In vivo characterization of the antimicrobial properties of the probiotic strain Lcr35®

Les antibiotiques et antifongiques constituent une des plus grandes découvertes de la médecine et ont participé à sauver des millions de vie. Cependant, leur efficacité est menacée du fait de l’adaptation des microorganismes qui deviennent résistants à leurs actions. Ce phénomène est en particulier lié à la consommation anormalement élevée de molécules antimicrobiennes, notamment en France. En dépit du fait que ces résistances soient acquises majoritairement par des bactéries, les levures pathogènes comme le genre Candida n’échappent pas à la règle. Dès lors, la communauté scientifique et les services de santé doivent mettre en place au plus vite des alternatives aux médicaments traditionnels. Parmi ces alternatives, l'utilisation de microorganismes probiotiques dont le potentiel antifongique a déjà été démontré à l'aide de modèles précliniques (cultures cellulaires, animaux de laboratoire) et d'études cliniques est prometteuse. Ceci est notamment le cas du Live Biotherapeutic Microorganism Lactobacillus rhamnosus Lcr35® dont l’activité anti-C. albicans a été prouvée lors de travaux précédents sans toutefois parvenir à décrire les mécanismes d’actions. Les comprendre est devenu un besoin stratégique pour le développement de nouveaux traitements pour l'homme.Une approche expérimentale innovante, utilisant le modèle nématode Caenorhabditis elegans, a été mise en œuvre. Celle-ci visait à simuler une infection fongique et à évaluer l’effet de Lcr35® par des approches préventive et curative. Les impacts ont été suivis au moyen de tests de longévité et de survie de l’hôte ainsi que par l’étude de son transcriptome (de manière ciblée et globale), le tout en lien avec le niveau d’activité d’un facteur de transcription central, DAF-16. Nous avons ainsi démontré que Lcr35® induisait une survie significativement augmentée de l’hôte y compris après infection par Candida. L’analyse du transcriptome de C. elegans et l’utilisation de souches mutantes ont montré l’implication des voies de signalisations p38 MAPK et DAF-2/DAF-16 impliquées dans la longévité et la lutte anti-pathogène. De plus, des tests in vitro sur cellules intestinales Caco-2 ont montré une inhibition significative de la croissance et de l’adhésion du pathogène par Lcr35®. Ces résultats suggèrent que la bactérie Lcr35® a une action directe sur le pathogène en entraînant sa mort, mais également en modulant la réponse transcriptionnelle de l’hôte via des voies de signalisation hautement conservées. Une étude plus approfondie, ciblant notamment le métabolome de l’hôte permettrait une compréhension plus fine des mécanismes afin d’adapter le criblage et la conception industrielle de LBM selon la cible thérapeutique.Antibiotics and antifungals are one of the greatest discoveries of medicine and have helped save millions of lives. However, their effectiveness is threatened by the adaptation of microorganisms that become resistant. This phenomenon is particularly related to the abnormally high consumption of antimicrobial molecules, especially in France. Even though these resistances are mainly acquired by bacteria, pathogenic yeasts such as the genus Candida do not escape the rule. Therefore, the scientific community and health services must implement as soon as possible alternatives to traditional drugs. Among these alternatives, the use of probiotic microorganisms whose antifungal potential has already been demonstrated using preclinical models (cell cultures, laboratory animals) and clinical studies is particularly promising. This is the case of the Live Biotherapeutic Microorganism Lactobacillus rhamnosus Lcr35® strain whose anti-C. albicans has been demonstrated in previous work but failed to describe the mechanisms of action. Understanding them has become a strategic need for the development of new treatments for humans.An innovative experimental approach, using the nematode model Caenorhabditis elegans, has been implemented. The aim was to simulate a fungal infection and treat it with Lcr35® using preventive and curative approaches. These were followed by means of tests of longevity and survival of the host, by the study of its transcriptome (in a targeted and global way), all in connection with the follow-up of the activity of a factor transcription, DAF-16. We thus demonstrated that Lcr35® induced a significantly increased survival of the host, including after infection by Candida. The analysis of the transcriptome of C. elegans and the use of mutant strains showed the involvement of the p38 MAPK and DAF-2 / DAF-16 signaling pathways, pathways involved in longevity and pathogen control. Also, in vitro Caco-2 intestinal cell assays showed significant inhibition of pathogen growth and adhesion by Lcr35®. These results suggest that the bacterium Lcr35® has a direct action on the pathogen causing its death but also by modulating the transcriptional response of the host via highly conserved signaling pathways. Further study, targeting the host metabolome, would allow a better understanding of the mechanisms and adapt the industrial design of LBM according to the therapeutic target

Caractérisation in vivo des propriétés antimicrobiennes de la souche probiotique Lcr35®

Antibiotics and antifungals are one of the greatest discoveries of medicine and have helped save millions of lives. However, their effectiveness is threatened by the adaptation of microorganisms that become resistant. This phenomenon is particularly related to the abnormally high consumption of antimicrobial molecules, especially in France. Even though these resistances are mainly acquired by bacteria, pathogenic yeasts such as the genus Candida do not escape the rule. Therefore, the scientific community and health services must implement as soon as possible alternatives to traditional drugs. Among these alternatives, the use of probiotic microorganisms whose antifungal potential has already been demonstrated using preclinical models (cell cultures, laboratory animals) and clinical studies is particularly promising. This is the case of the Live Biotherapeutic Microorganism Lactobacillus rhamnosus Lcr35® strain whose anti-C. albicans has been demonstrated in previous work but failed to describe the mechanisms of action. Understanding them has become a strategic need for the development of new treatments for humans.An innovative experimental approach, using the nematode model Caenorhabditis elegans, has been implemented. The aim was to simulate a fungal infection and treat it with Lcr35® using preventive and curative approaches. These were followed by means of tests of longevity and survival of the host, by the study of its transcriptome (in a targeted and global way), all in connection with the follow-up of the activity of a factor transcription, DAF-16. We thus demonstrated that Lcr35® induced a significantly increased survival of the host, including after infection by Candida. The analysis of the transcriptome of C. elegans and the use of mutant strains showed the involvement of the p38 MAPK and DAF-2 / DAF-16 signaling pathways, pathways involved in longevity and pathogen control. Also, in vitro Caco-2 intestinal cell assays showed significant inhibition of pathogen growth and adhesion by Lcr35®. These results suggest that the bacterium Lcr35® has a direct action on the pathogen causing its death but also by modulating the transcriptional response of the host via highly conserved signaling pathways. Further study, targeting the host metabolome, would allow a better understanding of the mechanisms and adapt the industrial design of LBM according to the therapeutic target.Les antibiotiques et antifongiques constituent une des plus grandes découvertes de la médecine et ont participé à sauver des millions de vie. Cependant, leur efficacité est menacée du fait de l’adaptation des microorganismes qui deviennent résistants à leurs actions. Ce phénomène est en particulier lié à la consommation anormalement élevée de molécules antimicrobiennes, notamment en France. En dépit du fait que ces résistances soient acquises majoritairement par des bactéries, les levures pathogènes comme le genre Candida n’échappent pas à la règle. Dès lors, la communauté scientifique et les services de santé doivent mettre en place au plus vite des alternatives aux médicaments traditionnels. Parmi ces alternatives, l'utilisation de microorganismes probiotiques dont le potentiel antifongique a déjà été démontré à l'aide de modèles précliniques (cultures cellulaires, animaux de laboratoire) et d'études cliniques est prometteuse. Ceci est notamment le cas du Live Biotherapeutic Microorganism Lactobacillus rhamnosus Lcr35® dont l’activité anti-C. albicans a été prouvée lors de travaux précédents sans toutefois parvenir à décrire les mécanismes d’actions. Les comprendre est devenu un besoin stratégique pour le développement de nouveaux traitements pour l'homme.Une approche expérimentale innovante, utilisant le modèle nématode Caenorhabditis elegans, a été mise en œuvre. Celle-ci visait à simuler une infection fongique et à évaluer l’effet de Lcr35® par des approches préventive et curative. Les impacts ont été suivis au moyen de tests de longévité et de survie de l’hôte ainsi que par l’étude de son transcriptome (de manière ciblée et globale), le tout en lien avec le niveau d’activité d’un facteur de transcription central, DAF-16. Nous avons ainsi démontré que Lcr35® induisait une survie significativement augmentée de l’hôte y compris après infection par Candida. L’analyse du transcriptome de C. elegans et l’utilisation de souches mutantes ont montré l’implication des voies de signalisations p38 MAPK et DAF-2/DAF-16 impliquées dans la longévité et la lutte anti-pathogène. De plus, des tests in vitro sur cellules intestinales Caco-2 ont montré une inhibition significative de la croissance et de l’adhésion du pathogène par Lcr35®. Ces résultats suggèrent que la bactérie Lcr35® a une action directe sur le pathogène en entraînant sa mort, mais également en modulant la réponse transcriptionnelle de l’hôte via des voies de signalisation hautement conservées. Une étude plus approfondie, ciblant notamment le métabolome de l’hôte permettrait une compréhension plus fine des mécanismes afin d’adapter le criblage et la conception industrielle de LBM selon la cible thérapeutique

Caractérisation in vivo des propriétés antimicrobiennes de la souche probiotique Lcr35 ® Utilisation du modèle Caenorhabditis elegans pour l'étude des interactions hôte -microorganismes

Antibiotics and antifungals are one of the greatest discoveries of medicine and have helped save millions of lives. However, their effectiveness is threatened by the adaptation of microorganisms that become resistant. This phenomenon is particularly related to the abnormally high consumption of antimicrobial molecules, especially in France. Even though these resistances are mainly acquired by bacteria, pathogenic yeasts such as the genus Candida do not escape the rule. Therefore, the scientific community and health services must implement as soon as possible alternatives to traditional drugs. Among these alternatives, the use of probiotic microorganisms whose antifungal potential has already been demonstrated using preclinical models (cell cultures, laboratory animals) and clinical studies is particularly promising. This is the case of the Live Biotherapeutic Microorganism Lactobacillus rhamnosus Lcr35® strain whose anti-C. albicans has been demonstrated in previous work but failed to describe the mechanisms of action. Understanding them has become a strategic need for the development of new treatments for humans.An innovative experimental approach, using the nematode model Caenorhabditis elegans, has been implemented. The aim was to simulate a fungal infection and treat it with Lcr35® using preventive and curative approaches. These were followed by means of tests of longevity and survival of the host, by the study of its transcriptome (in a targeted and global way), all in connection with the follow-up of the activity of a factor transcription, DAF-16. We thus demonstrated that Lcr35® induced a significantly increased survival of the host, including after infection by Candida. The analysis of the transcriptome of C. elegans and the use of mutant strains showed the involvement of the p38 MAPK and DAF-2 / DAF-16 signaling pathways, pathways involved in longevity and pathogen control. Also, in vitro Caco-2 intestinal cell assays showed significant inhibition of pathogen growth and adhesion by Lcr35®. These results suggest that the bacterium Lcr35® has a direct action on the pathogen causing its death but also by modulating the transcriptional response of the host via highly conserved signaling pathways. Further study, targeting the host metabolome, would allow a better understanding of the mechanisms and adapt the industrial design of LBM according to the therapeutic target.Les antibiotiques et antifongiques constituent une des plus grandes découvertes de la médecine et ont participé à sauver des millions de vies. Cependant, leur efficacité est menacée du fait de l’adaptation des microorganismes qui deviennent résistants à leurs actions. Ce phénomène est en particulier lié à la consommation anormalement élevée de molécules antimicrobiennes, notamment en France. En dépit du fait que ces résistances soient acquises majoritairement par des bactéries, les levures pathogènes comme le genre Candida n’échappent pas à la règle. Dès lors, la communauté scientifique et les services de santé doivent mettre en place au plus vite des alternatives aux médicaments traditionnels. Parmi ces alternatives, l’utilisation de microorganismes probiotiques dont le potentiel antifongique a déjà été démontré à l’aide de modèles précliniques (cultures cellulaires, animaux de laboratoire) et d’études cliniques est prometteuse. Ceci est notamment le cas du Live Biotherapeutic Microorganism Lactobacillus rhamnosus Lcr35® dont l’activité anti-C. albicans a été prouvée lors de travaux précédents sans toutefois parvenir à décrire les mécanismes d’actions. Les comprendre est devenu un besoin stratégique pour le développement de nouveaux traitements pour l’homme.Une approche expérimentale innovante, utilisant le modèle nématode Caenorhabditis elegans, a été mise en œuvre. Celle-ci visait à simuler une infection fongique et à évaluer l’effet de Lcr35® par des approches préventive et curative. Les impacts ont été suivis au moyen de tests de longévité et de survie de l’hôte ainsi que par l’étude de son transcriptome (de manière ciblée et globale), le tout en lien avec le niveau d’activité d’un facteur de transcription central, DAF-16. Nous avons ainsi démontré que Lcr35® induisait une survie significativement augmentée de l’hôte y compris après infection par Candida. L’analyse du transcriptome de C. elegans et l’utilisation de souches mutantes ont montré l’implication des voies de signalisations p38 MAPK et DAF-2/DAF-16 impliquées dans la longévité et la lutte anti-pathogène. De plus, des tests in vitro sur cellules intestinales Caco-2 ont montré une inhibition significative de la croissance et de l’adhésion du pathogène par Lcr35®. Ces résultats suggèrent que la bactérie Lcr35® a une action directe sur le pathogène en entraînant sa mort, mais également en modulant la réponse transcriptionnelle de l’hôte via des voies de signalisation hautement conservées. Une étude plus approfondie ciblant notamment le métabolome de l’hôte permettrait une compréhension plus fine des mécanismes afin d’adapter le criblage et la conception industrielle de LBM selon la cible thérapeutique

Probiotiques et mycoses : quand les bactéries partent à la chasse aux champignons

International audienc

Caenorhabditis elegans, a Host to Investigate the Probiotic Properties of Beneficial Microorganisms

International audienceCaenorhabditis elegans, a non-parasitic nematode emerges as a relevant and powerful candidate as an in vivo model for microorganisms-microorganisms and microorganisms-host interactions studies. Experiments have demonstrated the probiotic potential of bacteria since they can provide to the worm a longer lifespan, an increased resistance to pathogens and to oxidative or heat stresses. Probiotics are used to prevent or treat microbiota dysbiosis and associated pathologies but the molecular mechanisms underlying their capacities are still unknown. Beyond safety and healthy aspects of probiotics, C. elegans represents a powerful way to design large-scale studies to explore transkingdom interactions and to solve questioning about the molecular aspect of these interactions. Future challenges and opportunities would be to validate C. elegans as an in vivo tool for high-throughput screening of microorganisms for their potential probiotic use on human health and to enlarge the panels of microorganisms studied as well as the human diseases investigated

Etudes in vivo des propriétés probiotiques et anti-Candida albicans de Lactobacillus rhamnosus Lcr35®

National audienceLes probiotiques sont définis par la FAO et l’OMS comme des microorganismes vivants conférant des effets bénéfiques à l’hôte comme par exemple Lactobacillus rhamnosus Lcr35®. Ce dernier est notamment commercialisé pour ses propriétés anti-Candida albicans. De plus, ses propriétés sont potentialisées par des composés inclus dans les formulations. Cependant, comme pour la plupart des probiotiques, les mécanismes d’action de Lcr35® ne sont pas encore décrits. Les identifier devient aujourd’hui une priorité. Dans ce but, des études in vivo utilisant un organisme modèle, Caenorhabditis elegans, ont été réalisées : (i) étude de la survie du nématode en présence du probiotique potentialisé ou non, (ii) étude des effets préventifs et curatifs de Lcr35® contre une infection à Candida chez C. elegans et (iii) approches transcriptomiques pour identifier les voies de signalisation impliquées dans les effets anti-Candida de Lcr35®.La pathogénicité de C. albicans est généralement liée à la filamentation induisant la destruction des cellules de l’hôte. De Barros et al. (2018) ont montré que C. elegans, prétraité avec L. paracasei, était moins sensible à une infection à C. albicans. Cependant, une réduction significative de la filamentation n’a pas été observée. De ce fait, des expérimentations sur la réduction de la filamentation de C. albicans par Lcr35® seront réalisées

Highlighting of the molecular mechanisms involved in probiotic properties of Lactobacillus rhamnosus Lcr35

National audienceProbiotics are defined by the World Health Organization as live microorganisms which, when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host (1). Although their beneficial effects on health are proven, knowledge on their mechanisms of action is becoming a priority today. This is the case with L. rhamnosus Lcr35, whose probiotic and anti- Candida albicans properties have been demonstrated (2, 3). Lcr35 is genetically and physiologically well-characterized and it has been proven that ingredients included in the formulations is able to potentialize Lcr35 probiotic effect. In order to investigate the molecular mechanisms involved in the Lcr35 strain probiotic properties, in vivo studies have been carried out in C. elegans : the analysis of the nematode survival in the presence of the probiotic strain potentialized or not for the anti- C. albicans properties, and a preliminary analysis of the modulation of the immune response by Lcr35.The survival analyzes showed that the strain Lcr35 allowed a significant increased lifespan of the nematode in comparison with E. coli OP50 whereas C. albicans impaired survival. The activation of insulin and p38 MAPK pathways has been shown using RT-qPCR. Then we will go further into the investigations to understand the molecular mechanisms related to these properties by studying in particular the preventive and curative effects of Lcr35 with respect to a C. albicans infection. In addition, a complete analysis of the transcriptome of C. elegans will be carried out by RNA sequencing in order to precisely identify the signaling pathways involved in the interaction between the host and the probiotic or the pathogen microorganisms. Moreover, because of C. elegans genetic homology with humans and in particular its intestinal physiology close to humans, our work lead us to evaluate the potential of C. elegans to be a relevant in vivo model to characterize the molecular mechanisms involved in the probiotic potential of a microorganisms and then to screen microorganisms collections for their potential probiotic capacities.1. FAO, WHO. 2001. Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria. Food Nutr Pap 85:71.2. Nivoliez A et al. 2012. Influence of manufacturing processes on in vitro properties of the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus Lcr35. J Biotechnol 160:236–241.3. Nivoliez A et al. 2015. Influence of manufacturing processes on cell surface properties of probiotic strain Lactobacillus rhamnosus Lcr35. Appl Microbiol Biotechnol 99:399–41

Caractérisation in vivo des mécanismes probiotiques de Lactobacillus rhamnosus Lcr35®

National audienceLa levure Candida albicans est un pathogène opportuniste retrouvée dans la flore commensale de 80% de la population. Elle est l’agent d’un grand nombre d’infections digestives et gynécologiques appelées candidoses. La prise d’antifongique, bien qu’efficace, peut entrainer une dysbiose favorable à une récidive ultérieure. Lactobacillus rhamnosus Lcr35® est un probiotique dont les propriétés antimicrobiennes, notamment anti-C. albicans, ont été démontrées à la fois in vitro et lors d’essais cliniques. Cependant, les mécanismes moléculaires expliquant ces propriétés n’ont pas encore été décrits. L’objectif de ma thèse est d’identifier ces mécanismes en utilisant un modèle in vivo physiologiquement proche de l’Homme, le ver Caenorhabditis elegans.Ce nématode modèle sera présenté suivi des différentes stratégies expérimentales mises en œuvre : (i) l’étude du temps de vie en présence du probiotique ou du pathogène, (ii) l’étude des effets préventifs et curatifs du probiotique vis-à-vis d’une infection fongique puis (iii) des études omiques (transcriptomique et métabolomique).Les premiers résultats ont mis en évidence que Lcr35® induit un effet positif sur la durée de vie de C. elegans à l’inverse de C. albicans qui induit un effet négatif. De plus, un effet protecteur du probiotique vis-à-vis d’une infection à C. albicans est observé. En effet, en présence de Lcr35®, le nématode résiste à l’infection et voit son temps de vie augmenter. En perspective, une étude transcriptomique de la réponse globale du ver à l’administration du probiotique et/ou du pathogène est envisagée dans le but d’identifier les mécanismes moléculaires responsables des effets observés