Directed evolution of adeno-associated viruses for efficient gene transfer in the visual system

Les virus adéno-associés (AAVs) font partie des vecteurs les plus efficaces pour le transfert de gène, en particulier dans la rétine. Ils sont utilisés aussi bien pour des études biologiques que pour la thérapie génique. Malgré cela, il reste encore des barrières qui limitent leur utilisation. Nous proposons ici d’utiliser une technique d’évolution dirigée pour surmonter ces barrières et améliorer l’efficacité des AAVs en tant que vecteurs de gènes. Dans un premier temps, nous avons créé trois librairies virales hautement diversifiées basées sur l’AAV2. Ces librairies étaient constituées de capsides modifiées aléatoirement pour leur donner de nouvelles propriétés. Nous avons ensuite réalisé deux types de sélections. D’une part, nous avons sélectionné nos librairies virales dans le système visuel de la souris pour obtenir une capside capable de transport axonal antérograde trans-synaptique afin de pouvoir étudier simultanément l’activité et la connectivité de réseaux neuronaux. Cette sélection a fortement convergée vers une capside nommée AAV2-7mD, dont la capacité de transport axonal antérograde trans-synaptique est plus efficace que les AAVs 1 et 2. D’autre part, nous avons sélectionné nos librairies virales directement sur des explants de maculas de rétine humaine afin découvrir une capside capable de traverser la membrane limitante interne de la macula humaine. Ceci a pour but d’avoir un vecteur efficace pour des traitements de thérapie génique par voie intra-vitréenne. Cette librairie a commencé à converger mais nous sommes toujours en attente du dernier cycle de sélection. Nous traitons donc dans cette thèse des résultats de deux évolutions dirigées sur l’AAV2 afin de créer des vecteurs de gènes plus performants dans le système visuel.Adeno-associated viruses (AAVs) are among the most efficient vectors for gene transfer, particularly in the retina. They are used for asking biological questions as well as for gene therapy. Nonetheless, some barriers are still restraining their use. Here, we used a directed evolution method to overcome those barriers and improve the efficiency of AAVs for gene transfer. First, we created three highly diversified viral libraries based on AAV2. Those libraries were based on randomly modified capsids displaying new properties. Then, we did two types of selections. On one hand, we selected our libraries in the retinofugal pathway in order to obtain a capsid with enhanced axonal anterograde trans-synaptic transport capacities, so we could study simultaneously the activity and the connectivity of neuronal networks between the retina and the brain. This selection converged strongly toward a new capsid, named AAV2-7mD, with enhanced axonal anterograde trans-synaptic transport capacities compared to AAV1 and AAV2. On the other hand, we directly selected our viral libraries on human macular explants, to select capsids capable of crossing the human macular inner limiting membrane. Such a capsid would be very useful for retinal gene therapy via intravitreal injections. This library started to converge but we are still waiting to complete the last cycle of selection. In this thesis we discuss the results of these two directed evolution studies on AAV2 to create enhanced gene delivery vectors in the visual system

Evolution dirigée de virus adéno-associés pour un transfert de gène efficace dans le système visuel

Adeno-associated viruses (AAVs) are among the most efficient vectors for gene transfer, particularly in the retina. They are used for asking biological questions as well as for gene therapy. Nonetheless, some barriers are still restraining their use. Here, we used a directed evolution method to overcome those barriers and improve the efficiency of AAVs for gene transfer. First, we created three highly diversified viral libraries based on AAV2. Those libraries were based on randomly modified capsids displaying new properties. Then, we did two types of selections. On one hand, we selected our libraries in the retinofugal pathway in order to obtain a capsid with enhanced axonal anterograde trans-synaptic transport capacities, so we could study simultaneously the activity and the connectivity of neuronal networks between the retina and the brain. This selection converged strongly toward a new capsid, named AAV2-7mD, with enhanced axonal anterograde trans-synaptic transport capacities compared to AAV1 and AAV2. On the other hand, we directly selected our viral libraries on human macular explants, to select capsids capable of crossing the human macular inner limiting membrane. Such a capsid would be very useful for retinal gene therapy via intravitreal injections. This library started to converge but we are still waiting to complete the last cycle of selection. In this thesis we discuss the results of these two directed evolution studies on AAV2 to create enhanced gene delivery vectors in the visual system.Les virus adéno-associés (AAVs) font partie des vecteurs les plus efficaces pour le transfert de gène, en particulier dans la rétine. Ils sont utilisés aussi bien pour des études biologiques que pour la thérapie génique. Malgré cela, il reste encore des barrières qui limitent leur utilisation. Nous proposons ici d’utiliser une technique d’évolution dirigée pour surmonter ces barrières et améliorer l’efficacité des AAVs en tant que vecteurs de gènes. Dans un premier temps, nous avons créé trois librairies virales hautement diversifiées basées sur l’AAV2. Ces librairies étaient constituées de capsides modifiées aléatoirement pour leur donner de nouvelles propriétés. Nous avons ensuite réalisé deux types de sélections. D’une part, nous avons sélectionné nos librairies virales dans le système visuel de la souris pour obtenir une capside capable de transport axonal antérograde trans-synaptique afin de pouvoir étudier simultanément l’activité et la connectivité de réseaux neuronaux. Cette sélection a fortement convergée vers une capside nommée AAV2-7mD, dont la capacité de transport axonal antérograde trans-synaptique est plus efficace que les AAVs 1 et 2. D’autre part, nous avons sélectionné nos librairies virales directement sur des explants de maculas de rétine humaine afin découvrir une capside capable de traverser la membrane limitante interne de la macula humaine. Ceci a pour but d’avoir un vecteur efficace pour des traitements de thérapie génique par voie intra-vitréenne. Cette librairie a commencé à converger mais nous sommes toujours en attente du dernier cycle de sélection. Nous traitons donc dans cette thèse des résultats de deux évolutions dirigées sur l’AAV2 afin de créer des vecteurs de gènes plus performants dans le système visuel

Vectors and Gene Delivery to the Retina

International audienceOne of the great advantages of the retina as a target tissue for gene delivery is the wide array of genetic tools that have been developed in the past decade. This includes a variety of vectors for therapeutic gene delivery to most types of retinal neurons and glia, as well as cell type–specific promoters for restricted gene expression in distinct neuronal subtypes. Within the scope of neuroscience applications and for gene therapy, it is now routine to express reporter genes, replacement genes, neuronal activity indicators, and microbial opsins in specific neuronal types in the mouse retina. However, there are considerable anatomical, physiological, immunological, and behavioral differences between the mouse and the human that limit the usefulness of these tools in humans and nonhuman primates. Several advances are now being made toward the goal of applying viral targeting tools to understand the primate retina. Here, we describe these advances, consider their potential to advance our understanding of the primate retina, and describe what will be needed to move forward

ACIDES: on-line monitoring of forward genetic screens for protein engineering

Abstract Forward genetic screens of mutated variants are a versatile strategy for protein engineering and investigation, which has been successfully applied to various studies like directed evolution (DE) and deep mutational scanning (DMS). While next-generation sequencing can track millions of variants during the screening rounds, the vast and noisy nature of the sequencing data impedes the estimation of the performance of individual variants. Here, we propose ACIDES that combines statistical inference and in-silico simulations to improve performance estimation in the library selection process by attributing accurate statistical scores to individual variants. We tested ACIDES first on a random-peptide-insertion experiment and then on multiple public datasets from DE and DMS studies. ACIDES allows experimentalists to reliably estimate variant performance on the fly and can aid protein engineering and research pipelines in a range of applications, including gene therapy