Estudio in vitro de las respuestas celulares asociadas con la exposición a contaminantes emergentes

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de lectura: 25-04-2014En una sociedad industrializada como la actual, los procesos de fabricación de productos de consumo, así como las actividades comerciales y de la vida diaria, suponen la emisión constante al medio ambiente de una gran variedad de productos químicos. A pesar de que muchos de ellos se han venido utilizando durante décadas, apenas tenemos información de sus efectos para nuestra salud y la de nuestro entorno. Entre los xenobióticos que demandan una atención más urgente se encuentran los denominados “contaminantes emergentes”, un grupo de sustancias químicas entre las que se incluyen, entre otros, plastificantes, fármacos y productos de cuidado personal y compuestos perfluorados. El empleo de animales de experimentación en Toxicología ha conllevado en las últimas décadas un creciente número de conflictos científicos, éticos, legislativos y económicos. En paralelo a la mayor demanda de información sobre los efectos para la salud de las sustancias químicas, se viene produciendo una mayor presión para disminuir el número de experimentos con animales. Las estrategias de evaluación in vitro representan una aplicación manifiesta del principio de las 3Rs, que ofrece soluciones a los problemas causados por la actual dependencia de los modelos de experimentación animal. Concretamente, los modelos celulares in vitro empiezan a ser considerados una herramienta muy conveniente en los procesos de valoración toxicológica, capaces de proporcionar un conocimiento más exhaustivo de las bases mecanicistas de los efectos tóxicos de los xenobióticos a nivel sistémico, celular y molecular. En este sentido, el estudio de las alteraciones de procesos celulares básicos y la determinación de las dosis y los tiempos de exposición que ocasionan efectos adversos resultan una pieza fundamental para la evaluación del riesgo toxicológico. En el presente estudio se ha planteado una estrategia integrada en la se han combinado distintas aproximaciones experimentales con un análisis multiparamétrico, empleando líneas celulares en cultivo, en su mayoría humanas, para evaluar las respuestas celulares resultantes de la exposición a tres contaminantes emergentes de interés. El di (2-etilhexil) ftalato es una sustancia química de alta producción ampliamente utilizada como un plastificante en los productos de PVC. Debido a su presencia ubicua y la exposición constante de la población general, este compuesto ha sido objeto de extensos estudios toxicológicos. A pesar de la información disponible, los datos sobre la citotoxicidad del DEHP en células de mamífero son relativamente limitados. Los resultados de nuestro estudio revelan que 24 horas de exposición a DEHP induce en las células Vero y HaCaT una reducción de la viabilidad celular dependiente de dosis, así como una inhibición de la proliferación celular vinculada a un retraso del ciclo celular en la fase G1. Además, nos proporcionan la prueba sin precedentes de que, a dosis de relevancia clínica, el compuesto desencadena en las células de mamífero una respuesta de estrés de retículo endoplásmico, un mecanismo emergente en la patogénesis y progresión de enfermedades metabólicas y otras enfermedades humanas. Ana Peropadre López 4 UAM El triclosán es un agente antimicrobiano de amplio espectro que se ha venido utilizando como conservante de forma habitual durante los últimos 40 años, lo que ha provocado que en la actualidad constituya uno de los compuestos químicos más detectados en el medio ambiente. Aunque existen numerosos estudios que asocian la exposición a este compuesto con diversos efectos adversos para la salud humana y ambiental, resulta especialmente preocupante el desconocimiento que existe hasta la fecha sobre los mecanismos subyacentes a sus efectos nocivos. En el presente estudio hemos demostrado que exposiciones de 120 horas a bajas concentraciones del compuesto (0.5/1 μM) ejercen un claro efecto mitogénico e incrementos de ploidía en las líneas celulares HaCaT, MDA y MCF7. Nuestro estudio también revela que los tratamientos de 24 horas ejercen un efecto antiproliferativo concomitante con la inducción de daño oxidativo al ADN. El ácido perfluorooctanoico pertenece al grupo de los tensioactivos perfluoralquilados, compuestos orgánicos altamente estables empleados masivamente desde hace más de 50 años en la fabricación de revestimientos plásticos, detergentes, teflón y Gore-Tex®. Debido a su presencia ubicua y su elevado tiempo de retención en los tejidos, diversos estudios toxicológicos se han centrado en analizar los posibles efectos adversos del compuesto, sin que su mecanismo de acción no esté completamente caracterizado hasta la fecha. Nuestros resultados demuestran que los efectos producidos por el PFOA en las células HeLa y HaCaT a las 24 horas no revierten con la retirada del compuesto durante 48 horas. Estos efectos, relacionados con el daño de la membrana plasmática y la inducción de estrés oxidativo, dieron lugar en las células HeLa a una respuesta adaptativa. Por su parte, las células HaCaT presentaron un fenotipo compatible con procesos de senescencia celular después de permanecer 8 días en cultivo en medio libre de droga. Aunque aún falta mucha investigación por hacer, los nuevos datos mecanicistas aportados en este estudio pueden contribuir sustancialmente a la información sobre los efectos tóxicos de estos contaminantes emergentes en células de mamífero. Nuestros resultados también ponen de relieve la importancia de establecer con mayor precisión las relaciones de causalidad entre productos químicos industriales ampliamente utilizados y enfermedades humanas.

A moderate exposure to perfluorooctanoic acid causes persistent DNA damage and senescence in human epidermal HaCaT keratinocytes

Our results suggest that a single exposure to perfluorooctanoic acid causes concentration-dependent changes in cell proliferation that were not restored during a 48 h recovery period. Furthermore, we demonstrate that a moderate treatment with this perfluorochemical causes persistent DNA damage, which ultimately leads to development of the senescence-associated secretory phenotype in HaCaT cells. This paper provides unprecedented data and insights regarding the cytotoxic effects of perfluorooctanoic acid in human cells that could be of special relevance for use in comparative in vitro-in vivo studies. Moreover, our findings highlight the importance of considering both the immediate and long-lasting or delayed cytotoxic responses caused by chemical exposure, to ensure the accurate identification of toxicity in cellbased systemsThis work was supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness grant number CTM2012-3134

Detrimental effects of individual versus combined exposure to tetrabromobisphenol A and polystyrene nanoplastics in fish cell lines

The potential interactions between the diverse pollutants that can be released into the environment and the resulting outcomes are a challenging issue that needs to be further examined. This in vitro study was aimed to assess potential toxic effects caused by combined exposure to tetrabromobisphenol A, a flame retardant widely used and frequently detected in aquatic matrices, and commercially available polystyrene nanoparticles as reference material to evaluate nanoplastics risks. Our results, using freshwater fish cell lines and a set of relevant cytotoxicity endpoints including cell viability, oxidative stress, and DNA damage, provide additional mechanistic insights that could help to fully characterize the toxicity profiles of tetrabromobisphenol A and polystyrene nanoparticles. Furthermore, we describe subtle changes in cell viability as well as the generation of oxidative DNA damage after coexposure to subcytotoxic concentrations of the tested pollutantsThis work was funded by the Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities / Spanish State Research Agency / _RTI2018–096046- B-C22. PSB has benefited from a contract from the Office of Education and Research of the Community of Madrid and the European Social Fund (PEJ-2019-AI/SAL-12775

Deletion of the primase-polymerases encoding gene, located in a mobile element in Thermus thermophilus HB27, leads to loss of function mutation of addAB genes

DNA primase-polymerases (Ppol) have been shown to play active roles in DNA repair and damage tolerance, both in prokaryotes and eukaryotes. The ancestral thermophilic bacterium Thermus thermophilus strain HB27 encodes a Ppol protein among the genes present in mobile element ICETh2, absent in other T. thermophilus strains. Using different strategies we ablated the function of Ppol in HB27 cells, either by knocking out the gene through insertional mutagenesis, markerless deletion or through abolition of its catalytic activity. Whole genome sequencing of this diverse collection of Ppol mutants showed spontaneous loss of function mutation in the helicase-nuclease AddAB in every ppol mutant isolated. Given that AddAB is a major player in recombinational repair in many prokaryotes, with similar activity to the proteobacterial RecBCD complex, we have performed a detailed characterization of the ppol mutants in combination with addAB mutants. The results show that knockout addAB mutants are more sensitive to DNA damage agents than the wild type, and present a dramatic three orders of magnitude increase in natural transformation efficiencies with both plasmid and lineal DNA, whereas ppol mutants show defects in plasmid stability. Interestingly, DNA-integrity comet assays showed that the genome of all the ppol and/or addAB mutants was severely affected by widespread fragmentation, however, this did not translate in neat loss of viability of the strains. All these data support that Ppol appears to keep in balance the activity of AddAB as a part of the DNA housekeeping maintenance in T. thermophilus HB27, thus, playing a key role in its genome stabilityThis work was supported by a grant from the Spanish Ministry of Science and Innovation PID2019-109073RB-I00. CV was a holder of a competitive FPI contract. An institutional grant from Fundación Ramón Areces to the CBMSO was also acknowledge

Coordination between cell proliferation and apoptosis after DNA damage in Drosophila

Exposure to genotoxic stress promotes cell cycle arrest and DNA repair or apoptosis. These “life” or “death” cell fate decisions often rely on the activity of the tumor suppressor gene p53. Therefore, the precise regulation of p53 is essential to maintain tissue homeostasis and to prevent cancer development. However, how cell cycle progression has an impact on p53 cell fate decision-making is mostly unknown. In this work, we demonstrate that Drosophila p53 proapoptotic activity can be impacted by the G2/M kinase Cdk1. We find that cell cycle arrested or endocycle-induced cells are refractory to ionizing radiation-induced apoptosis. We show that p53 binding to the regulatory elements of the proapoptotic genes and its ability to activate their expression is compromised in experimentally arrested cells. Our results indicate that p53 genetically and physically interacts with Cdk1 and that p53 proapoptotic role is regulated by the cell cycle status of the cell. We propose a model in which cell cycle progression and p53 proapoptotic activity are molecularly connected to coordinate the appropriate response after DNA damag

An acute exposure to perfluorooctanoic acid causes non-reversible plasma membrane injury in HeLa cells

The authors would like to thank Rosa Sedano from the “Servicio Interdepartamental de Investigación (SIdI) from the Autonomous University of Madrid form performing the quantifcation analysis of PFOA inside HeLa cells, and Mikel Uribarren for his useful collaboration. This work was partially funded by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness / _CTM2012-31344 and FEDER / Spanish Ministry ofScience, Innovationand Universities / Spanish State Research Agency /_RTI2018-096046-B-C2