Analysis of pathogenetic processes of an eye disorder

Abstract

0\. Titel 0 1\. Zusammenfassung 1 2\. Einleitung 2 2.1. Expressionsanalysen 2 2.2. Die Technologie der cDNS-Mikroarrays 7 2.3. Anwendungsmöglichkeiten der Mikroarray-Technologie 17 2.4. Aufbau, Funktion und Erkrankung der menschlichen Netzhaut 19 2.5. Fragestellung 24 3\. Material 25 3.1. Biologisches Material 25 3.2. Enzyme 29 3.3. Kits 29 3.4. Längenstandards, Vektor und Primer 30 3.5. Fein- und Biochemikalien 31 3.6. Lösungen und Puffer 33 3.7. Verbrauchsmaterialien 36 3.8. EDV-Programme 37 3.9. Geräte 37 3.5. Fein- und Biochemikalien 31 4\. Methoden 38 4.1. Herstellung von cDNS-Mikroarrays 38 4.2. Herstellung der Targets 41 4.3. Hybridisierung und Waschen 51 4.4. Bildgewinnung und Datenanalyse 53 4.5. Clusteranalyse 54 5\. Ergebnisse 55 5.1. Optimierung wesentlicher Schritte der cDNS-Mikroarray Technologie 55 5.2. Vergleich von Nylon-Arrays mit Glas-Mikroarrays 62 5.3. Charakterisierung von Subtraktionsbanken durch cDNS-Mikroarrays 65 5.4. Optimierung für Expressionsanalysen mit limitiertem Augenmaterial 70 5.5. Genexpressionsstudie in der ND-Knockout Maus 77 6\. Diskussion 85 6.1. Optimierung wesentlicher Schritte der cDNS-Mikroarray Technologie 85 6.2. Vergleich von cDNS-Mikroarrays mit Nylonfilter-Arrays als Screeningmethode 87 6.3. Differenzielles Screening der Subtraktionsbank 88 6.4. Optimierung für Expressionsanalysen mit limitiertem Augenmaterial 89 6.5. Komplexität und Anreicherung der Targets 91 6.6. Analyse der Genexpression in der ND-Knockout Maus 92 6.7. Ausblick 98 7\. Literaturverzeichnis 100 8\. Abkürzungsverzeichnis 112 9\. Abbildungsverzeichnis 115 10\. Tabellenverzeichnis 116 11\. Anhang 117 11.1. Haushaltsgene 117 11.2. Retina-spezifische und Apoptose-relevante Gene 119 11.3. Pools für das Redundanz-Screening und Anzahl detektierter Gene 120 11.4. Hybridisierung vollständiger cDNS und Anzahl detektierter Gene 121 11.5. Klone, die bestätigt differenziell exprimierte Gene repräsentieren 121 11.6. Expressionsmuster der RNS-Targets im Zeitverlauf 122 11.7. Expressionsmuster der SMART-Targets im Zeitverlauf 124 12\. Wissenschaftliche Beiträge 128 13.1. Kongressbeiträge 128 13.2. Publikationen 129 13.3. Array-Kurse 129 13\. Danksagung 130cDNS-Mikroarrays stellen ein modernes Verfahren zum Studium der Genexpression dar, die eine vergleichende Analyse des transkriptionellen Zustandes einer Zelle oder eines Gewebes ermöglichen. Tausende von Genen können dadurch simultan in ihrer Expressionsstärke erfasst werden. Gleichzeitig werden komplexe genetische Veränderungen besonders gut visualisiert. Die biologische Fragestellung dieser Arbeit war darauf ausgerichtet, Expressionsanalysen an limitiertem Ausgangsmaterial von Knockout-Mäusen mit einer seltenen Augenkrankheit durchzuführen. Dabei handelt es sich um die Norrie Krankheit, eine X-chromosomal-rezessive Erkrankung, die durch degenerative Veränderungen in der Netzhaut gekennzeichnet ist. Grundlage für die Expressionsanalysen stellte eine cDNS-Subtraktionsbank dar. Diese war insbesondere für gering exprimierte Gene angereichert, die in den Augen von Norrie-Knockout Mäusen fehlen oder auf einem sehr geringen Niveau exprimiert sind. Eine effektive Screening Methode ermöglichte die Mikroarray-basierte Charakterisierung von über 3000 cDNS-Klonen aus dieser Bank. Die Vielzahl an identifizierten Photorezeptor-spezifischen Genen wurde durch zusätzliche Augen-spezifische und Apoptose-relevante Gene aus einer Klon-Sammlung vervollständigt. Dadurch waren parallele Expressionsanalysen mit über 5000 Elementen möglich. Zur Hybridisierung mußten fluoreszent markierte Targets hergestellt werden, wobei die sehr geringen Mengen an RNS ? wie sie aus dem Auge einer Maus gewonnen werden können ? eine besondere Schwierigkeit darstellten. Methodisch völlig unterschiedliche Verfahren wurden verglichen und dahingehend beurteilt ob sie die initialen Transkript-Verhältnisse aufrechterhalten. In einer umfangreichen Studie wurde die zeitliche Änderung der Genexpression während der Krankheitsprogression der Norrie Krankheit erfaßt. Die Augen-RNS von jeweils drei Tierpaaren (ND-Knockout und Wildtyp) von sieben verschiedenen Altersstadien (0,5 bis 24 Monate) wurden jeweils mit zwei methodisch unterschiedlichen Techniken fluoreszenzmarkiert und auf die Mikroarrays hybridisiert. Die sehr umfangreichen Datensätze wurden durch Clusteranalyse ausgewertet, wodurch zeitliche Veränderungen der Genexpression identifiziert und visualisiert werden konnten. Dadurch war es erstmalig möglich, pathogenetische Prozesse der Krankheitsprogression in ND-Mäusen auf Transkript-Niveau zu analysieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die kontinuierliche Expression des ND-Gens eine wichtige Bedeutung für die funktionelle und strukturelle Integrität der retinalen Zell-Schichten, insbesondere für Photorezeptorzellen hat.cDNA-microarrays are a modern tool for gene expression profiling enabling the comparison of transcriptional activities between different cells or tissues. With microarrays thousands of genes can be analyzed in parallel and differentially expressed genes can easily be visualized. Focus of this work was to elucidate the molecular process of norrie disease using minimal starting material from the eyes of knockout mice. Norrie disease (ND) is an X-linked recessive eye disorder with characteristic degenerations in the retina. This research work is based on a cDNA subtraction library enriched for genes that are completely absent or expressed on a low abundance level in the eyes of ND-mice. An efficient microarray-based screening method was developed to characterize more than 3000 clones of this library, yielding that most of the identified genes were photoreceptor-specific. This set was extended by the addition of further eye-specific and apoptosis related genes enabling expression profiling with more than 5000 elements in parallel. A limiting factor to generate fluorescently labelled targets was the very low amount of RNA as it can be obtained from the eye of a mouse. A wide variety of different labelling methods was optimized and compared in order to maintain the initial composition of transcripts in a cell. In a considerably large study time- dependent changes of gene expression due to disease progression of norrie disease were analysed. For this purpose the eyes of three different animal pairs (wild type and knockout) of seven different ages (two weeks to two years) were taken to consider biological replicas. To consider experimental variations RNA-derived targets were generated with several techniques with and without amplification. Subsequent hybridization of these targets produced huge amounts of data which were processed by the means of cluster analysis. Thereby differences in gene expression were identified and visualized. For the first time pathogenetic changes during disease progression of ND could be analyzed on a transcriptional level. The results of this work demonstrate that the continuous expression of the ND gene plays an important role for functional and structural integrity of retinal cell layers, especially of photoreceptor cells

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