Análise da resposta imune humoral humana a ATP difospomidrolase em Leishmaniose canina

-Introdução: O cão pode atuar como reservatório doméstico do protozoário Leishmania. Apirases (ou ATP difosfohidrolases) isoladas de formas promastigotas de {L. (L.) amazonensis} e {L. (V.) braziliensis} apresentam imunoreatividade cruzada com anticorpos anti-apirase de batata (Parasitology 135:327-335, 2008). Análises {in silico} permitiram observar uma relação evolucionária e estrutural entre a apirase de batata e proteínas hipotéticas encontradas nos genomas de {L. braziliensis}, {L. infantum} e {L. major}. Domínios conservados específicos foram preditos como potencialmente envolvidos na resposta imune (Parasitology, 135:943-953, 2008). Neste trabalho, a antigenicidade destes domínios conservados foi avaliada em cães com leishmaniose. Métodos e Resultados: Os níveis de anticorpos anti-apirase dos soros (dil. 1:40 a 1:320) de cães com leishmaniose (n= 37) ou cães saudáveis (n= 17) de área endêmica foram medidos por ELISA, em duplicatas, usando a proteína vegetal como antígeno. Soros de cães saudáveis de área não endêmica (n=13) foram usados como controle. Os níveis de IgG1 de cães saudáveis ou com leishmaniose, todos moradores de área endêmica, foram significativamente (P < 0,01) maiores que os níveis encontrados em cães saudáveis de área não endêmica. Os níveis de anticorpos IgG1 anti-apirase nos soros de cães saudáveis de área endêmica foram significativamente (P < 0,05) maiores que aqueles observados em soros de cães com leishmaniose. Altos níveis de anticorpos IgG2 foram observados em soros de cães saudáveis de área endêmica, significativamente (P < 0,01) maiores que aqueles observados em soros de cães com leishmaniose. Os animais doentes (n= 37) foram então classificados em assintomáticos (n= 11), oligoassintomáticos (n= 12) e sintomáticos (n= 14), e os níveis de anticorpos foram comparados. Interessantemente, em todas as diluições de soro testadas, os níveis de IgG2 em cães assintomáticos foram significativamente maiores (P < 0,01) que aqueles encontrados em cães oligoassintomáticos e em cães com leishmaniose clinicamente ativa. Conclusões: Os resultados sugerem que os domínios antigênicos compartilhados entre as apirases de batata e de Leishmanias poderão ser avaliados em propostas de imunodiagnóstico e/ou vacina

Análise da resposta imune humoral humana à ATP difosfohidrolase de pacientes com esquistossomose mansoni

-Introdução: Duas isoformas de ATP difosfohidrolases, uma solúvel e a outra associada à membrana, isoladas de ovos de S. mansoni, têm imunoreatividade cruzada com anticorpos anti-apirase de batata (Parasitology, 129:51-57, 2004). Em vista destes resultados preliminares, nós analisamos as estruturas primárias destas proteínas e a reatividade entre a apirase de batata e os soros de pacientes com esquistossomose. Métodos e Resultados: As seqüências primárias da apirase de batata, ATP difosfohidrolases de S. mansoni e de outros membros da família das ATP difosfohidrolases foram alinhadas, permitindo identificar os domínios compartilhados especificamente entre as proteínas do S. mansoni e do vegetal. Os epitopos para células B, bem como os peptídeos nonaméricos que têm a probabilidade de se ligar com alta afinidade a uma ou mais das 51 diferentes moléculas HLA-DR disponibilizadas em bancos de dados foram também identificados dentro destes domínios. Amostras de soros (dil. 1:50) de pacientes com esquistossomose (n= 62) e de indivíduos saudáveis (n= 16) foram então testadas em técnicas de ELISA usando a apirase de batata como antígeno. Significativa (p in silico sugeriram que os domínios compartilhados entre as proteínas do vegetal e as ATP difosfohidrolases do S. mansoni são capazes de estimular respostas imunes humoral e celular em pacientes com esquistossomose. A antigenicidade destes domínios foi confirmada pelos altos níveis de IgG e IgE detectados nas amostras de soros de pacientes com esquistossomose. O estudo destes domínios conservados e específicos poderá ser útil no desenvolvimento de vacinas e/ou métodos diagnósticos. Auxílio: CNPq, BIC/UFJF, PROBIC/FAPEMIG

Análise da resposta imune humoral humana a ATP difospomidrolase em pacientes com esquitossome mansoni, co-infectados ou não com ancilostomídeos

-Introdução: A infecção por ancilostomídeos tem recebido atenção especial devido ao seu papel imunomodulador na esquistossomose, interferindo na susceptibilidade de indivíduos de área endêmica. A reatividade positiva entre a apirase de batata e anticorpos IgE ou IgG de pacientes com esquistossomose sugeriu que os domínios compartilhados entre as proteínas da batata e do parasito são antigênicos. Como as áreas rurais endêmicas para Schistosoma mansoni que temos estudado têm alta prevalência de ancilostomídeos, a possível ocorrência de alterações causadas pela co-infecção sobre a resposta imune dirigida a estes domínios foi explorada. Métodos e Resultados: Os níveis de anticorpos IgG1, IgG4, IgA e IgE reativos com a apirase de batata foram avaliados por ELISA nos soros (dil. 1:50) de 62 crianças que tiveram o exame parasitológico de fezes positivo para ovos de S. mansoni e nenhum outro parasito em suas fezes. Os níveis destes anticorpos foram também avaliados em 27 crianças que estavam co-infectadas com S. mansoni e ancilostomídeos. Amostras de soros de 16 indivíduos saudáveis não moradores de área endêmica e não infectados com quaisquer parasitos foram usadas como Controle. Os resultados mostraram que pacientes com esquistossomose ou pacientes co-infectados com esquistossomose e ancilostomídeos apresentaram níveis de IgG1 e IgG4 similares entre eles, e significativamente (P < 0.001) maiores quando comparados aos níveis encontrados nos soros controle. Os níveis de IgA foram similares entre os pacientes mono- ou co-infectados. Por outro lado, os níveis de IgE em pacientes com esquistossomose foram significativamente (P < 0,05) maiores quando comparados àqueles encontrados no grupo de pacientes co-infectados com S. mansoni e ancilostomídeos (P < 0,001) ou no grupo Controle (P < 0,05). Conclusões: Os níveis de IgE, uma imunoglobulina relacionada à proteção do hospedeiro na esquistossomose, foram reduzidos em pacientes co-infectados. Nossos resultados estimulam o estudo do papel dos domínios compartilhados entre as proteínas do vegetal e do parasito na susceptibilidade ou resistência à esquistossomose

Localização ultraestrutural da Nucleosídeo Trifosfato Dfosfohidrolase 1 (NTPDase 1) antigênica de Leishmania (Viannia) braziliensis

An NTPDase activity was previously characterized in L. (V.) braziliensis promastigote forms (Lb). In this work, its localization ultrastructural was obtained by cytochemical techniques, using a JEM-1011 electron microscope. Enzyme activity was found distributed as an electron dense cerium phosphate deposit at the surface of the plasma membrane, at mitochondrial membrane, kinetoplast, flagellar pocket and flagellum of Lb when they were incubated in standard reaction medium with ATP, ADP or GDP, and in the presence of classical ATPase, phosphatase and nucleotidase inhibitors. A polypeptide belonging to the conserved domain B from the potato apyrase, homologue to the domain B from the Lb NTPDase 1 isoform, was then obtained as a 6xHis tag polypeptide (r-potDomain B), which was inoculated in BALB/c mice. Polyclonal anti-r-potDomínio B antibodies, when immobilized on Protein A-Sepharose, immunoprecipitated 43-46% of the ATPase and ADPase activities from the parasite preparation. By Western blots, the immune serum recognized band of 48 kDa in both parasite preparations and immunoprecipitated complex, confirming the NTPDase 1 identity. Serum samples of American cutaneous leishmaniasis (ACL) patients were tested in ELISA using r-potDomain B as coating antigen. The IgG1 (0.077 0.059) or IgG3 (0.020 0.024) antibody reactivity of ACL patients was significantly (P < 0.05) higher when compared to the control (IgG1, 0.047 0.029, cut-off, 0.105; IgG3, 0.010 0.009, cut-off, 0.029), and 9-10 (30-33%) of the 30 patients were seropositive for r-potDomain B. The IgG2 (0.054 0.064; 17% seropositivity, 5/30) or IgG4 (0.077 0.031; 23% seropositivity, 7/30) antibody reactivity of ACL patients was similar to the control (IgG2, 0.050 0.021, cut-off, 0.092; IgG4, 0.059 0.023, cut-off, 0.105). These results suggested that the domain B (r82-121) from the L. (V.) braziliensis NTPDase 1 is potentially involved in the host immune response. In ultrastructural and immunocytochemical study, polyclonal anti-r-potDomain B antibodies identified the NTPDase 1 isoform on the parasite surface and, also, at mitochondrial membrane, kinetoplast, flagellar pocket and flagellum. These results suggested that phosphohydrolytic activity from the parasite NTPDase 1 is possibly associated with nutrient recuperation and/or as a protective mechanism against the host organism under conditions that involve nucleotides. Additionally, polyclonal anti-r-potDomain B antibodies (A) inhibited 22-72% of the ATPase and ADPase activities from the total Lb preparation, and (B) after complement system inactivation, and used in MTT cell proliferation assays, significantly inhibited 42% of the promastigote growth after 24 h of incubation, when compared to the cell growth in medium alone, or in the presence of serum from healthy mouse or rabbit. The domain B (r82-121) from the L. (V.) braziliensis NTPDase 1 is a new therapeutic target. The recombinant r-potDomain B polypeptide and antibodies produced against it could be useful in studies of this parasite protein and American cutaneous leishmaniasis.Uma atividade NTPDásica foi previamente caracterizada em formas promastigotas de L. (V.) braziliensis (Lb). Neste trabalho, sua localização ultraestrutural foi obtida por técnicas de citoquímica, usando um microscópio eletrônico JEM-1011. A atividade enzimática foi encontrada distribuída como um depósito de fosfato de cério eletrodenso na superfície da membrana plasmática, membrana mitocondrial, cinetoplasto, bolsa flagelar e flagelo de Lb, quando foram incubados em meio de reação padrão com ATP, ADP ou GDP, e na presença de inibidores clássicos de ATPases, fosfatase e nucleotidase. Um polipeptídio originado do domínio B conservado da apirase de batata, homólogo ao domínio B da isoforma NTPDase 1 de Lb, foi então obtido como um polipeptídio com cauda de hexahistidina (r-potDomínio B), o qual foi inoculado em camundongos BALB/c. Anticorpos policlonais anti-r-potDomínio B, quando imobilizados em Proteína A-Sepharose, imunoprecipitaram 43-46% das atividades ATPásica e ADPásica de preparação de Lb. Por ―Western blots‖, o soro imune reconheceu banda de 48 kDa na preparação de Lb e no complexo imunoprecipitado, confirmando a identidade da isoforma NTPDase 1. Amostras de soros de pacientes com leishmaniose cutânea (ACL) foram testados em ELISA, usando r-potDomínio B como antígeno. A reatividade de anticorpos IgG1 (0,077 0,059) ou IgG3 (0,020 0,024) de pacientes com ACL foi significativamente (P < 0,05) maior quando comparado ao controle (IgG1, 0,047 0,029, ponto de corte, 0,105; IgG3, 0,010 0.009, ponto de corte, 0,029), e 9-10 (30-33%) dos 30 pacientes foram soropositivos para r-potDomínio B. A reatividade de anticorpos IgG2 (0,054 0,064; 17% de soropositividade, 5/30) ou IgG4 (0,077 0,031; 23% de soropositividade, 7/30) de pacientes com ACL foi similar ao controle (IgG2, 0,050 0,021, ponto de corte, 0,092; IgG4, 0,059 0,023, ponto de corte, 0,105). Estes resultados sugeriram que o domínio B (r82-121) da NTPDase 1 de L. (V.) braziliensis está potencialmente envolvido na resposta imune do hospedeiro. Em estudo ultraestrutural e imunocitoquímico, os anticorpos policlonais anti-r-potDomínio B identificaram a isoforma NTPDase 1 na superfície do parasito e, também, na membrana mitocondrial, cinetoplasto, bolsa flagelar e flagelo. Estes resultados sugeriram que a atividade fosfohidrolítica da NTPDase 1 do parasito está possivelmente associada à recuperação de nutrientes e/ou a mecanismo protetor contra o organismo hospedeiro sob condições que envolvam nucleotídeos. Adicionalmente, anticorpos policlonais anti-r-potDomínio B (A) inibiram 22-72% das atividades ATPásica e ADPásica da preparação total de Lb; e (B) após inativação do sistema complemento, e usados em ensaios de proliferação celular pelo método MTT, inibiram significativamente 42% do aumento de promastigotas após 24 h de incubação, quando comparado à cultura na ausência de soro, ou na presença de soro de camundongo ou coelho saudável. Estes resultados sugerem que o domínio B (r82-121) da NTPDase 1 de L. (V.) braziliensis é um novo alvo terapêutico. O polipeptídio recombinante r-potDomínio B e anticorpos produzidos contra ele poderão ser úteis em estudos desta proteína do parasito e da leishmaniose cutânea

NTPDase 1 de Leishmania braziliensis como um alvo terapêutico: imunolocalização em formas promastigotas e amastigotas e susceptibilidade à Leishmanicidas

Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) activity was recently characterized in Leishmania (Viannia) braziliensis promastigotes (Lb), and an antigenic conserved B domain (r82-121) from the specific NTPDase 1 isoform was identified. In this work, mouse polyclonal antibodies produced against two synthetic peptides belonging to this domain (LbB1LJ, r82-103; LbB2LJ, r102-121), and antibodies produced against peptides potB1LJ and potB2LJ, with high identity to the LbB1LJ and LbB2LJ respectively, were used as tools for studies of this protein. The anti-LbB1LJ or anti-LbB2LJ antibody, immobilized on Protein A-Sepharose, immunoprecipitated the NTPDase 1 of 48 kDa and depleted approximately 40% of the phosphohydrolytic activity from detergent-homogenized Lb preparation. By ultrastructural immunocytochemical microscopy, using anti-LbB1LJ, anti-LbB2LJ or anti-potB1LJ antibody, the NTPDase 1 was identified on the surface, subcellular cytoplasmic vesicles, mitochondria, kinetoplast, flagellum and flagellar pocket, and nucleus of promastigotes. In addition, the NTPDase 1 was isolated from the promastigotes mitochondrial fraction by nondenaturing gel, and its expression and identity were confirmed by enzyme activity measurements, Western blots and mass spectrometry. The ATPase and ADPase activities of detergent-homogenized preparation were partially inhibited by anti-LbB1LJ or anti-potB1LJ antibody (43-79%), which was more effective than that inhibition by anti-LbB2LJ or anti-potB1LJ antibody (18-60%). In addition, the immune sera anti-LbB1LJ or anti-potB1LJ (67-73%) and anti-LbB2LJ or anti-potB2LJ (33-40%) were cytotoxic, and significantly reduce the promastigotes growth in vitro. By Western blots and confocal microscopy laser scanning analyses, the antibodies produced against B domain confirmed the expression and identity of the intracellular amastigotes NTPDase 1 and, also, in free amastigotes recovered from Vero cells. All taken together, the results appoint the conserved B domain from the L. (V.) braziliensis NTPDase 1 as an important target for inhibitor design and the potential application of these biomolecules in experimental protocols of disease control. The N-alkylaminoalkanethiosulfuric acids, which did not have in vitro or in vivo cytotoxic effect, reduced in vitro intracellular amastigotes proliferation, the most effective being the SIPA, SSEC and IBSS, with IC50 24-35 μM. The NPSO, SXIP and TBSO were less effective, with IC50 54 to >100 μM. TBSO exception, all the other AAATs partially inhibited the ATPase and/or ADPase activity from the promastigotes preparation. The SIPA also was an effective antileishmanial when tested on the amastigotes recovered from the Vero cells, with IC50 20 μM and, in addition, it was capable to reduce the ATPase and ADPase activities from the homogenized of these parasites suggesting a Ki 10-100 μM. Furthermore, SIPA 30 μM significantly reduced 28% of the mitochondrial membrane potential, and it could be one of the mechanisms by which AAATs are antileishmanial compounds. The NTPDase 1 may play a key role in the mitochondrial activity, a new hypothesis to be explored, and target of AAATs, which were tested for the first time on the trypanosomatids and characterized in this work as new antileishmanial compounds.A atividade catalítica de nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase (NTPDase) foi recentemente caracterizada em promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb), e o domínio B (r82-121) antigênico e conservado, específico da NTPDase 1 foi identificado. Neste trabalho, anticorpos policlonais de camundongos produzidos contra dois peptídeos sintéticos derivados deste domínio (LbB1LJ, r82-103; LbB2LJ, r102-121), e anticorpos produzidos contra os peptídeos potB1LJ e potB2LJ, de alta identidade com LbB1LJ e LbB2LJ respectivamente, foram usados como ferramentas de estudo desta proteína. Os anticorpos anti-LbB1LJ ou anti-LbB2LJ, imobilizados em proteína A-Sepharose, imunoprecipitaram a NTPDase 1 de 48 kDa, e depletarem aproximadamente 40% da atividade fosfohidrolítica da preparação de Lb homogeneizada em detergente. Por imunocitoquímica e análise ultraestrutural, usando os anticorpos anti-LbB1LJ, anti-LbB2LJ ou anti-potB1LJ, a NTPDase 1 foi identificada na superfície, vesículas citoplasmáticas, mitocôndria, cinetoplasto, flagelo e bolsa flagelar, e núcleo de promastigotas. Em adição, a NTPDase 1 foi isolada de fração mitocondrial de promastigotas por gel não desnaturante, e sua expressão e identidade foram confirmadas por medidas de atividade enzimática, “Western blots” e espectrometria de massas. As atividades ATPásica e ADPásica da preparação de Lb homogeneizada em detergente foram parcialmente inibidas por anticorpos anti-LbB1LJ ou anti-potB1LJ (43-79%), sendo mais efetivos que a inibição por anticorpos anti-LbB2LJ ou anti-potB2LJ (18-60%). Em adição, os soros imunes anti-LbB1LJ ou antipotB1LJ (67-73%) e anti-LbB2LJ ou anti-potB2LJ (33-40%) foram citotóxicos, reduzindo significativamente o crescimento de promastigotas in vitro. Em “Western blots” e por análises em microscópio confocal de varredura a laser, os anticorpos produzidos contra o domínio B confirmaram a expressão e identidade da NTPDase 1 em amastigotas intracelulares e, também, amastigotas livres recuperadas de células Vero. Em conjunto, os resultados apontam o domínio B conservado da NTPDase 1 de Leishmania (V.) braziliensis como um importante alvo para o desenho de inibidores e a aplicação potencial dessas biomoléculas em protocolos experimentais de controle da leishmaniose. Os ácidos N-alquilaminoalcanotiossulfúricos (AAATs), os quais não têm efeito citotóxico in vitro ou in vivo, reduziram a proliferação in vitro de amastigotas intracelulares, sendo os mais efetivos o SIPA, SSEC e IBSS com CI50 de 24-35 μM. O NPSO, SXIP e TBSO foram menos efetivos com CI50 de 54 a >100 μM. Com exceção do TBSO, todos os outros AAATs inibiram parcialmente a atividade ATPásica e/ou ADPásica da preparação de promastigotas. O SIPA foi também um efetivo leishmanicida quando testado sobre amastigotas recuperadas de células Vero, com CI50 20 μM e, em adição, foi capaz de reduzir as atividades ATPásica e ADPásica de homogeneizado destes parasitos sugerindo um Ki de 10-100 μM. Além disso, SIPA 30 μM reduziu significativamente 28% do potencial de membrana mitocondrial, podendo ser este um dos mecanismos pelo qual os AAATs são leishmanicidas. A NTPDase 1 pode ter um papel fundamental na atividade mitocondrial, uma nova hipótese a ser explorada, e ser o alvo dos AAATs, os quais foram testados pela primeira vez em tripanosomatídeos e caracterizados neste trabalho como novos compostos leishmanicidas

Evaluation of methods for detection of asymptomatic individuals infected with Leishmania infantum in the state of Piauí, Brazil.

BACKGROUND:Visceral Leishmaniasis in humans presents with fever, anemia, and splenomegaly and can be lethal if not treated. Nevertheless, the majority of Leishmania infantum-infected individuals does not manifest symptoms and remain so provided they are not immunosuppressed. In this work, the performance of different tests was evaluated to detect asymptomatic individuals who were living in Teresina, Piauí state, Brazil, an endemic area for VL. METHODOLOGY:L. infantum-specific antibodies were detected by ELISA and two different rapid immunochromatographic (IC) diagnostic tests, Kalazar Detect and OnSite, and parasitic loads were detected by real time PCR [qPCR]. Additionally, we measured levels of the biomarkers monokine induced by IFN-γ (MIG) and IFN-γ-induced protein 10 (IP-10) before and after stimulation of whole blood with soluble Leishmania antigen [SLA]. PRINCIPAL FINDINGS:Kalazar Detect and OnSite detected, respectively, 76% and 64% of patients presenting with active Visceral Leishmaniasis; 50% and 57% of patients remained positive in these tests, respectively, after treatment. Of the healthy participants in the study who were living in the endemic area, only 1.7% were positive with both of the IC tests. On the other hand, reactivity in ELISA tests revealed that 13% of these individuals presented asymptomatic infections; among VL patients, 84% presenting with active disease were reactive in ELISA, and after treatment, 55.5% were seropositive. L. infantum DNA was present in the blood of 37.9% of infected individuals living in the endemic area, while IP-10 and MIG biomarkers were detected in 26.7% of them. The greatest concordance of positivity occurred between ELISA and qPCR. CONCLUSION:The association of different techniques can detect asymptomatic infections, however, more research is necessary to develop ideal biomarkers that are simple to use in the clinic and in field studies in areas endemic for Visceral Leishmaniasis

Total serum N-glycans mark visceral leishmaniasis in human infections with Leishmania infantum

Summary: Visceral leishmaniasis (VL) is a clinical form of leishmaniasis with high mortality rates when not treated. Diagnosis suffers from invasive techniques and sub-optimal sensitivities. The current (affordable) treatment with pentavalent antimony as advised by the WHO is possibly harmful to the patient. There is need for an improved diagnosis to prevent possibly unnecessary treatment. N-glycan analysis may aid in diagnosis. We evaluated the N-glycan profiles from active VL, asymptomatic infections (ASYMP) and controls from non-endemic (NC) and endemic (EC) areas. Active VL has a distinct N-glycome profile that associates with disease severity. Our study suggests that the observed glycan signatures could be a valuable additive to diagnosis and assist in identifying possible markers of disease and understanding the pathogenesis of VL. Further studies are warranted to assess a possible future role of blood glycome analysis in active VL diagnosis and should aim at disease specificity

NTPDase 1 de Leishmaniabraziliensis como um alvo terapêutico: Estudos dos mecanismos pelos quais os ácidos alquilaminoalcanotiossulfúricos são antileishmaniais

A proteína nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1 (NTPDase 1) de Leishmania(Viannia) braziliensis(Lb) foi recentemente identificada como antigênica e está presente em formas promastigota e amastigota deste protozoário, sendo um possível alvo de drogas. Compostos pertencentes à série dos ácidos N-alquilaminoalcanotiossulfúricos (AAATs), de baixa toxicidade para mamíferos, foram caracterizados como novos antileishmaniais. O estudo de seus modos de ação foi iniciado, e neste trabalho os efeitos de AAATs sobre a atividade fosfohidrolítica da preparação de promastigotas são demonstrados. O ácido 2-(sec-butilamino)-1-octanotiossulfúrico (SSEC) inibe significativamente as atividades ATPásica e ADPásica da preparação de promastigotas (Ki 10-1000 µM), enquanto o ácido 1-(terc-butilamino)-2-etanotiossulfúrico (TBSO) foi menos efetivo. Adicionalmente, estudos preditivos de carga líquida do SSEC em função do pH foram efetuados e, em uma variação de pH de 1 a 8, o estado de ionização deste composto é identicamente mantido. A lipofilia do SSEC conferida pela cadeia carbônica, associada à carga positiva conferida pelo grupo amino, sugere a translocação do composto através de membranas atuando em organelas intracelulares, bem como interagindo com o parasito. A NTPDase 1 pode ser apontada como um novo alvo terapêutico e o SSEC poderá ser explorado em novos protocolos experimentais de leishmanioses

Leishmania infantum nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 (NTPDase 1) B-domain : antibody antiproliferative effect on the promastigotes and IgG subclass responses in canine visceral leishmaniasis.

A nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (NTPDase 1) was identified on the surface, flagellum and kinetoplast from L. infantum promastigotes by immunocytochemistry and confocal laser scanning microscopy, using immune sera that recognized specifically the B domain of NTPDase 1 and produced against synthetic peptides (LbB1LJ and LbB2LJ) derived from this domain. The polyclonal antibodies had effective antileishmanial effect, reducing significantly in vitro promastigotes growth (21?25%), an antiproliferative effect also demonstrated by immune sera produced against recombinant r-pot B domain, and two other synthetic peptides (potB1LJ and potB2LJ). In addition, using these biomolecules in ELISA technique, IgG1 and IgG2 subclasses reactivities of either healthy dogs or infected by L. infantum and classified clinically as asymptomatic, oligosymptomatic and symptomatic were tested. Analysis of distinct IgG1 and IgG2 seropositivities patterns suggested antibody subclasses binding epitopes along B domain for protection against infection, indicating this domain as a new tool for prophylactic and immunotherapeutic investigations

Purificação da nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1 (NTPDase 1) antigênica de Leishmania infantum

As NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases) são enzimas que hidrolisam nucleosídeos di- e trifosfatados sob ativação de íons bivalentes. Uma atividade NTPDásica foi caracterizada em promastigotas de Leishmania infantum, um protozoário causador de leishmaniose visceral.Neste trabalho, a NTPDase 1 foi purificada de preparação de promastigotas usando como estratégia eletroforese em gel não-desnaturante e os detergentes deoxicolato de sódio e Triton X-100, os quais preservam a atividade fosfohidrolítica desta enzima. Após eletroforese, incubação do gel com ATP e inibidor de ATPases do tipo P permitiu a visualização de uma única banda com depósito branco de fosfato de cálcio. Esta banda ativa foi isolada e por SDS-PAGE e coloração pela prata foi identificada como polipeptídeos de 50 e 47 kDa. Por Western blot, os dois polipeptídeos foram reconhecidos pelo soro imune anti-LbB1LJ, o qual reconhece especificamente a porção N-terminal do domínio B de NTPDases 1 de Leishmania. Por espectrometria de massas, a identidade da NTPDase 1 foi confirmada pela identificação de seis peptídeos trípticos coincidentes com a NTPDase 1 anotada em seu genoma (NCBI gi|134068433), uma cobertura de 19% de sua sequência primária. As atividades ATPásica (555 ± 93 nmol Pi x mg-1 x min-1) e ADPásica (644 ± 38 nmol Pi x mg-1 x min-1) revelaram um índice de purificação de aproximadamente 62 vezes e uma razão de atividade ATPase/ADPase de aproximadamente 1, confirmando a efetividade desta estratégia para o isolamento da NTPDase 1 de promastigotas de L. infantum