Estudio funcional de variantes en el gen GLA: implicación en la heterogeneidad clínica de la enfermedad de Fabry y en su tratamiento

La enfermedad de Fabry (EF) es una alteración de acúmulo lisosomal producida por una deficiencia de la enzima lisosomal ¿-galactosidasa A. Este defecto conlleva a la acumulación de glucoesfingolípidos, Gb3 de forma mayoritaria, en los lisosomas de varios tejidos; principalmente en el epitelio vascular, renal, cardíaco y el sistema nervioso. De acuerdo con el tipo de mutación en el gen GLA (gen que codifica para la síntesis de la ¿-galactosidasa A) y el inicio de las manifestaciones clínicas, los casos de EF se clasifican en dos tipos de fenotipos: el tardío y el clásico. Las manifestaciones clínicas del fenotipo clásico en los varones, incluyen las acroparestesisas; angioqueratomas; hipohidrosis; opacidad corneal y lenticular; disfunción cardiaca; alteraciones renales y del sistema nervioso central. Las mujeres portadoras pueden ser asintomáticas o llegar a desarrollar el fenotipo clásico debido al fenómeno de inactivación del cromosoma X. El diagnóstico en la EF, probablemente, está subestimado debido a la naturaleza no específica de las manifestaciones clínicas asociadas a la enfermedad. El tratamiento en las primeras fases de desarrollo de la enfermedad es muy importante para la mejora de calidad de vida del paciente e impedir secuelas irreversibles. Hasta la fecha se han descrito más de 600 mutaciones causales de EF (ver enlaces), además el gen GLA presenta siete variantes fisiológicas de ayuste alternativo y la alteración del patrón de ayuste, se genera por una gran cantidad de esas mutaciones. Las mutaciones exónicas pueden también alterar el patrón de ayuste, pero no son reconocidas fácilmente. Han sido descritas un gran número de variantes polimórficas del gen GLA pero no se ha demostrado si la herencia de haplotipos formados por la combinación de estas variantes puede causar EF. El haplotipo complejo intrónico (HCI) dentro del gen GLA (IVSO-10C>T, IVS2-76_80del5, IVS4-16A>G, IVS6-22C>T) ha sido asociado a neuropatía de fibra fina y en un estudio de cribado el 8,9% de sujetos con síntomas de EF presenta este haplotipo. El haplotipo IVS2-76_80del5, IVS4-16A>G, IVS6-22C>T ha sido detectado en pacientes con afectación renal. Por otra parte la mutación G183V también ha sido asociada a la EF; esta mutación se encuentra en la junta del exón 3 con el 4 en la región codificante del gen GLA, causando el cambio de aminoácido 183 en la secuencia proteica de la enzima y posiblemente un patrón aberrante de ayuste. La identificación de los pacientes de Fabry en la población general está dificultada por la baja prevalencia de la enfermedad y la naturaleza heterogénea de sus síntomas. El diagnóstico viene determinado por niveles bajos de actividad enzimática y confirmado por el estudio mutacional. El problema es que la enfermedad carece de biomarcadores que reflejen el estado del paciente. El análisis enzimático no es adecuado para el diagnóstico y seguimiento de mujeres heterocigotas, ya que la expresión de la enzima depende del patrón de activación del cromosoma X, o para varones con variantes atípicas de la enfermedad en los que la actividad residual es muy alta. No existe una relación entre el genotipo y el fenotipo que presentan los pacientes. La terapia principal de la enfermedad se basa en la administración de la enzima recombinante humana por vía intravenosa. Aunque la respuesta a la terapia en muchos casos es buena, no refleja una mejora en todas las morbilidades asociadas a la EF. Existen indicios de que hay otros mecanismos implicados en el desarrollo de la enfermedad y el conocimiento molecular de esos mecanismos, puede permitir identificar nuevas dianas terapéuticas para la mejora de la calidad de vida de los pacientes con EF. Teniendo en cuenta estos hechos nos planteamos los siguientes objetivos: 1.-Caracterizar funcionalmente las variantes del haplotipo complejo intrónico (IVSO-10C>T, IVS2-76_80del5, IVS4-16A>G, IVS6-22C>T) y G183V encontradas en un grupo de individuos con y sin síntomas y signos de EF y profundizar en los mecanismos moleculares patológicos relacionados con las diferentes manifestaciones clínicas de la enfermedad. 2.-Identificar los mecanismos epigenéticos relacionados con las diferentes variantes clínicas de la EF. 3.-Buscar nuevos biomarcadores de diagnóstico y seguimiento de la enfermedad. 4.-Realizar una prueba de concepto de aplicación de fármacos hipometilantes en líneas primarias de fibroblastos en la EF

Estudio de factores genéticos de susceptibilidad para el desarrollo de enfermedad de Parkinson

Los avances alcanzados en las últimas décadas respecto a la etiología y fisiopatología de la enfermedad de Parkinson (EP), han sido espectaculares. Los estudios publicados en los últimos años sugieren una posible asociación entre la EP y factores genéticos de susceptibilidad implicados en el desarrollo de la enfermedad, como la presencia de mutaciones en el gen que codifica para la glucocerebrosidasa (GBA), responsables de la enfermedad de Gaucher (EG). En los últimos años, ha aparecido un número creciente de publicaciones que revelan la propensión de una minoría de pacientes de EG a desarrollar EP. La aparición de una variante de EP de comienzo temprano en pacientes con EG, motivó la realización de estudios de prevalencia de mutaciones en el gen GBA en diversas poblaciones de pacientes con EP, con el objetivo de analizar las alteraciones genéticas y las características clínicas asociadas, así como detectar factores que permitan identificar los casos de forma precoz. Aunque la EP ha sido considerada durante mucho tiempo como un trastorno no genético de origen esporádico, estudios recientes han demostrado la importancia de las contribuciones genéticas a la EP, demostrando que los factores genéticos constituyen factores de susceptibilidad o modificadores de la enfermedad, afectando a la penetrancia, edad de inicio, gravedad y progresión de la misma. Es conocido que la presencia del alelo E4 del gen apoE puede inducir una susceptibilidad genética para el desarrollo de varios procesos neurodegenerativos, entre los que se encuentra la EP. Teniendo en cuenta esto hechos, los objetivos planteados en este trabajo fueron: 1.- Conocer si alguna de las isoformas de la apolipoproteína E produce susceptibilidad para el desarrollo de EP, en una población de pacientes de la Comunidad Autónoma de Aragón. 2.- Evaluar si la presencia de variantes en el gen GBA puede constituir un factor de susceptibilidad genética para el desarrollo de EP, o provocar un inicio precoz de la enfermedad, en pacientes de la Comunidad Autónoma de Aragón. 3.- Explorar si la presencia de variantes en los genes GBA y apoE influye en el comportamiento clínico de los pacientes con EP. 4.- Identificar si existen factores ambientales que determinen mayor susceptibilidad para el desarrollo de EP. Para el desarrollo de estos estudios, se utilizaron técnicas de biología molecular: análisis in silico de secuencias genómicas, amplificación de fragmentos genómicos por PCR, digestión con enzimas de restricción, secuenciación, pirosecuenciación, y análisis estadístico. De los resultados obtenidos en el presente estudio se deducen las siguientes conclusiones: 1.- El análisis de las isoformas de la apolipoproteína E demuestra que éstas no constituyen un factor de susceptibilidad para el desarrollo de enfermedad de Parkinson. 2.- La frecuencia alélica de la mutación N370S en el gen GBA en población aragonesa es 0,0023, mientras que la frecuencia alélica de la mutación L444P es 0,0008. Ambas representan las mutaciones más frecuentes responsables de la enfermedad de Gaucher en España y su incidencia es similar a la observada en otras poblaciones de origen no judío Ashkenazi. 3.- La incidencia global de portadores de variantes en el gen GBA es el doble en el grupo de pacientes con enfermedad de Parkinson respecto al grupo control de población general. 4.- Entre las variantes encontradas en el grupo de pacientes con enfermedad de Parkinson, la variante T369M presentó doble incidencia respecto al grupo control, mientras que las variantes L444P y E326K se han detectado exclusivamente entre los pacientes con enfermedad de Parkinson. La incidencia de la mutación L444P en el grupo de pacientes con enfermedad de Parkinson ha sido tres veces superior a la encontrada en población aragonesa. 5.- En el grupo de pacientes analizado no se ha encontrado la mutación N370S. Por el contrario, la incidencia de esta mutación en el grupo control fue similar a la encontrada en población general aragonesa. 6.- Se ha encontrado que la variante c.(-203)A>G del gen GBA, descrita previamente en pacientes con enfermedad de Gaucher, presentaba una incidencia de 4,6% en el grupo control de población general, lo que confirma que se trata de un polimorfismo. No se ha encontrado relación de este polimorfismo con la aparición de enfermedad de Parkinson. 7.- Los resultados encontrados en población aragonesa con respecto a la incidencia de mutaciones en GBA en pacientes con enfermedad de Parkinson, son similares a los descritos en otras poblaciones europeas. 8.- La presencia de la mutación L444P en el gen GBA constituye un factor de susceptibilidad genética para el inicio precoz de la enfermedad de Parkinson, en el grupo de pacientes estudiado. 9.- Existe una gran heterogeneidad en las manifestaciones clínicas de los pacientes portadores de variantes en el gen GBA. No hemos observado una relación clara entre el genotipo del gen GBA y el fenotipo encontrado en los pacientes con enfermedad de Parkinson. 10.- En nuestro estudio, la exposición a agentes tóxicos, los empastes dentales de amalgama de mercurio y los antecedentes familiares de enfermedad de Parkinson, constituyen factores de riesgo para el desarrollo de la enfermedad, aunque ninguno de ellos se asocia significativamente con el inicio precoz de la misma

Removing Lipemia in Serum/Plasma Samples: A Multicenter Study.

Lipemia, a significant source of analytical errors in clinical laboratory settings, should be removed prior to measuring biochemical parameters. We investigated whether lipemia in serum/plasma samples can be removed using a method that is easier and more practicable than ultracentrifugation, the current reference method. Seven hospital laboratories in Spain participated in this study. We first compared the effectiveness of ultracentrifugation (108,200×g) and high-speed centrifugation (10,000×g for 15 minutes) in removing lipemia. Second, we compared high-speed centrifugation with two liquid-liquid extraction methods-LipoClear (StatSpin, Norwood, USA), and 1,1,2-trichlorotrifluoroethane (Merck, Darmstadt, Germany). We assessed 14 biochemical parameters: serum/plasma concentrations of sodium ion, potassium ion, chloride ion, glucose, total protein, albumin, creatinine, urea, alkaline phosphatase, gamma-glutamyl transferase, alanine aminotransferase, aspartate-aminotransferase, calcium, and bilirubin. We analyzed whether the differences between lipemia removal methods exceeded the limit for clinically significant interference (LCSI). When ultracentrifugation and high-speed centrifugation were compared, no parameter had a difference that exceeded the LCSI. When high-speed centrifugation was compared with the two liquid-liquid extraction methods, we found differences exceeding the LCSI in protein, calcium, and aspartate aminotransferase in the comparison with 1,1,2-trichlorotrifluoroethane, and in protein, albumin, and calcium in the comparison with LipoClear. Differences in other parameters did not exceed the LCSI. High-speed centrifugation (10,000×g for 15 minutes) can be used instead of ultracentrifugation to remove lipemia in serum/plasma samples. LipoClear and 1,1,2-trichlorotrifluoroethane are unsuitable as they interfere with the measurement of certain parameters