Role of TASK2 Potassium Channels Regarding Volume Regulation in Primary Cultures of Mouse Proximal Tubules

Several papers reported the role of TASK2 channels in cell volume regulation and regulatory volume decrease (RVD). To check the possibility that the TASK2 channel modulates the RVD process in kidney, we performed primary cultures of proximal convoluted tubules (PCT) and distal convoluted tubules (DCT) from wild-type and TASK2 knockout (KO) mice. In KO mice, the TASK2 coding sequence was in part replaced by the lac-Z gene. This allows for the precise localization of TASK2 in kidney sections using β-galactosidase staining. TASK2 was only localized in PCT cells. K+ currents were analyzed by the whole-cell clamp technique with 125 mM K-gluconate in the pipette and 140 mM Na-gluconate in the bath. In PCT cells from wild-type mice, hypotonicity induced swelling-activated K+ currents insensitive to 1 mM tetraethylammonium, 10 nM charybdotoxin, and 10 μM 293B, but blocked by 500 μM quinidine and 10 μM clofilium. These currents were increased in alkaline pH and decreased in acidic pH. In PCT cells from TASK2 KO, swelling-activated K+ currents were completely impaired. In conclusion, the TASK2 channel is expressed in kidney proximal cells and could be the swelling-activated K+ channel responsible for the cell volume regulation process during osmolyte absorptions in the proximal tubules

Renal magnesium handling: New insights in understanding old problems

Many sharp-eyed readers have pointed out to us that in the photo next to the article about yams in Ghana (Spore 87, June 2000, page 8), the woman had put all her cassava in one basket, and not the yams she planned to use. Point taken. Whatever you want to point out, point to or point at, your letters, faxes and emails are always welcome at the Spore address in the box on the right. Write now.MailboxMany sharp-eyed readers have pointed out to us that in the photo next to the article about yams in Ghana (Spore 87, June 2000, page 8), the woman had put all her cassava in one basket, and not the yams she planned to use. Point taken...

Etude du changement de couplage stoechiométrique de la forme rénale du cotransporteur Na+ et de HCO3- exprimé dans les ovocytes de Xenopus laevis

Le rapport stoechiométrique (q) du flux de HCO3- par rapport au Na+ est de 3:1 in vivo mais seulement de 2:1 dans les ovocytes de Xénopus. Pour étudier les paramètres responsables du changement de q, le cotransporteur rkNBC a éte exprimé dans des ovocytes. q a été déterminé à partir du potentiel de réversion du courant INBC mesuré sur des " patches " de membrane géants. Le tenidap à l'inverse du DIDS peut inhiber INBC de façon réversible avec moins d'activations de courants. Le DIDS active 2 types de conductances ovocytaires : une non spécifique laissant passer les cations monovalents de type SAC (stretch-activated channel) et une spécifique du sodium de type DINa (depolarisation-induced Na+ channel). Ces conductances sont sensibles de façon réversible à 1mM d'amiloride. Nos résultats confirment que dans les patches en conditions physiologiques, rkNBC fonctionne avec q=2:1. L'élévation de la température à 32ʿC ou de la [Ca2+]i à 0.1æM laissent q invariable. Par contre, une [Ca2+]i de 0.5æM, permet un q de 3:1. Ceci est confirmé par modification des gradients de Na+ et de HCO3-. Ces données indiquent que rkNBC peut opérer avec différents q en fonction de la [Ca2+]i.The stoichiometric ratio of HCO3- to Na+ flux may be either 3:1 in vivo or 2:1 when expressed in Xenopus laevis oocytes. To study which parameter might be responsible for the change, we expressed rkNBC in oocytes and determined q from reversal point of the cotransport current (INBC). q was determined from the INBC reversal potential.Instead of using DIDS, we used DIDS which inhibit INBC reversibly and had less side effects. Our results confirmed that in patches bathed with near physiological solutions, rkNBC operates with q=2:1. Raising temperature from 22 to 32ʿC does not change q. Similarly, the elevation of [Ca2+]i to 0.1æM does not affect q. However, when raising [Ca2+]i to 0.5æM, q increases to 3:1. The latter value was also found when Na+ and HCO3- gradients were altered, provided [Ca2+]i was elevated. The data indicate that rkNBC can operate with different stoichiometric ratios and that changes in q are triggered by [Ca2+]i. The data also suggest that [Ca2+]i does not stimulate rkNBC directly but via intracellular regulatory proteins.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Cadmium et fonction rénale (altération des mécanismes de transport)

Cette thèse a eu pour ambition d'approfondir les connaissances portant sur le comportement rénal du cadmium (Cd), un polluant extrêmement toxique. En effet, bien que le rein soit une des cibles reconnues du Cd, les interactions entre cet organe et ce métal lourd restaient très mal connues. Les objectifs de nos travaux ont été : 1) la localisation de la réabsorption du Cd le long du néphron ; 2) l'identification des transporteurs impliqués dans sa réabsorption active au niveau de chaque segment ; 3) l'étude de la cinétique d'apparition des dommages rénaux et les caractéristiques des lors d'intoxication aiguë et chronique ; 4) la mise en évidence d'un moyen simple pour protéger la fonction rénale ; 5) l'étude des mécanismes impliqués dans la toxicité cellulaire du Cd . Pour cela, nous avons utilisé des approches in vivo, comme l'exploration fonctionnelle de la fonction rénale du rat par les techniques de microinjections, microponctions et clairances, et des approches in vitro, comme la réalisation de tests de toxicité sur des cultures cellulaires de lignées rénales et la microscopie par immunofluorescence sur des coupes de rein de rat intoxiqué. In vivo, nous avons démontré que le Cd2+ est principalement réabsorbé par le tubule proximal mais surtout que les segments situés en aval (anse de Henle, tubule distal, tubule collecteur) présentent eux aussi une perméabilité importante et que les voies de transport impliquées varient selon le segment considéré. Pour la première fois chez l'animal entier, le rôle de la voie paracellulaire et du transporteur DMT1 dans le transport de ce cation métallique ont été établis dans l'anse de Henle et le tubule distal. Parallèlement les effets des expositions aiguë et chronique au Cd ont été analysés, mettant en évidence une altération de la réabsorption rénale des ions Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl- et PO42- accompagnée d'un effet toxique retard sur la filtration glomérulaire. De manière intéressante, la survenue de ces troubles rénaux a pu être empêchée par l'administration de Zn2+. In vitro, les travaux réalisés sur des cultures de cellules RP1 ont permis de caractériser certains phénomènes cytotoxiques tels que la nécrose et les atteintes mitochondriales (diminution de la consommation cellulaire d'O2) provoqués par le Cd2+ et que les mécanismes impliqués dans la protection par le zinc au niveau rénal ne font pas intervenir la métallothionéine contrairement à l'hypothèse longtemps avancée dans la littérature . En conclusion, cette étude ouvre la voie à des perspectives nouvelles dans la lutte contre la néphrotoxicité du cadmium en identifiant les mécanismes impliqués dans l'accumulation et la toxicité rénale de ce métal lourd et en soulignant le rôle de certains transporteurs qui pourraient être de possibles cibles pharmacologiques dans l'avenir.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

In vivo Cre/loxP mediated recombination in mouse Clara cells.

In small airways, Clara cells are the main epithelial cell type and play an important physiological role in surfactant production, protection against environmental agents, regulation of inflammatory and immune responses in the respiratory system. Thus, Clara cells are involved in lung homeostasis and pathologies like asthma, Chronic Obstructive Pulmonary Diseases (COPD) or cancers. To date, Clara cells implication in these pathological processes remains largely enigmatic. The engineering of a transgenic strain mouse allowing specific gene invalidation in Clara cells may be of interest to improve our knowledge about the genes involved in these diseases. By using the Cre/loxP strategy we report the engineering of a transgenic mouse strain with expression of Cre recombinase under the control of the Clara Cell Secretory Protein (CCSP) promoter. Specific staining and immuno-histochemistry performed after breeding with reporter mice revealed that CCSP drives a functional Cre expression specifically in Clara cells. This mouse strain is a powerful tool for Cre-loxP-mediated conditional recombination in the lung and represents a new tool to study Clara cell physiology

Effets d'une intoxication au cadmium sur la fonction rénale du rat de la naissance à l'âge adulte

Cette étude a eu pour but d aller plus avant dans la compréhension des mécanismes de toxicité rénale du cadmium, un des problèmes majeurs de santé publique de ces dernières années car bien que le rein soit connu depuis plusieurs décennies comme étant la cible majeure de beaucoup des métaux lourds et en particulier du cadmium, des zones d ombre persistent quant à la survenue des événements conduisant à l apparition de troubles rénaux lors d une exposition chronique. Grâce à des expériences in vivo menées chez le rat, nous avons montré que lors d une exposition chronique chez l adulte aussi bien que chez le nouveau-né, une insuffisance rénale sévère apparaît, caractérisée par la diminution dramatique du débit de filtration glomérulaire accompagnée de l augmentation de l excrétion des principaux ions, plusieurs jours après l arrêt de la contamination. In situ, par immunofluorescence sur coupes de reins, nous avons mis en évidence que la survenue de cette insuffisance rénale s accompagne de changements morphologiques au niveau des jonctions cellulaires. Chez l adulte nous avons pu mettre en évidence une relation entre les troubles tardifs de la fonction rénale et une augmentation de la mort cellulaire par apoptose mesurée sur le rein entier. Ce travail a permis de montrer qu une contamination par le cadmium n est jamais sans risque pour le rein. En effet, ce métal peut s accumuler et induire de graves effets néphrotoxiques à long terme, entraînant l apparition d insuffisances rénales à n importe quel âge bien que les individus aient été soustraits de toute contamination.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Rôle de la protéine CFTR et du canal K+ TASK2 dans les phénomènes de régulation du volume des cellules du tubule proximal de rein de souris

Le but de cette étude était de comprendre d une part le mécanisme d activation du canal K+ TASK2 au cours de la RVD et d autre part le rôle de TASK2 et de CFTR dans un autre phénomène de régulation cellulaire intervenant durant l apoptose : l AVD (Apoptotic Volume Decrease). Pour cela, nous avons utilisé des lignées de cellules proximales provenant de rein de souris sauvages ou invalidées respectivement pour les gènes codant pour ces 2 protéines d intérêt (TASK2 et CFTR). Lors de l étude du mécanisme de régulation de TASK2 pendant la RVD (Regulatory Volume Decrease), nous avons montré que le choc hypotonique induit un flux de Cl- à travers du canal Cl- de type VRCC qui serait une driving force pour la sortie de HCO3- par l échangeur Cl-/HCO3- entraînant l alcalinisation du pH externe indispensable à l activation du canal TASK2. Lors de l étude du rôle de TASK2 et de CFTR dans l apoptose des cellules proximales, nous avons montré que l application d un agent apoptotique provoquerait un efflux de glutathion relié à l activité de CFTR ce qui permettrait une augmentation des ROS. Au final, cette élévation activerait, par un mécanisme encore inconnu, l augmentation des conductances Cl- de type VRCC et K+ de type TASK2 induisant ainsi une diminution du volume cellulaire indispensable à l entrée des cellules en apoptose. Par contre, dans les cellules task2 -/-, incapables de réguler leur volume lors d un choc hypotonique, nous avons pu mesurer une AVD et une activité de la caspase-3 réduites de 60% comparées aux cellules sauvages. Nous avons mis en évidence une compensation du canal TASK2 par un canal K+ de large conductance sensible au calcium, Maxi-K channel.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Thèse présentée pour obtenir le titre de docteur en sciences de la vie

Dans la première partie de ce travail, nous avons recherché l'influence de certains facteurs de stress (température, pourcentage en O2 dissous, etc.) sur la physiologie et le développement de l'espèce Dicentrarchus labrax. Nous avons observé une stimulation de la consommation d'oxygène des œufs en fonction du stade de développement et de l'augmentation de la température. Nous avons également étudié l'effet d'une hyper-oxygénation soutenue du milieu sur la physiologie des poissons et sur la morphologie des branchies. Dans la seconde partie de cette étude, nous nous sommes attachés à établir la participation des cellules respiratoires branchiales dans l'homéostasie du poisson. (...) Cette étude a permis de montrer l'existence de perméabilités C1 et K+ sur des cellules respiratoires de branchies en culture. Nous avons pu ainsi construire un modèle de fonctionnement de ces cellules assurant l'excrétion d'ions C1 et montrer leur participation dans l'homéostasie du poisson, rôle essentiellement attribué auparavant aux cellules à chlorure branchiales.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

CFTR (protéine de régulation)

Cette étude a permis de mettre en évidence deux aspects régulateurs de la protéine CFTR. En étudiant le rôle physiologique de CFTR dans les cultures primaires de reins de souris CFTR+/+ et CFTR -/-, nous avons démontré qu elle régule le volume cellulaire lors d un choc hypotonique. Ainsi, elle permet une sortie d ATP qui est hydrolysée en adénosine. L adénosine en se fixant sur les récepteurs de type A1 entraîne une entrée calcium sous membranaire nécessaire à l activation des canaux Cl-. Ce mécanisme disparaît dans les cultures de cellules de souris CFTR -/-. A l inverse du tubule distal, le tubule proximal n exprime pas de courant Cl- CFTR activés par l AMPc. Cette absence serait due à un épissage alternatif de l exon 10. Il conduit à une isoforme qui conserve ses propriétés de régulation du volume cellulaire. Chez la souris CFTR -/-, les courants Cl- volume dépendants sont présents et la perte de régulation du volume cellulaire est la conséquence d une absence de libération d ATP. Le deuxième aspect régulateur de CFTR concerne son intervention dans l apoptose par la modulation du pH intracellulaire. L apoptose induite par la lovastatine a été étudiée dans des lignées de fibroblaste de poumon de hamster. Nous avons démontré que l expression de CFTR augmentait le nombre de cellules apoptotiques en favorisant une meilleure acidification des cellules par une modulation de l échangeur Cl-/HC03-. En conclusion, CFTR n est pas un simple canal Cl- présent à la surface des cellules épithéliales, mais c est aussi une protéine de régulation complexe qui contrôle des mécanismes comme le maintien du volume cellulaire ou encore l activité des échangeurs dans le processus d apoptose.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF