beurteilt ob sie die initialen Transkript-Verhältnisse aufrechterhalten. In einer umfangreichen Studie wurde die zeitliche Änderung der Genexpression während der Krankheitsprogression der Norrie Krankheit erfaßt. Die Augen-RNS von jeweils drei Tierpaaren (ND-Knockout und Wildtyp) von sieben verschiedenen Altersstadien (0,5 bis 24 Monate) wurden jeweils mit zwei methodisch unterschiedlichen Techniken fluoreszenzmarkiert und auf die Mikroarrays hybridisiert. Die sehr umfangreichen Datensätze wurden durch Clusteranalyse ausgewertet, wodurch zeitliche Veränderungen der Genexpression identifiziert und visualisiert werden konnten. Dadurch war es erstmalig möglich, pathogenetische Prozesse der Krankheitsprogression in ND-Mäusen auf Transkript-Niveau zu analysieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die kontinuierliche Expression des ND-Gens eine wichtige Bedeutung für die funktionelle und strukturelle Integrität der retinalen Zell-Schichten, insbesondere für Photorezeptorzellen hat.0. Titel 0
1. Zusammenfassung 1
2. Einleitung 2
2.1. Expressionsanalysen 2
2.2. Die Technologie der cDNS-Mikroarrays 7
2.3. Anwendungsmöglichkeiten der Mikroarray-Technologie 17
2.4. Aufbau, Funktion und Erkrankung der menschlichen Netzhaut 19
2.5. Fragestellung 24
3. Material 25
3.1. Biologisches Material 25
3.2. Enzyme 29
3.3. Kits 29
3.4. Längenstandards, Vektor und Primer 30
3.5. Fein- und Biochemikalien 31
3.6. Lösungen und Puffer 33
3.7. Verbrauchsmaterialien 36
3.8. EDV-Programme 37
3.9. Geräte 37
3.5. Fein- und Biochemikalien 31
4. Methoden 38
4.1. Herstellung von cDNS-Mikroarrays 38
4.2. Herstellung der Targets 41
4.3. Hybridisierung und Waschen 51
4.4. Bildgewinnung und Datenanalyse 53
4.5. Clusteranalyse 54
5. Ergebnisse 55
5.1. Optimierung wesentlicher Schritte der cDNS-Mikroarray Technologie 55
5.2. Vergleich von Nylon-Arrays mit Glas-Mikroarrays 62
5.3. Charakterisierung von Subtraktionsbanken durch cDNS-Mikroarrays 65
5.4. Optimierung für Expressionsanalysen mit limitiertem Augenmaterial 70
5.5. Genexpressionsstudie in der ND-Knockout Maus 77
6. Diskussion 85
6.1. Optimierung wesentlicher Schritte der cDNS-Mikroarray Technologie 85
6.2. Vergleich von cDNS-Mikroarrays mit Nylonfilter-Arrays als Screeningmethode 87
6.3. Differenzielles Screening der Subtraktionsbank 88
6.4. Optimierung für Expressionsanalysen mit limitiertem Augenmaterial 89
6.5. Komplexität und Anreicherung der Targets 91
6.6. Analyse der Genexpression in der ND-Knockout Maus 92
6.7. Ausblick 98
7. Literaturverzeichnis 100
8. Abkürzungsverzeichnis 112
9. Abbildungsverzeichnis 115
10. Tabellenverzeichnis 116
11. Anhang 117
11.1. Haushaltsgene 117
11.2. Retina-spezifische und Apoptose-relevante Gene 119
11.3. Pools für das Redundanz-Screening und Anzahl detektierter Gene 120
11.4. Hybridisierung vollständiger cDNS und Anzahl detektierter Gene 121
11.5. Klone, die bestätigt differenziell exprimierte Gene repräsentieren 121
11.6. Expressionsmuster der RNS-Targets im Zeitverlauf 122
11.7. Expressionsmuster der SMART-Targets im Zeitverlauf 124
12. Wissenschaftliche Beiträge 128
13.1. Kongressbeiträge 128
13.2. Publikationen 129
13.3. Array-Kurse 129
13. Danksagung 13
Global Gene Expression Analysis in a Mouse Model for Norrie Disease: Late Involvement of Photoreceptor Cells
PURPOSE. Mutations in the NDP gene give rise to a variety of eye diseases, including classic Norrie disease (ND), X-linked exudative vitreoretinopathy (EVRX), retinal telangiectasis (Coats disease), and advanced retinopathy of prematurity (ROP). The gene product is a cystine-knot–containing extracellular signaling molecule of unknown function. In the current study, gene expression was determined in a mouse model of ND, to unravel disease-associated mechanisms at the molecular level.
METHODS. Gene transcription in the eyes of 2-year-old Ndp knockout mice was compared with that in the eyes of age-matched wild-type control animals, by means of cDNA subtraction and microarrays. Clones (n = 3072) from the cDNA subtraction libraries were spotted onto glass slides and hybridized with fluorescently labeled RNA-derived targets. More than 230 differentially expressed clones were sequenced, and their expression patterns were verified by virtual Northern blot analysis.
RESULTS. Numerous gene transcripts that are absent or downregulated in the eye of Ndp knockout mice are photoreceptor cell specific. In younger Ndp knockout mice (up to 1 year old), however, all these transcripts were found to be expressed at normal levels.
CONCLUSIONS. The identification of numerous photoreceptor cell–specific transcripts with a reduced expression in 2-year-old, but not in young, Ndp knockout mice indicates that normal gene expression in these light-sensitive cells of mutant mice is established and maintained over a long period and that rods and cones are affected relatively late in the mouse model of ND. Obviously, the absence of the Ndp gene product is not compatible with long-term survival of photoreceptor cells in the mouse