Study of the application potential of synthetic and natural polymeric coatings in stem cell research

Self-renewability and the ability to differentiate into various functional cells are characteristics of embryonic stem cells (ESCs) that make them attractive for applications in biomedical field, namely in restoring the function of damaged cells/tissues. In research, ESCs are usually cultured in gelatin or over a monolayer of mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEFsi). The latter is the gold standard to maintain pluripotent ESCs in culture. A variety of alternative technologies have been suggested to control stem cell fate and function, but examples of versatile, non-animal derived and inexpensive materials able to support pluripotent ESCs are limited. To circumvent this, we aimed to find a biomaterial able to support pluripotent ESC cultures that would avoid the laborious and time consuming parallel culture of MEFsi and as simple to handle as gelatin. There is an increasing interest in regulating stem cells under a specific microenvironment using biomaterials as artificial extracellular matrices (ECMs) to control their self-renewability and differentiation capacity. In the present work we developed and tested the applicability of two biomaterials, one natural and one synthetic polymer, to support mouse ESC (mESC) culture. Accordingly, undifferentiated mESCs were cultured in coatings of Locust Bean Gum (LGB) and of a new synthetic nanofiber (nf) material based on the self-assembly of a triblock copolymer, poly (ethyleneglycol-β-trimethylsilyl methacrylate-β-methacrylic acid), conjugated with the peptide Glycine-Arginine-Glycine-Aspartate-Serine. According to our data, compared to conventional stem cell culture methodologies, ESCs grown in LBG and nanofiber coatings maintained their self-renewability and trilineage differentiation capacity even after long term culture. In parallel, this work also comprises the functional study of collagen and calciumbinding EGF domains 1 (Ccbe1) using primary fibroblasts as a tool. It has been shown that Ccbe1 is involved in lymphangiogenesis, cardiogenesis and carcinogenesis, however, its function and molecular action remains unknown. The data presented here suggests that Ccbe1 coordinates cell adhesion, migration and proliferation, thus playing a key role in the ECM.A investigação em células estaminais embrionárias tem permitido grandes avanços na pesquisa em ciências biomédicas. Este é o evidente reflexo de estas serem células não especializadas que são capazes de se auto-renovar indefinidamente, e assim dar origem a novas células estaminais num estado indiferenciado, mas também têm a possibilidade de se diferenciarem em um ou múltiplos tipos de células especializadas sob condições definidas ou estímulos intrínsecos e/ou extrínsecos. Linhas de células estaminais embrionárias de ratinho foram inicialmente derivadas e cultivadas há cerca de 30 anos e, desde então, têm sido uma ferramenta inestimável na compreensão dos processos de desenvolvimento embrionário dos mamíferos, bem como no estabelecimento das bases moleculares da pluripotência e da auto-renovação celular. Para além disso, por permitir a criação de geneticamente modificados (e.g. knock-outs) através de recombinação homóloga, estas são determinantes no estudo da função genética in vivo. Não menos importante, os estudos das células estaminais embrionárias de ratinho abriram o caminho à investigação das células estaminais embrionárias humanas que, dada a sua capacidade de auto-renovação e diferenciação, têm suscitado muito interesse pelo seu elevado potencial para uso em terapia celular. As células estaminais embrionárias têm sido co-cultivadas geralmente com células de suporte tais como fibroblastos embrionários de ratinho. Os fibroblastos embrionários de ratinho servem de células de suporte para cultura de células estaminais embrionárias desde a derivação das mesmas. Estes fibroblastos continuam a ser ainda hoje os mais usados como células de suporte para cultura e manutenção de células estaminais de ratinho e humanas, uma vez que proporcionam um substrato que aumenta a eficiência de adesão das células estaminais, promove a manutenção da sua pluripotência e capacidade de auto-renovação e facilita a sua sobrevivência e crescimento. Os fibroblastos embrionários usados para cultura de células estaminais produzem uma complexa mistura de fatores de crescimento, citoquinas e outros componentes da matriz extracelular tais como o fator inibidor de leucemia, proteínas morfogenéticas ósseas, activina, laminina e vitronectina, que mantêm as células estaminais embrionárias indiferenciadas e pluripotentes mesmo quando cultivadas a longo prazo. Sabe-se que o comportamento das células estaminais embrionárias in vitro é fortemente influenciadas pelas condições de cultura. Estudos recentes demonstram que os métodos convencionais de cultura de células estaminais não reúnem os requisitos mínimos para regular e controlar com rigor a função das células estaminais. Além disso, os vários protocolos existentes para cultura de células estaminais envolvem o uso de matrizes de origem animal, tais como a gelatina e os fibroblastos de ratinho. De modo a ultrapassar esta limitação, vários cientistas têm-se empenhado em desenvolver matrizes artificiais no sentido de eliminar os componentes de origem animal dos sistemas de cultura de células, mas mantendo o controlo da capacidade de auto-renovação e diferenciação das células estaminais. O avanço no desenvolvimento de biomateriais tem-se revelado uma ferramenta fundamental para a criação de microambientes artificiais que visam mimetizar o microambiente in vivo das células estaminais, influenciando e controlando a expressão dos genes que definem o destino e as propriedades estaminais, ou seja, a auto-renovação ou a diferenciação. No entanto, apesar dos grandes avanços que têm ocorrido no desenvolvimento de biomateriais, a maioria são dispendiosos e poucos são apropriados para manter as células estaminais embrionárias num estado indiferenciado. Por isso, o objetivo principal deste trabalho foi o de encontrar ou desenvolver um biomaterial capaz de dar suporte ao crescimento de células estaminais embrionárias indiferenciadas, evitando os custos de uma série de procedimentos experimentais trabalhosos e morosos da cultura paralela de fibroblastos com a cultura de células estaminais, e que fosse de fácil manuseamento tal como a gelatina. Visto que o ambiente que envolve as células estaminais tem um papel determinante na seleção do destino das mesmas, o objetivo deste trabalho consistiu então em otimizar as condições de cultura de células estaminais embrionárias de ratinho através da substituição da monocamada de fibroblastos ou da gelatina por um suporte artificial que mimetizasse a matriz extracelular e que servisse como substrato para adesão celular, proliferação e diferenciação. No âmbito deste trabalho desenvolveu-se e testou-se a aplicabilidade de um revestimento de goma de semente de alfarroba e de uma matriz de nanofibras sintéticas na manutenção da pluripotência e capacidade de diferenciação de células estaminais embrionárias de ratinho em cultura. A estabilidade química e a biocompatibilidade dos biomateriais de origem natural tem contribuído para a sua utilização cada vez mais frequente na medicina moderna. A goma de semente de alfarroba é um polímero natural que tem uma vasta gama de aplicações desde a indústria alimentar e cosmética, passando também pela farmacêutica devido à sua biocompatibilidade e às suas propriedades de adesão e de espessante. Nós quisemos testar este composto natural na cultura de células estaminais pluripotentes. Numa primeira abordagem, células estaminais embrionárias de ratinho foram cultivadas em poliestireno revestido com goma de semente de alfarroba e avaliou-se o seu potencial de manutenção da pluripotência através da análise da morfologia das colónias, do ensaio da fosfatase alcalina, da expressão de marcadores de pluripotência (Nanog, Sox2 e Oct4) e da capacidade de diferenciação nos três folhetos embrionários (endoderme, mesoderme e ectoderme) após cultura a longo prazo. De acordo com os resultados, as células estaminais embrionárias cultivadas em goma de semente de alfarroba apresentaram-se sob a forma de colónias regulares, semelhantes às colónias obtidas quando as células estaminais foram cultivadas em fibroblastos, o suporte standard para a manutenção da pluripotência. As células estaminais embrionárias cultivadas em goma de semente de alfarroba mantiveram a sua viabilidade e tiveram um crescimento semelhante às células cultivadas em gelatina. Por outro lado, as células estaminais embrionárias cultivadas em goma de semente de alfarroba apresentaram níveis de expressão de marcadores de pluripotência e de atividade da fosfatase alcalina equivalentes e em alguns pontos mais elevados do que as células cultivadas em gelatina. Após 30 dias de cultura em goma de semente de alfarroba, as células estaminais embrionárias mantiveram a sua capacidade de se diferenciar nos três folhetos embrionários. Apesar das várias vantagens apresentadas pelos polímeros naturais, a sua composição pode variar consoante o lote e o produtor. O principal componente da goma de semente de alfarroba é o polímero galactomanano que se encontra no endosperma das sementes e funciona como reserva energética. Neste trabalho testou-se também a utilização de goma de semente de alfarroba de diferentes origens (Roeper e Industrial Farense) e purificada versus não purificada, para cultura de células estaminais embrionárias. Em geral, confirmou-se que o revestimento do poliestireno tratado para cultura de células com goma de semente de alfarroba promove o crescimento de células estaminais embrionárias num estado indiferenciado e viável, o que tem potencial para ser um suporte de origem vegetal para cultura de células alternativo à gelatina. Tendo em conta que a matriz extracelular nativa é maioritariamente constituída por fibras, e que no caso da cultura sobre fibroblastos estas são produzidas pelos fibroblastos, desenvolveu-se um suporte de nanofibras poliméricas de poli (etilenoglicol-β-metacrilato de trimetilsilício-β-ácido metacrílico), conjugado com péptido glicina-arginina-glicina-aspartato-serina. Esta matriz é então resultante da conversão de co-polímeros anfifílicos em nanofibras através de um processo de organização espontânea (self-assembly). Considerando que um suporte ideal deve conter locais que proporcionem a adesão celular, os co-polímeros anfifílicos foram desenhados e sintetizados de modo a incorporar uma sequência de péptidos termoestáveis que correspondem a uma sequência biológica integrante da matriz extracelular. Com o objetivo de determinar o potencial de aplicação futura do suporte de nanofibras para cultura de células estaminais, células estaminais embrionárias indiferenciadas de ratinho foram cultivadas no suporte de nanofibras e em condições convencionais. O potencial de aplicação das nanofibras em investigação de células estaminais foi avaliado através da morfologia, proliferação, viabilidade, auto-renovação e pluripotência das células estaminais embrionárias indiferenciadas de ratinho comparativamente com os resultados obtidos para as condições de cultura standard. De acordo com os resultados, as nanofibras promoveram o crescimento celular e um aumento da expressão dos genes de pluripotência em comparação com as metodologias convencionais de cultura de células estaminais. Além disso, as células estaminais embrionárias cultivadas a longo prazo em nanofibras conservaram a capacidade de diferenciação. Portanto, neste trabalho foi desenvolvido uma nova matriz de nanofibras sintéticas que permite a eliminação de matrizes de origem animal e providencia um método económico para cultura de células constituído por uma rede de nanofibras. Esta matriz de nanofibras possui uma escala semelhante à matriz extracelular nativa onde as células podem ser mantidas e manipuladas. Paralelamente ao estudo da utilização de biomateriais na cultura e manutenção de células estaminais, a última parte do meu trabalho foi dedicada ao estudo da função da proteína CCBE1. A proteína CCBE1 contém domínios putativos de colagénio e de fator de crescimento epidermal (EGF). O gene Ccbe1 foi identificado num ensaio de expressão diferencial efetuado para revelar novos genes expressos nos percursores cardíacos realizado pelo nosso laboratório e está envolvido em processos de linfangiogénese, cardiogénese e carcinogénese. No entanto, apesar de putativamente CCBE1 ser uma proteína secretada, a sua função e mecanismo de ação continuam a ser desconhecidos. Dados experimentais publicados e outros realizados no nosso laboratório revelaram que o ratinho mutante para o gene Ccbe1 morre durante o desenvolvimento embrionário. Outros resultados indicam que Ccbe1 é muito expresso em fibroblastos embrionários de ratinho. Por estas razões, foram realizados estudos de função de Ccbe1 utilizando culturas primárias de fibroblastos embrionários de ratinho como modelo. Realizaram-se ensaios de adesão, proliferação, viabilidade e migração. De acordo com os resultados, verificou-se que os fibroblastos isolados do ratinho mutante para Ccbe1 a E13.5 apresentam uma morfologia típica de fibroblastos senescentes, a sua proliferação é mais lenta e têm expressão de Bax aumentada, um inibidor de proliferação celular. Por outro lado, quando CCBE1 é adicionado a fibroblastos Ccbe1-/-, a sua proliferação e viabilidade aumentam. O papel de Ccbe1 em migração foi também testado. Os fibroblastos mutantes para Ccbe1 apresentaram um carácter mais migratório do que os fibroblastos normais e dependente do substrato. Contrariamente, este carácter migratório é reduzido quando o ensaio de migração é feito na presença de CCBE1 no meio de cultura. Apesar de o mecanismo de ação de Ccbe1 continuar a ser desconhecido, os resultados aqui apresentados sugerem que Ccbe1 coordena a adesão celular, migração e proliferação, o que sugere que Ccbe1 deverá desempenhar um papel fundamental na matriz extracelular.Fundação para a Ciência e TecnologiaUniversidade do Algarve, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicin

Generation and maturation of human iPSC-derived 3D organotypic cardiac microtissues in long-term culture

Cardiovascular diseases remain the leading cause of death worldwide; hence there is an increasing focus on developing physiologically relevant in vitro cardiovascular tissue models suitable for studying personalized medicine and pre-clinical tests. Despite recent advances, models that reproduce both tissue complexity and maturation are still limited. We have established a scaffold-free protocol to generate multicellular, beating human cardiac microtissues in vitro from hiPSCs-namely human organotypic cardiac microtissues (hOCMTs)-that show some degree of self-organization and can be cultured for long term. This is achieved by the differentiation of hiPSC in 2D monolayer culture towards cardiovascular lineage, followed by further aggregation on low-attachment culture dishes in 3D. The generated hOCMTs contain multiple cell types that physiologically compose the heart and beat without external stimuli for more than 100 days. We have shown that 3D hOCMTs display improved cardiac specification, survival and metabolic maturation as compared to standard monolayer cardiac differentiation. We also confirmed the functionality of hOCMTs by their response to cardioactive drugs in long-term culture. Furthermore, we demonstrated that they could be used to study chemotherapy-induced cardiotoxicity. Due to showing a tendency for self-organization, cellular heterogeneity, and functionality in our 3D microtissues over extended culture time, we could also confirm these constructs as human cardiac organoids (hCOs). This study could help to develop more physiologically-relevant cardiac tissue models, and represent a powerful platform for future translational research in cardiovascular biology

Generation and maturation of human iPSC-derived 3D organotypic cardiac microtissues in long-term culture

Cardiovascular diseases remain the leading cause of death worldwide; hence there is an increasing focus on developing physiologically relevant in vitro cardiovascular tissue models suitable for studying personalized medicine and pre-clinical tests. Despite recent advances, models that reproduce both tissue complexity and maturation are still limited. We have established a scaffold-free protocol to generate multicellular, beating human cardiac microtissues in vitro from hiPSCs-namely human organotypic cardiac microtissues (hOCMTs)-that show some degree of self-organization and can be cultured for long term. This is achieved by the differentiation of hiPSC in 2D monolayer culture towards cardiovascular lineage, followed by further aggregation on low-attachment culture dishes in 3D. The generated hOCMTs contain multiple cell types that physiologically compose the heart and beat without external stimuli for more than 100 days. We have shown that 3D hOCMTs display improved cardiac specification, survival and metabolic maturation as compared to standard monolayer cardiac differentiation. We also confirmed the functionality of hOCMTs by their response to cardioactive drugs in long-term culture. Furthermore, we demonstrated that they could be used to study chemotherapy-induced cardiotoxicity. Due to showing a tendency for self-organization, cellular heterogeneity, and functionality in our 3D microtissues over extended culture time, we could also confirm these constructs as human cardiac organoids (hCOs). This study could help to develop more physiologically-relevant cardiac tissue models, and represent a powerful platform for future translational research in cardiovascular biology

Multiscale Analysis of Extracellular Matrix Remodeling in the Failing Heart

Rationale:Cardiac ECM (extracellular matrix) comprises a dynamic molecular network providing structural support to heart tissue function. Understanding the impact of ECM remodeling on cardiac cells during heart failure (HF) is essential to prevent adverse ventricular remodeling and restore organ functionality in affected patients.Objectives:We aimed to (1) identify consistent modifications to cardiac ECM structure and mechanics that contribute to HF and (2) determine the underlying molecular mechanisms.Methods and Results:We first performed decellularization of human and murine ECM (decellularized ECM) and then analyzed the pathological changes occurring in decellularized ECM during HF by atomic force microscopy, 2-photon microscopy, high-resolution 3-dimensional image analysis, and computational fluid dynamics simulation. We then performed molecular and functional assays in patient-derived cardiac fibroblasts based on YAP (yes-associated protein)-transcriptional enhanced associate domain (TEAD) mechanosensing activity and collagen contraction assays. The analysis of HF decellularized ECM resulting from ischemic or dilated cardiomyopathy, as well as from mouse infarcted tissue, identified a common pattern of modifications in their 3-dimensional topography. As compared with healthy heart, HF ECM exhibited aligned, flat, and compact fiber bundles, with reduced elasticity and organizational complexity. At the molecular level, RNA sequencing of HF cardiac fibroblasts highlighted the overrepresentation of dysregulated genes involved in ECM organization, or being connected to TGF beta 1 (transforming growth factor beta 1), interleukin-1, TNF-alpha, and BDNF signaling pathways. Functional tests performed on HF cardiac fibroblasts pointed at mechanosensor YAP as a key player in ECM remodeling in the diseased heart via transcriptional activation of focal adhesion assembly. Finally, in vitro experiments clarified pathological cardiac ECM prevents cell homing, thus providing further hints to identify a possible window of action for cell therapy in cardiac diseases.Conclusions:Our multiparametric approach has highlighted repercussions of ECM remodeling on cell homing, cardiac fibroblast activation, and focal adhesion protein expression via hyperactivated YAP signaling during HF

YAP-TEAD1 control of cytoskeleton dynamics and intracellular tension guides human pluripotent stem cell mesoderm specification

The tight regulation of cytoskeleton dynamics is required for a number of cellular processes, including migration, division and differentiation. YAP-TEAD respond to cell-cell interaction and to substrate mechanics and, among their downstream effects, prompt focal adhesion (FA) gene transcription, thus contributing to FA-cytoskeleton stability. This activity is key to the definition of adult cell mechanical properties and function. Its regulation and role in pluripotent stem cells are poorly understood. Human PSCs display a sustained basal YAP-driven transcriptional activity despite they grow in very dense colonies, indicating these cells are insensitive to contact inhibition. PSC inability to perceive cell-cell interactions can be restored by tampering with Tankyrase enzyme, thus favouring AMOT inhibition of YAP function. YAP-TEAD complex is promptly inactivated when germ layers are specified, and this event is needed to adjust PSC mechanical properties in response to physiological substrate stiffness. By providing evidence that YAP-TEAD1 complex targets key genes encoding for proteins involved in cytoskeleton dynamics, we suggest that substrate mechanics can direct PSC specification by influencing cytoskeleton arrangement and intracellular tension. We propose an aberrant activation of YAP-TEAD1 axis alters PSC potency by inhibiting cytoskeleton dynamics, thus paralyzing the changes in shape requested for the acquisition of the given phenotype

Study and optimization of mouse embryonic stem cell culture

Dissertação mest., Engenharia Biológica, Universidade do Algarve, 2009Stem cell research has grown from unexplored to an important field in biomedical sciences today. Indeed, a deeper understanding of the basic biology of stem cells holds the key to unlock new hopes to various incurable human diseases. Embryonic stem (ES) cells have the unique ability to proliferate indefinitely in an undifferentiated state and to give rise to any type of somatic cell lineage depending on specific signals. ES cells have been typically studied in two-dimension (2D) Petri dishes, 2D multi-well plates or 2D glass slides coated with different substrates which differ radically from the three-dimension (3D) microenvironment in the body. Consequently, cells isolated from higher organisms frequently modify their metabolism, morphology and gene expression profile. The substitution of the 2D systems by a 3D micro or nanomolecular network (scaffold) is a very promising approach in replicating the architecture of the in situ environment of a cell in a living organism. However, the existing 3D culture systems formed from animal-derived biomaterials pose problems for replacement therapies. The goal of this dissertation was to study the possibility of using a new artificial 3D nanowire scaffold formed from self-assembly of amphiphilic biodegradable peptidecopolymers, instead of conventional mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts, for culture of mouse ES cells (mES cells). Undifferentiated mouse ES cells were cultured using the bioconjugated polymeric nanowire scaffold and control conditions. The potential of the scaffold for applications in ES cell research was evaluated by assessing the morphology, proliferation, survival rate, self-renewal and pluripotency of mES cells. The results obtained suggest that, in low concentrations (50 and 25 Eg/ml) of Arginine– Glycine–Aspartate (RGD) bioconjugated polymeric nanowires scaffold the cells retain their viability and pluripotency. However, an improvement of the scaffold would be required in order to promote better survival rates and making this 3D system in an alternative substrate for mES cell culture, which saves time and is easy to use

Locust bean gum as an alternative polymeric coating for embryonic stem cell culture

Pluripotent embryonic stem cells (ESCs) have self-renewal capacity and the potential to differentiate into any cellular type depending on specific cues (pluripotency) and, therefore, have become a vibrant research area in the biomedical field. ESCs are usually cultured in gelatin or on top of a monolayer of feeder cells such as mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEFsi). The latter is the gold standard support to maintain the ESCs in the pluripotent state. Examples of versatile, non-animal derived and inexpensive materials that are able to support pluripotent ESCs are limited. Therefore, our aim was to find a biomaterial able to support ESC growth in a pluripotent state avoiding laborious and time consuming parallel culture of MEFsi and as simple to handle as gelatin. Many of the new biomaterials used to develop stem cell microenvironments are using natural polymers adsorbed or covalently attached to the surface to improve the biocompatibility of synthetic polymers. Locust beam gum (LBG) is a natural, edible polymer, which has a wide range of potential applications in different fields, such as food and pharmaceutical industry, due to its biocompatibility, adhesiveness and thickening properties. The present work brings a natural system based on the use of LBG as a coating for ESC culture. Undifferentiated mouse ESCs were cultured on commercially available LBG to evaluate its potential in maintaining pluripotent ESCs. In terms of morphology, ESC colonies in LBG presented the regular dome shape with bright borders, similar to the colonies obtained in co-cultures with MEFsi and characteristic of pluripotent ESC colonies. In short-term cultures, ESC proliferation in LBG coating was similar to ESC cultured in gelatin and the cells maintained their viability. The activity of alkaline phosphatase and Nanog, Sox2 and Oct4 expression of mouse ESCs cultured in LBG were comparable or in some cases higher than in ESCs cultured in gelatin. An in vitro differentiation assay revealed that mouse ESCs cultured in LBG preserve their tri-lineage differentiation capacity. In conclusion, our data indicate that LBG coating promotes mouse ESC growth in an undifferentiated state demonstrating to be a viable, non-animal derived alternative to gelatin to support pluripotent mouse ESCs in culture

The mechanical regulation of RNA binding protein hnRNPC in the failing heart

Cardiac pathologies are characterized by intense remodeling of the extracellular matrix (ECM) that eventually leads to heart failure. Cardiomyocytes respond to the ensuing biomechanical stress by reexpressing fetal contractile proteins via transcriptional and posttranscriptional processes, such as alternative splicing (AS). Here, we demonstrate that the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C (hnRNPC) is up-regulated and relocates to the sarcomeric Z-disc upon ECM pathological remodeling. We show that this is an active site of localized translation, where the ribonucleoprotein associates with the translation machinery. Alterations in hnRNPC expression, phosphorylation, and localization can be mechanically determined and affect the AS of mRNAs involved in mechanotransduction and cardiovascular diseases, including Hippo pathway effector Yes-associated protein 1. We propose that cardiac ECM remodeling serves as a switch in RNA metabolism by affecting an associated regulatory protein of the spliceosome apparatus. These findings offer new insights on the mechanism of mRNA homeostatic mechanoregulation in pathological conditions

Corrigendum to “Evidence for discrete modes of YAP1 signaling via mRNA splice isoforms in development and disease” [Genomics 113 (2021) 1349–1365]

Correction to: Vrbský, J., Vinarský, V., Perestrelo, A. R., De La Cruz, J. O., Martino, F., Pompeiano, A., Izzi, V., Hlinomaz, O., Rotrekl, V., Sudol, M., Pagliari, S., & Forte, G. (2021). Evidence for discrete modes of YAP1 signaling via mRNA splice isoforms in development and diseases. Genomics, 113(3), 1349–1365. https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2021.03.009 Rinnakkaistallennettu versio / Self-archived versio

YAP-TEAD1 control of cytoskeleton dynamics and intracellular tension guides human pluripotent stem cell mesoderm specification

The tight regulation of cytoskeleton dynamics is required for a number of cellular processes, including migration, division and differentiation. YAP-TEAD respond to cell-cell interaction and to substrate mechanics and, among their downstream effects, prompt focal adhesion (FA) gene transcription, thus contributing to FA-cytoskeleton stability. This activity is key to the definition of adult cell mechanical properties and function. Its regulation and role in pluripotent stem cells are poorly understood. Human PSCs display a sustained basal YAP-driven transcriptional activity despite they grow in very dense colonies, indicating these cells are insensitive to contact inhibition. PSC inability to perceive cell-cell interactions can be restored by tampering with Tankyrase enzyme, thus favouring AMOT inhibition of YAP function. YAP-TEAD complex is promptly inactivated when germ layers are specified, and this event is needed to adjust PSC mechanical properties in response to physiological substrate stiffness. By providing evidence that YAP-TEAD1 complex targets key genes encoding for proteins involved in cytoskeleton dynamics, we suggest that substrate mechanics can direct PSC specification by influencing cytoskeleton arrangement and intracellular tension. We propose an aberrant activation of YAP-TEAD1 axis alters PSC potency by inhibiting cytoskeleton dynamics, thus paralyzing the changes in shape requested for the acquisition of the given phenotype.status: publishe