BPA-Induced Deregulation of Epigenetic Patterns: Effects on Female Zebrafish Reproduction

Bisphenol A (BPA) is one of the commonest Endocrine Disruptor Compounds worldwide. It interferes with vertebrate reproduction, possibly by inducing deregulation of epigenetic mechanisms. To determine its effects on female reproductive physiology and investigate whether changes in the expression levels of genes related to reproduction are caused by histone modifications, BPA concentrations consistent with environmental exposure were administered to zebrafish for three weeks. Effects on oocyte growth and maturation, autophagy and apoptosis processes, histone modifications, and DNA methylation were assessed by Real-Time PCR (qPCR), histology, and chromatin immunoprecipitation combined with qPCR analysis (ChIP-qPCR). The results showed that 5 μg/L BPA down-regulated oocyte maturation-promoting signals, likely through changes in the chromatin structure mediated by histone modifications, and promoted apoptosis in mature follicles. These data indicate that the negative effects of BPA on the female reproductive system may be due to its upstream ability to deregulate epigenetic mechanism

Reproduction in captivity of Meiacanthus grammistes

Rotifers and Artemia salina nauplii are the most widely used live prey for newly hatched larvae, but they do not always promote optimal survival and growth. Alternative food sources such as copepods, which bypass these inadequacies and promote adequate growth, are needed and they are viewed with considerable interest by the scienti¢c community. The aim of the present study was to test two diierent diets [rotifers and A. salina nauplii (group A) and a mixture (group B) of rotifers/Tisbe spp. copepods and A. salina nauplii/copepods] during the larval rearing of the striped blenny Meiacanthus grammistes. The analysis of the survival rate, size (total length and wet weight) and metamorphosis time during the larval phase of this species showed thatTisbe spp. administration can signi¢cantly improve larval survival and growth and also reduce the metamorphosis time. The results obtained are related to the fatty acid content of the live prey used and are essential in order to improve the captive production of M. grammistes through a closed system and, in turn, to preserve natural stocks

Growth and stress factors in ballan wrasse (Labrus bergylta) larval development

Ballan wrasse (Labrus bergylta) is a specialized cleaner fish used in salmon farms as a biological treatment against sea lice. Its commercial rearing is at present mostly experimental. A number of key aspects, including the molecular and physiological mechanisms that promote its growth and development, are still largely unexplored. In this study histological, biometric, biochemical and molecular approaches are combined for the first time to investigate the changes in growth (insulin-like growth factor 1 and 2 and myostatin) and stress (heat shock protein 70 and cortisol) markers that occur during ballan wrasse larval development by relating them to larval stages and feed changes. The real-time PCR data demonstrated that igf1 transcripts rose from 1 day post-hatching (dph) and were no longer detectable 38 dph, whereas igf2 and myostatin transcripts were low and stable until 28 dph, then rose in late larval stages. The biometric and histological data matched the molecular findings, documenting rapid growth and development of the larval digestive tract and assimilation ability. Cortisol was lowest at hatching, it rose slightly at first feeding, and then increased during larval development; a similar trend was detected for hsp70 gene expression. The low cortisol levels found at the earliest larval stages reflect a poor stress-coping ability, a feature that may actually protect larvae from the elevated metabolic demands involved by stress responses and promote faster growth and survival. The present data can be applied to improve the rearing performances of this important cleaner species and reduce captures from the wild

Appetite control: study of pathways involved in food intake and metabolism regulation in teleost fish

L’appetito è un comportamento motivato essenziale alla sopravvivenza, crescita e riproduzione di ciascun organismo. Il controllo fisiologico dell’appetito e del senso di sazietà negli animali è regolato da un complesso sistema di segnali centrali e periferici che coinvolgono una serie di neurotrasmettitori e neuropeptidi che interagendo reciprocamente stimolano o inibiscono il comportamento alimentare. I meccanismi che stanno alla base di tale comportamento consentono di mantenere costante l’energia metabolica attraverso un circuito finemente regolato che si instaura tra sistema centrale, in particolare i nuclei arcuati dell’ipotalamo e organi periferici (tratto gastro-intestinale, tessuto adiposo, fegato..). Inoltre, considerando che il mantenimento dell’energy balance si ottiene dall’equilibrio tra energia acquisita (food intake) e consumata, risulta chiaro che la riproduzione, un processo ad elevato consumo energetico, riveste un ruolo chiave nei meccanismi fisiologici che regolano il bilancio dell’energia. E’ impossibile infatti, considerare tali meccanismi svincolati l’uno dall’altro. Tra i fattori esterni in grado di regolare l’energy balance, la luce è sicuramente il principale sincronizzatore del comportamento animale e la melatonina è il mediatore ormonale dei ritmi circadiani/circannuali secondo cui gli animali espletano le loro funzioni. Fattori invece che possono interagire negativamente su tale delicato equilibrio sono i distruttori endocrini, sostanze estrogeno-simili in grado di mimare l’azione di ormoni endogeni. Recenti ricerche affermano che l’uomo è sempre più esposto a tali inquinanti che si trovano ampiamente diffusi in molti manufatti industriali con cui veniamo a contatto giornalmente al punto che la comunità scientifica è sempre più convinta che disordini e malattie di natura endocrinologica siano proprio da imputare a tali esposizioni. La maggior parte delle conoscenze disponibili, com’è ovvio, proviene da studi su mammifero tuttavia negli ultimi anni un crescente numero di ricerche in tal senso si sta incentrando sui bassi vertebrati, in particolare sui pesci. Questo perché modelli sperimentali, come lo zebrafish Danio rerio, consentono di studiare su scala ridotta meccanismi intricati e complessi come quelli che regolano food intake ed energy balance, inoltre considerando la crescente importanza del settore dell’ acquacoltura, molti di tali studi sono proprio finalizzati ad aumentare la produttività e qualità degli allevamenti ittici. Questa tesi si è proposta di investigare i meccanismi che regolano il food intake e il metabolismo energetico nei pesci, in particolare, utilizzando due diverse specie (Danio rerio e Sparus aurata) tale studio ha lo scopo di comprendere di circuiti neuro anatomici coinvolti nel controllo dell’appetito e di mettere in luce possibili relazioni che intercorrono tra tali meccanismi e fattori esterni quali fotoperiodo e distruttori endocrini. Nella prima parte della tesi, utilizzando zebrafish come modello sperimentale, si è valutato, tramite somministrazione in vasca per 10gg, il ruolo della melatonina (dosi 100nM e 1µM) nella regolazione dell’appetito e del metabolismo a livello centrale (cervello) e periferico (fegato, tratto gastrointestinale, gonade e muscolo). Sono stati analizzati, per la prima volta tutti insieme, i principali segnali coinvolti nella regolazione dell’appetito (NPY, LPT, CB1, MC4R, Ghrelin) della crescita (IGF-1), del metabolismo lipidico (PPARs) e della riproduzione (LPT, Ghrelin, Cox2a) tramite PCR Real Time. In Western Blot è stata analizzata la proteina CB1, tramite FTIR è stata valutata la ripartizione delle risorse metaboliche (lipidi carboidrati e proteine), per quanto riguarda la gonade è stato calcolato il numero di uova ovulate per ciascun individuo. I risultati ottenuti hanno evidenziato un chiaro ruolo della melatonina nei pathways che regolano appetito, riproduzione e metabolismo. In particolare l’ormone, a livello fisiologico ha diminuito l’appetito, a livello molecolare ha stimolato positivamente i segnali anoressigenici mentre inibiti gli oressigenici nel cervello. Nel fegato e nell’intestino sono stati inibiti i segnali che stimolano l’appetito, il metabolismo lipidico e la crescita. Nel muscolo si è osservato invece una diminuzione della componente lipidica. A livello della gonade, fisiologicamente, è stato evidenziato un significativo aumento delle uova ovulate, dato confermato dall’aumento di espressione genica di Cox2a e LPT. Tali dati, nel loro insieme, dimostrano il ruolo chiave rivestito dalla melatonina nella regolazione dell’energy balance, andando ad interagire con tutte le molecole analizzate. In particolare tale ormone sembra regolare consumo e acquisizione di energia sulla base delle risorse metaboliche a disposizione, promuovendo quindi la riproduzione e inibendo l’alimentazione. Volendo, poi, analizzare pathways del food inatke anche in modello sperimentale marino siamo passati all’orata. Nonostante la grande importanza che questa specie riveste in acquacoltura, nessuno studio sui meccanismi che regolano l’appetito era stato mai effettuato prima. In questa specie è stato scelto di analizzare il ruolo del sistema endocannabinoide nella regolazione dell’appetito, a livello centrale (cervello) e periferico (fegato) ed eventuali relazioni con il neuropeptide oressigenico per eccellenza: NPY. Giovanili di orata sono state sottoposti, via acqua, a tre concentrazioni di anandamide (AEA, cannabinoide endogeno) (0,1; 1 e 10µM) per tre tempi differenti (30,60,120’). In seguito è stato utilizzato AM251 (antagonista dell’endocannabinoide) (0,1 e 1 µM) somministrato 30’ prima dell’AEA per valutare l’effetto dell’AEA (diretto o meno). Tramite Real time PCR sono stati analizzati CB1 ed NPY nel cervello, mentre tramite Western Blot CB1 è stato analizzato in cervello e fegato. I risultati acquisiti hanno evidenziato come il sistema endocannabinoide rivesta un ruolo chiave nella regolazione dell’appetito. A livello fisiologico, infatti, il food intake ha subito un forte incremento, che è stato confermato a livello molecolare sia nel cervello che nel fegato (aumento dell’espressione genica di Cb1 ed NPY). Inoltre l’effetto dell’AEA è stato specifico e diretto, poiché la somministrazione dell’antagonista ha riportato tutti valori analizzati pari al controllo, annullando l’effetto dell’AEA. Dai dati ottenuti è stata dimostrata, per la prima in orata, volta la forte connessione CB1-NPY nella regolazione dell’appetito. Nell’ultima parte della tesi, è stato valutato l’effetto che distruttori endocrini provocano al sistema che regola appetito e bilancio energetico. Adulti di zebrafish sono stati sottoposti a 0,02; 0,2 e 2 mg/L di dietylexilphthalate (DEHP) e per verificarne gli effetti estrogenici è stato somministrato etinil estradiolo. Tramite Real time PCR sono stati analizzati segnali coinvolti nella regolazione dell’appetito (ORX, LPT, CB1) nel cervello, mentre nel fegato sono stati valutati segnali chiave del metabolismo lipidico (CB1, SREBP e PPARα). I risultati ottenuti hanno dimostrato come questo tipo di composti siano in grado di modificare profondamente e a tutti i livelli gli assi che controllano appetito e metabolismo lipidico. Fisiologicamente si osserva una diminuzione del food intake, confermata, a livello centrale, dalla riduzione dell’espressione genica degli appetito stimolanti e up-regolazione di LPT. Nel fegato invece si osserva una stimolazione dei geni coinvolti nel metabolismo lipidico. Gli effetti più forti di tali modulazioni si sono osservati alle dosi più basse di DEHP, tale dato pone l’accento sull’importanza delle dosi basse nella contaminazione ambientale. Nella loro totalità, i risultai ottenuti in questa tesi di dottorato forniscono un’importante contributo alla letteratura scientifica nella comprensione del controllo dell’appetito e, più in generale, ne evidenziano le relazioni con l’ambiente esterno, ponendo l’accento sui rapporti tra bilancio energetico e metabolismo. Inoltre, i dati ottenuti su orata, sebbene preliminari, chiariscono ed ampliano la conoscenza dei meccanismi alla base del food intake in una delle specie più importanti per l’acquacultura europea

The use of preserved copepods in sea bream small‐scale culture: biometric, biochemical and molecular implications

Considering the well-known problems arising from the use of rotifers and Artemia as live prey in larval rearing in terms of fatty acid deficiencies, the aim of this study was to evaluate a partial or complete replacement of traditional live prey with preserved copepods during the larviculture of gilthead sea bream (Sparus aurata). Sea bream larvae were randomly divided into 4 experimental groups in triplicates: group A larvae (control) fed rotifers followed by Artemia nauplii; group B fed a combined diet (50%) of rotifers–Artemia and preserved copepods; group C fed rotifers followed by preserved copepods; and group D fed preserved copepods solely. Survival and biometric data were analysed together with major molecular biomarkers involved in growth, lipid metabolism and appetite. Moreover, fatty acid content of prey and larvae was also analysed. At the end of 40 days treatment, a stress test, on the remaining larvae, was performed to evaluate the effects of different diets on stress response. Data obtained evidenced a positive effect of cofeeding preserved copepods during sea bream larviculture. Higher survival and growth were achieved in group B (fed combined diet) larvae respect to control. In addition, preserved copepods cofeeding was able to positively modulate genes involved in fish growth, lipid metabolism, stress response and appetite regulation

Marine ornamental species culture: From the past to “Finding Dory”

The present article revises the major topics related to fish and coral reproduction. In particular after a short review of the ornamental trade and the destructive fishing methods that are still used in some areas, the present review revises the principal modes of fish and coral reproduction introducing the main critical bottlenecks in their captive propagation. Regarding fish these include sexing the fish, pair forming, the embryo development, the hatching process and of course the transition from an endogenous to an exogenous feeding by the larvae. As concerns corals, great attention is given to the main modes of reproduction as well as to nutrition and lightening

Silica coating prevents magnetic nanoparticles toxicity: a morphological and molecular study in Zebrafish

Nanoparticles (NPs) are novel man-made materials on the nanoscale. A wide range of nanomaterials is being developed for technical applications and for use in consumer products. Metal NPs, including superparamagnetic iron oxide NPs [magnetite (Fe3O4) and maghemite (\u3b3-Fe2O3)], are interesting tools that can be used in a wide range of biomedical applications. Researches are still in progress and reports about the toxicity of iron oxide NPs are often contradictory. Recent studies carried out in fish, have described different sublethal effects ranging from respiratory toxicity, to oxidative stress involving gill, liver, and gut function and morphology (Li et al. 2009). Moreover, several investigations have found that early life stages, such as embryos and larvae, are more sensitive to NPs than adult forms. The main route of NPs exposure for fish is through the food and the food web and NPs biomagnification, bioaccumulation and bioconcentration phenomena have also been described. NPs encapsulation procedures in a robust shell made of gold, silica, zinc oxide, a polymer, or liposomes not only protects the magnetic core from chemical reactions but also prevents interactions with sensitive biological media. In particular, the silica coating provides stable and multifunctional NPs. Considering that datasets on this topic are still limited and that the effects of dietary exposure to silica-coated magnetic NPs have never been studied so far, this study, explores for the first time silica-coated magnetic NPs direct action on zebrafish (ZF) larvae fed NP-contaminated food and longer-term effects on adults. A multidisciplinary approach, including morphometric examination (light, transmission electron, and confocal microscopy), inductively coupled plasma emission spectrometry and real-time PCRs was applied to detect NPs accumulation, structural and ultrastructural damage, and activation of detoxification processes in larvae and adults