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Influencia de la insulina bovina y humana sobre los 铆ndices de maduraci贸n, fecundaci贸n y divisi贸n in vitro de ovocitos de bovino
The present study was carried out to determine the effects of supplementation of the maturation media with human or bovine insulin on in vitro maturation, fertilization and cleavage rates of bovine oocytes. Cumulus-intact bovine oocytes were cultured in a maturation medium (TCM-199 containing 10 percent fetal calf serum) with or without human or bovine insulin supplementation (10 mg/ml). For the bovine insulin supplement, the maturation (80.3 percent), fertilization (61.3 percent) and cleavage (55.3 percent) rates were significantly higher (p<0.05) than those obtained in the control group (70.1; 50.1 and 42.5 percent respectively). Thus, the percentages of cleavaged ova obtained in presence of human or bovine insulin (54.8 and 55.3 percent respectively) were significantly higher (p<0.05) than those observed in control group (42.5 percent). No difference was found among human and bovine insulin treatments. These results demonstrate that the addition of human or bovine insulin to the maturation medium increased the percentages of matured oocyte, increasing the subsequent fertilization and cleavage rates of bovine oocytes in vitro.Se realiz贸 un estudio para determinar los efectos de la suplementaci贸n del medio de maduraci贸n con insulina humana o bovina sobre los 铆ndices de maduraci贸n, fecundaci贸n y divisi贸n in vitro de ovocitos de bovino. Ovocitos de bovino se cultivaron en medio de maduraci贸n (TCM-199 conteniendo 10 p.100 de suero de ternero fetal) con o sin insulina humana o bovina (10 mg/ml). Para la insulina bovina, los 铆ndices de maduraci贸n (80,3 p.100), fecundaci贸n (61,3 p.100) y divisi贸n (55,3 p.100) fueron superiores significativamente (p<0,05) que aquellos obtenidos por el grupo control (70,1; 50,1 y 42,5 p.100 respectivamente). Adem谩s, los porcentajes de 贸vulos divididos obtenidos en presencia de insulina humana o bovina (54,8 y 55,3 p.100 respectivamente), fueron superiores significativamente (p<0,05) en comparaci贸n con los obtenidos por el grupo control (42,5 p.100). No se apreciaron diferencias significativas entre los tratamientos con insulina humana y bovina. Estos resultados ponen de manifiesto que la adici贸n de insulina humana o bovina al medio de maduraci贸n incrementa los porcentajes de ovocitos maduros, mejorando posteriormente los 铆ndices de fecundaci贸n y divisi贸n de ovocitos de bovino in vitro
Un m茅todo optimizado para el an谩lisis cromos贸mico de ovocitos y cigotos obtenidos mediante t茅cnicas de maduraci贸n y fecundaci贸n in vitro
Matured bovine oocytes and zygotes obtained by in vitro maturation and fertilization techniques (IVM and IVF) were cytogenetically prepared by using an improved method for chromosome preparations. The method, which involves use of trypsinizedhypotonic solution plus a vortex-agitated system and very cold two-step fixation process, contributes to weaken the zona pellucida and allows the swelling of oocytes and zygotes which helps the subsequent spreading of the chromosomes. This method permits to obtain preparations of good quality for examining the number and morphology of the chromosomes of oocytes and zygotes for any meiotic and mitotic stage.Se logr贸 optimizar un m茅todo r谩pido para analizar citogen茅ticamente ovocitos y cigotos de bovino obtenidos mediante t茅cnicas de maduraci贸n y fecundaci贸n in vitro (MIV y FIV). El m茅todo, el cual utiliza una soluci贸n hipot贸nica con tripsina, un sistema de agitaci贸n mediante vortex y un sistema doble de fijaci贸n en fr铆o, contribuye a eliminar f谩cilmente la zona pel煤cida y a hinchar a los ovocitos y cigotos favoreciendo posteriormente la extensi贸n de los cromosomas. Este m茅todo permite obtener preparaciones de muy buena calidad para el an谩lisis tanto del n煤mero como de la morfolog铆a de los cromosomas de los ovocitos y cigotos en cualquier estad铆o mei贸tico y mit贸tico
Producci贸n in vitro de embriones de bovino: influencia de la suplementaci贸n s茅rica y hormonal
On study the effect of different serum and hormonal supplements, when added to the maturation medium, on the in vitro maturation and subsequent fertilization and cleavage process of bovine oocytes. The oocyte maturation, fertilization and cleavage rates in the presence of ECS, FCS and hormonal supplements were significantly higher (p<0.001) than that obtained in the control group. No significant differences for maturation, fertilization and development were observed between the different supplements. The addition of serum and hormonal supplements to the maturation medium improved the in vitro maturation rates and subsequent in vitro fertilization and cleavage rates of bovine oocytes.El objetivo del presente estudio fue investigar si diferentes suplementos s茅ricos y hormonales, cuando se adicionan al medio de maduraci贸n, mantienen los procesos de maduraci贸n, fecundaci贸n y divisi贸n de ovocitos de bovino in vitro. Los 铆ndices de maduraci贸n ovocitaria, fecundaci贸n y divisi贸n, en presencia de los suplementos ECS, FCS y hormonas fueron superiores significativamente (p<0,001) que aquellos observados en el grupo control. No se apreciaron diferencias significativas para los estad铆os de maduraci贸n, fecundaci贸n y divisi贸n entre los diferentes suplementos estudiados. Concluimos que la adici贸n de suplementos s茅ricos y hormonales al medio de maduraci贸n mejora los 铆ndices de maduraci贸n ovocitaria y subsiguientes 铆ndices de fecundaci贸n y divisi贸n in vitro de ovocitos de bovino
Influencia de las condiciones de maduraci贸n in vitro sobre los 铆ndices de fertilizacion de ovocitos de bovino
The influenceof maturation medium, serum and hormonal supplements, type of bovine oocyte, as well as the co-culture with granulosa cells for in vitro bovine oocytes maturation on the in vitro fertilization rate were investigated. Immature oocytes with cumulus cells were cultured with two different maturation media (M-199 and DM EM; Experiment 1). In Experiment 2, in vitro maturation was performed with two serum supplements and one hormonal supplement (FCS. ECS and PMSG+HCG). In Experiment 3. on vitro maturation was performed with two different bovine oocyte types (CEO and CDC) In Experiment 4. in vitro maturation was performed with or without the addition of granulosa cells. After in vitro oocyte maturation, oocytes were fertilized using frozen-thawed semen which was previously capacitated with bovine serum albumin and heparin for 15 minutes. The M-199 showed a fertilization rate higher (55 percent; p<0.01) than those obtained in DM EM (39 percent; Experiment 1) . In Experiment 2, the serum and hormonal supplements showed in vitro fertilization rates higher (FCS:55 percent, ECS:57 percent, PMSG + hCG: 60 percent, p<0.001) than that in control group (31 percent). In Experiment 3, In virro fertilization rate of cumulus-denuded oocytes (30 percent) was lower (p<0.001) than those of cumulus-enclosed oocytes (60 percent). In Experiment 4. oocytes cocultured with granulosa cells had higher rates of fertilization (70 percent. p<0.05) than oocytes matured without co-cultured with granulosa cells (55 percent). The results indicate that the use of M-199 medium, the addition of serum or hormonal supplements, the oocyte type and the co-culture with granulosa cells during in vitro maturation influenced the fertilizability of in vitro matured oocytes.Se investig贸 la influencia del med隆o de maduraci贸n, los suplementos s茅ricos y hormonales, tipo de ovocito bovino. as铆 como el co-cultivo con c茅lulas de la granulosa durante la maduraci贸n oocitaria in vitro sobre los 铆ndices de fertilizaci贸n in vitro de ovocitos bovinos. Ovocitos inmaduros con c茅lulas del c煤mulo se cultivados en dos medios de maduraci贸n diferentes (M-199 y DM EM; experimento 1). En el experimento 2, la maduraci贸n in vitro se realiz贸 utilizando dos suplementos s茅ricos y uno hormonal (FCS, ECS y PMSG+HCG). En el experimento 3, la maduraci贸n se realiz贸 utilizando dos tipos de ovocitos diferentes (CEOy CDO). Y en el experimento 4, la maduraci贸n in vitro se llev贸 a cabo con o sin la adici贸n de c茅lulas de la granulosa. Despu茅s de la maduraci贸n de los ovocitos se procedi贸 a su fecundaci贸n in vitro utilizando semen descongelado que fue capacitado previamente con suero albuminoso de bovino y heparina durante 15 minutos. El medio M-199 mostr贸 un Indice de fecundaci贸n superior (55 p.100; p<0,01) que aquel obtenido por el medio DMEM (39p.100; experimento 1). En el experimento 2, los suplementos s茅ricos y hormonales mostraron un 铆ndice de fecundaci贸n superior (FCS:55 p.100, ECS:57 p.100, PMSG+HCG:60 p.100; p<0,001) al del grupo control (31 p.100). En el experimento 3, el indice de fecundaci贸n in vitro de los ovocitos desnudos fue m谩s bajo (30 p.100; p<0,001) que aquellos obtenidos por los ovocitos cubiertos por c茅lulas del c煤mulo (60 p.100). En el experimento 4, ovocitos co-cultivados con c茅lulas de la granulosa tuvieron 铆ndices de fecundaci贸n superiores (70 p.100; p<0,05) que los ovocitos madurados sin co-cultivarse con c茅lulas de la granulosa (55 p.100). Los resultados indican que el uso del medio M-199, la adici贸n de suero o suplementos hormonales, el tipo de ovocito y el co-cultivo con c茅lulas de la granulosa durante la maduraci贸n in vitro influyen en la capacidad de fecundaci贸n de ovocitos madurados in vitro
Influencia de diferentes fracciones foliculares sobre la maduraci贸n in vitro de ovocitos inmaduros de bovino
Three experiments were carried out to investigate whether cumulus cells, Bovine Follicular Fluid (BFF) and granulosa cells, when added as supplements to the maturation medium, support the in virto maturation of immature bovine oocytes. In the first experiment, the maturation medium was supplemented with three different concentrations of the BF F (10, 20 and 50 p.100, respectively). In the second experiment, the effect of three different concentrations of the granulosa (1,10 y 100x 106 cells/ml, respectively), on in vitro oocyte maturation porcentages were evaluated. In the third experiment, the effect of the presence or absence of cumulus cells on the in vitro oocyte maturation rates was compared. Maturation rates at the metaphase II stage, following supplementation with 20 p.100 BFF (60 p.100) were significantly higher (p"O.05) than those obtained in control group (45 p.100). Significant differences between the 10 p.100 BFF, 20 p.100 BFF and 50 p.100 BFF treatments, were not observed. ml and the control treatments (90 p.100 and 85 p.100, respectively) were significantly higher (pa0.001) than when 10 and 10000" cells/ml (66 p.100 and 47 p.100, respectively) were added. Significant differences in the presence (78 p.100) or absence (62 p.100) of cumulus cells (p<0_05) on in vitrooocyte maturation rates were found. The present results indicatethat the presence of cumul us cells surrounding i m matu re oocytes, the addition of low granulosa cells concentrations and BFF added to the maturation medium may be required to induce both nuclear and cytoplasmic maturation of immature bovine oocytes in vitro.Se llevaron a cabo tres experimentos con el objetivo de investigar si las c茅lulas del c煤mulo, fluido folicular bovino (FFB) y las c茅lulas de la granulosa, cuando son a帽adidos como suplemento al medio de maduraci贸n, soportan la maduraci贸n in vitro de ovocitos inmaduros de bovino. En el primer experimento, el medio de maduraci贸n fue suplementado con tres diferentes concentraciones de F F B (10, 20 y 50 p.100, respectivamente). En el segundo experimento, se evalu贸 el efecto de tres concentraciones diferentes de c茅lulas de lagranulosa (1, 10 y 100x106 c茅lulas/ml, respectivamente), sobre los porcentajes de maduraci贸n ovocitaria in vitro. En el tercer experimento, se compar贸 el efecto de la presencia o ausencia de c茅lulas del c煤mulo sobre los 铆ndices de maduraci贸n oocitaria in vitro. Los 铆ndices de maduraci贸n en el estadio de metafase 11, siguientes a la suplementaci贸n con un 20 p.100 FFB (60 p.100) fueron significativamente superiore
Effect of the culture medium and protein supplementation on in vitro maturation of bovine oocytes
In the present work, the effects of oocyte maturation medium and protein supplementation on in vitro maturation process of immature bovine oocytes are described. Three different culture media, such as: TCM-199 medium, DME medium and H-Y medium, and four different protein supplements (bovine follicular fluid: BFF; fetal calf serum: FCS; albumen fraction V of bovine serum: BSA; and bovine amniotic fIuid: BAF) were used. The oocyte maturation rates obtained using TCM-199 medium were significantly higher (81.8 p.cent; p0.05), was higher than that obtained in control group (45.5 p.cent), although such differences were not signif icant. By contrast, oocytes matured in presence of FCS (81 p.cent), BSA (86.2 p.cent) or BAF (77.9 p. cent) showed meiotic maturation rates significantly higher (p0,05), fue superior al conseguido por los ovocitos del grupo control (45,5 p.100), aunque tales diferencias no fueron significativas. Por el contrario, los ovocitos madurados en presencia de FCS (81 p.100), BSA (86,2 p.100) o BAF (77,9 p.100) mostraron unos indices de maduraci贸n mei贸tica significativamente superiores (p<0,001) a los conseguidos por el grupo control. En conclusi贸n, los resultados obtenidos en el presente trabajo indican que el medio TCM-199 fue superior, en cuanto al n煤mero de ovocitosque alcanzaron el estadio de maduraci贸n, en comparaci贸n con losmed隆os D M E y H-Y. As铆 mismo, la suplementaci贸n proteica contribuy贸 a incrementar el porcentaje de ovoc隆los que alcanzaron el estadio de metafase-II. Adem谩s, los mayores porcentajes de maduraci贸n se consiguieron cuando el medio de maduraci贸n se suplement贸 con FCS, BSA y BAF
Influence of human and bovine insulin on in vitro maturation, fertilization and cleavage rates of bovine oocytes
Se realiz贸 un estudio para determinar los efectos de la suplementaci贸n del medio de maduraci贸n con insulina humana o bovina sobre los 铆ndices de maduraci贸n, fecundaci贸n y divisi贸n in vitro de ovocitos de bovino. Ovocitos de bovino se cultivaron en medio de maduraci贸n (TCM-199 conteniendo 10 p.100 de suero de ternero fetal) con o sin insulina humana o bovina (10 mg/ml). Para la insulina bovina, los 铆ndices de maduraci贸n (80,3 p.100), fecundaci贸n (61,3 p.100) y divisi贸n (55,3 p.100) fueron superiores significativamente (p<0,05) que aquellos obtenidos por el grupo control (70,1; 50,1 y 42,5 p.100 respectivamente). Adem谩s, los porcentajes de 贸vulos divididos obtenidos en presencia de insulina humana o bovina (54,8 y 55,3 p.100 respectivamente), fueron superiores significativamente (p<0,05) en comparaci贸n con los obtenidos por el grupo control (42,5 p.100). No se apreciaron diferencias significativas entre los tratamientos con insulina humana y bovina. Estos resultados ponen de manifiesto que la adici贸n de insulina humana o bovina al medio de maduraci贸n incrementa los porcentajes de ovocitos maduros, mejorando posteriormente los 铆ndices de fecundaci贸n y divisi贸n de ovocitos de bovino in vitro
Efecto del medio de cultivo y la suplementaci贸n proteica en la maduraci贸n "in vitro" de ovocitos bovinos
En el presente trabajo se describen los efectos del medio de maduraci贸n ovocitaria y de la suplementaci贸n proteica sobre el proceso de maduraci贸n ovocitaria in vitro de oocitos inmaduros de vacuno. Para ello se usaron tres medios de cultivo diferentes, tales como: medioTCM-199, medio DME y medio H-Y, as铆 como cuatro suplementos proteicos distintos (fluido folicular bovino: BFF; suero fetal bovino: FCS; fracci贸n V albuminosa del suero bovino: BSA; y liquido amni贸tico bovino: BAF). Los 铆ndices de maduraci贸n ovocitaria obtenidos, usando el medio TCM-199, fueron significativamente superiores (81,8 p.100; p0,05), fue superior al conseguido por los ovocitos del grupo control (45,5 p.100), aunque tales diferencias no fueron significativas. Por el contrario, los ovocitos madurados en presencia de FCS (81 p.100), BSA (86,2 p.100) o BAF (77,9 p.100) mostraron unos indices de maduraci贸n mei贸tica significativamente superiores (p<0,001) a los conseguidos por el grupo control. En conclusi贸n, los resultados obtenidos en el presente trabajo indican que el medio TCM-199 fue superior, en cuanto al n煤mero de ovocitosque alcanzaron el estadio de maduraci贸n, en comparaci贸n con losmed隆os D M E y H-Y. As铆 mismo, la suplementaci贸n proteica contribuy贸 a incrementar el porcentaje de ovoc隆los que alcanzaron el estadio de metafase-II. Adem谩s, los mayores porcentajes de maduraci贸n se consiguieron cuando el medio de maduraci贸n se suplement贸 con FCS, BSA y BAF
Efecto del medio de cultivo y la suplementaci贸n proteica en la maduraci贸n "in vitro" de ovocitos bovinos
En el presente trabajo se describen los efectos del medio de maduraci贸n ovocitaria y de la suplementaci贸n proteica sobre el proceso de maduraci贸n ovocitaria in vitro de oocitos inmaduros de vacuno. Para ello se usaron tres medios de cultivo diferentes, tales como: medioTCM-199, medio DME y medio H-Y, as铆 como cuatro suplementos proteicos distintos (fluido folicular bovino: BFF; suero fetal bovino: FCS; fracci贸n V albuminosa del suero bovino: BSA; y liquido amni贸tico bovino: BAF). Los 铆ndices de maduraci贸n ovocitaria obtenidos, usando el medio TCM-199, fueron significativamente superiores (81,8 p.100; p0,05), fue superior al conseguido por los ovocitos del grupo control (45,5 p.100), aunque tales diferencias no fueron significativas. Por el contrario, los ovocitos madurados en presencia de FCS (81 p.100), BSA (86,2 p.100) o BAF (77,9 p.100) mostraron unos indices de maduraci贸n mei贸tica significativamente superiores (p<0,001) a los conseguidos por el grupo control. En conclusi贸n, los resultados obtenidos en el presente trabajo indican que el medio TCM-199 fue superior, en cuanto al n煤mero de ovocitosque alcanzaron el estadio de maduraci贸n, en comparaci贸n con losmed隆os D M E y H-Y. As铆 mismo, la suplementaci贸n proteica contribuy贸 a incrementar el porcentaje de ovoc隆los que alcanzaron el estadio de metafase-II. Adem谩s, los mayores porcentajes de maduraci贸n se consiguieron cuando el medio de maduraci贸n se suplement贸 con FCS, BSA y BAF
Un m茅todo optimizado para el an谩lisis cromos贸mico de ovocitos y cigotos obtenidos mediante t茅cnicas de maduraci贸n y fecundaci贸n in vitro
Se logr贸 optimizar un m茅todo r谩pido para analizar citogen茅ticamente ovocitos y cigotos de bovino obtenidos mediante t茅cnicas de maduraci贸n y fecundaci贸n in vitro (MIV y FIV). El m茅todo, el cual utiliza una soluci贸n hipot贸nica con tripsina, un sistema de agitaci贸n mediante vortex y un sistema doble de fijaci贸n en fr铆o, contribuye a eliminar f谩cilmente la zona pel煤cida y a hinchar a los ovocitos y cigotos favoreciendo posteriormente la extensi贸n de los cromosomas. Este m茅todo permite obtener preparaciones de muy buena calidad para el an谩lisis tanto del n煤mero como de la morfolog铆a de los cromosomas de los ovocitos y cigotos en cualquier estad铆o mei贸tico y mit贸tico