Biosynthesis, isolation and kinetic characterization of recombinant human catechol-O-methyltransferase from Pichia pastoris strains

Catechol-O-methyltransferase (COMT; EC 2.1.1.6) is a magnesium-dependent enzyme that catalyzes the methylation reaction of different catecholic substrates such as catecholamines, xenobiotic catechols and catecholestrogens. Following the initial characterizations of these enzymes, it was described that they are potentially involved in diverse human disorders. Specifically, as its inhibition has proven to be of great interest in neurologic disorders such as Parkinson's disease, developing inhibitor molecules with increased potency and selectivity may improve the outcome of these patients. These molecules are usually accomplished using structure-based drug design studies that rely on the attainment of highly purified protein quantities. Indeed, challenges in the determination of protein structures are mainly associated with their low natural abundance coupled with the difficulty of obtaining crystals amenable to X-Ray diffraction. In particular, as membrane proteins are naturally embedded in the lipid bilayer, the determination of their structure faces additional difficulties. As it is unrealistic to purify all of these targets from their natural sources, structural biology of proteins usually focus on the recombinant heterologous expression of these proteins onto an expression host. In addition, to isolate the target proteins from the other major host contaminants, equally appropriated purification strategies need to be designed and implemented, mostly using chromatographic procedures. Throughout this entire process, is also important that the developed strategy is able to keep the proteins in a stable and functional active form, thus avoiding its misfolding during biosynthesis and aggregation after its recovery and isolation in the downstream processing. Therefore, the main scope of this work is the development of a straightforward approach that allows the biosynthesis, isolation and purification of recombinant human COMT isoforms in a biologically active form for further application in structural studies or to evaluate their role as potential therapeutic proteins. Specifically, although no single host can provide all the desired properties for recombinant protein biosynthesis, Pichia pastoris is able to perform many post-translational modifications and is cultivated at high cell-densities in moderately cheap media. Therefore, in this work, it was selected for expression of COMT enzymes. On the other hand, the high selectivity often provided by affinity chromatography prompted us to employ it as the main isolation and purification step. The determination of COMT enzymatic activity is greatly important in COMT recombinant research, either to assess COMT activity from recombinant lysates or purified fractions, for detergent-solubilized or unsolubilized samples and for both isoforms. Therefore, a faster and more sensitive analytical method based on HPLC coupled with coulometric detection was developed for quantifying metanephrine in these assays. Then, an integrated strategy for recombinant soluble catechol-O-methyltransferase (SCOMT) biosynthesis onto P. pastoris and purification using immobilized-metal affinity chromatography was implemented where highly purified fractions of this target enzyme were obtained. On the other hand, as heterologous membrane protein overexpression is usually more challenging than soluble proteins and less reports are available in the literature with recombinant human membrane-bound catechol-O-methyltransferase (MBCOMT) than COMT soluble isoform, our work were mostly focused on MBCOMT. Here, we established protocols for MBCOMT expression in Pichia pastoris methanol-induced cultures in baffled shake-flasks and mini-bioreactors. In particular, the optimization of the induction phase using artificial neural networks in mini-biorreactors allowed achieving high levels of biologically active MBCOMT. Then, arginine-affinity chromatography was successfuly applied for the direct capture of MBCOMT from Pichia pastoris lysates and it was recovered in a moderate purified form. Finally, the ongoing work is related to the purification of a hexa-histidine tagged form of MBCOMT using immobilized-metal affinity chromatography. Indeed, despite significant achievements were made concerning the construction of a tagged form of MBCOMT solubilized with an appropriated detergent in a biologically active form, additional stepwise gradients are required to effectively separate MBCOMT from the other contaminants. In conclusion, the progress achieved with this work meets the highly demanding requirements of biophysical techniques, mainly regarding the upstream stage as well as COMT stabilization where moderate to high quantities of catalitically active enzymes were obtained. In particular, coupling the strategy here reported for SCOMT with a final polishing step will probably allow performing structural or bio-interaction studies with this enzyme. Nonetheless, the strategies here described successfully for partial MBCOMT purification need to be improved, especially for immobilized-metal affinity chromatography once it is considered to be highly selective and, thus, it is feasible that after succesful optimization procedures, fractions with high purity will be obtained. Therefore, the strategies here reported with the intensification and optimization of some procedures would possible permit performing structural and bio-interaction studies using the apo-enzymes or complexed with different ligands (cofactors or inhibitors) by Nuclear Magnetic Ressonance, Isothermal Titration Calorimetry or even using Crystallographic experiments.A catecol-O-metiltransferase (COMT; EC 2.1.1.6) é uma enzima dependente de magnésio que cataliza a reação de metilação de diferentes substratos com estrutura catecólica, nomeadamente catecolaminas, catecóis xenobióticos e catecolestrogénios. Em humanos, esta enzima encontra-se presente sob duas isoformas, uma solúvel (SCOMT) e uma membranar (MBCOMT), esta última associada à membrana do retículo endoplasmático rugoso. Após os primeiros estudos realizados com estas enzimas, estabeleceu-se que estas poderiam estar potencialmente envolvidas em diversas patologias humanas. Em particular, chegou-se à conclusão que a sua inibição origina grandes benefícios na doença de Parkinson onde leva a um aumento da biodisponibilidade da levodopa, administrada para colmatar a falta de dopamina causada pela degeneração dos neurónios dopaminérgicos. Assim, o desenvolvimento de moléculas com capacidade para inibir a atividade biológica da COMT com potência e seletividade aperfeiçoadas poderia melhorar o prognóstico destes doentes. O processo para o desenvolvimento destas moléculas geralmente inclui a realização de estudos estruturais baseados em estruturas previamente determinadas que dependem da obtenção de elevadas quantidades de proteínas purificadas. A determinação de estruturas tridimensionais de proteínas é geralmente dificultada por vários obstáculos, principalmente devido ao fato de se encontrarem em quantidades reduzidas nas suas fontes naturais e à dificuldade em obter cristais cuja Difração de Raios-X produza resultados positivos. Além disso, uma vez que as proteínas membranares se encontram naturalmente embebidas numa bicamada lipídica, a determinação da sua estrutura enfrenta desafios adicionais. Visto que do ponto de vista laboratorial é praticamente impossível purificar a maioria destes alvos proteicos diretamente a partir das suas fontes naturais, em biologia estrutural, geralmente utiliza-se a produção recombinante heteróloga de proteínas em hospedeiros procariotas ou eucariotas. Adicionalmente, para isolar as proteínas-alvo heterólogas dos restantes contaminantes do hospedeiro, é necessário o desenvolvimento e implementação de estratégias de purificação, principalmente através de procedimentos cromatográficos. Ao longo deste processo, também é relevante que a estratégia desenvolvida permita que as proteínas mantenham o seu estado nativo e, consequentemente, biologicamente ativo. Desta forma, é importante evitar que a proteína se acumule num estado desenrolado e não funcional durante a sua biossíntese ou, por outro lado, evitar a sua agregação após a sua recuperação e purificação. Assim sendo, o principal objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de uma abordagem integrada, simples e eficiente para a biossíntese e purificação de ambas as isoformas da COMT numa forma biologicamente ativa, passíveis de posteriores aplicações em estudos estruturais. Não existe um único hospedeiro que reúna todas as características desejadas para a biossíntese recombinante de proteínas. No entanto, encontra-se descrito que a Pichia pastoris é capaz de realizar muitas modificações pós-tradução necessárias para o correto enrolamento de algumas proteínas e obtêm-se elevadas densidades celulares em meios relativamente pouco dispendiosos. Assim, tendo em conta estas vantagens, este hospedeiro foi selecionado neste trabalho para a expressão de ambas as isoformas da COMT. Por outro lado, procurou-se explorar a elevada seletividade geralmente associada à cromatografia de afinidade, tendo-se por isso definido este tipo de cromatografia como o principal passo de isolamento e purificação da COMT. A determinação da atividade enzimática da COMT apresenta elevada importância do ponto de vista científico em todas as investigações relacionadas com a COMT recombinante. Desta forma, tendo em vista a quantificação da metanefrina produzida em ensaios enzimáticos da COMT, desenvolveu-se e implementou-se um método analítico baseado em cromatografia líquida de elevada performance com deteção coulométrica. Além do tempo de corrida de cada ensaio ser inferior aos reportados anteriormente, as melhorias na razão sinal/ruído atingidas com a deteção coulométrica permitiram detetar e quantificar quantidades inferiores do analito em questão, levando a um aumento da sensibilidade deste método em comparação com métodos alternativos descritos na literatura. De seguida, desenvolveu-se uma estratégia integrada para a biossíntese da SCOMT em Pichia pastoris e subsequente purificação por cromatografia de afinidade com iões metálicos imobilizados. Através da aplicação com sucesso desta estratégia, frações de SCOMT com elevada pureza foram obtidas. Estas frações foram ainda avaliadas por ionização por dessorção a laser assistida por matriz com deteção em dois analisadores do tipo tempo de vôo (em inglês, MALDI-TOF/TOF) e verificou-se que apresentavam uma estrutura primária idêntica à correspondente SCOMT nativa, indicando que foi corretamente processada pela maquinaria intracelular do hospedeiro. Também se determinou a sensibilidade (IC50 - Concentração de composto necessária para inibir 50% da atividade enzimática máxima da enzima-alvo) da SCOMT para ser inibida por dois inibidores disponíveis comercialmente - entacapone e 3,5-dinitrocatecol - e obtiveram-se valores da mesma ordem de grandeza dos que foram reportados anteriormente. Em conjunto, estes resultados vêm corroborar que a proteína é idêntica à sua correspondente nativa. Perante o sucesso atingido com esta estratégia, como a expressão heteróloga de proteínas membranares é geralmente mais complexa do que a expressão de proteínas solúveis e visto que existem menos dados na literatura relativamente à MBCOMT quando comparada com a correspondente isoforma solúvel, as etapas subsequentes na dissertação tiveram como foco principal a MBCOMT. No que diz respeito à expressão recombinante em Pichia pastoris da MBCOMT, desenvolveram-se e implementaram-se protocolos para a sua produção em pequena escala ou, alternativamente, em mini-biorreatores. Inicialmente, estudaram-se os perfis de produção da MBCOMT em erlenmeyer por duas estirpes de Pichia pastoris com fenótipos opostos e em condições experimentais distintas. Efetivamente, verificou-se que os níveis de produção da proteína-alvo foram superiores quando a indução foi realizada apenas com metanol, por contraposição aos ensaios onde se utilizou metanol juntamente com glicerol ou sorbitol em modo de alimentação mista. Apesar da performance das duas estirpes em sintetizar a MBCOMT ter sido semelhante, selecionou-se para ensaios posteriores a estirpe X33 (Mut+), em detrimento da KM71H (MutS). De fato, como a estirpe KM71H é mais influenciada pela concentração de indutor utilizada, a eventual aplicação de uma concentração de metanol inadequada compromete os níveis de produção, o que não se verifica com a estirpe X33. No entanto, os resultados mais promissores foram obtidos em mini-biorreatores onde a fase de indução foi otimizada e modelada através de uma rede neuronal artificial. Dos fatores otimizados, destaca-se a adição de dimetilsulfóxido, um agente que atua como um chaperone químico, melhorando a produção de proteínas recombinantes membranares. Além deste bioprocesso não interferir com a viabilidade celular, permitiu a obtenção de elevados níveis de MBCOMT enzimaticamente ativa. Após a implementação de um processo eficiente para a produção recombinante da MBCOMT, desenvolveram-se estratégias para a sua purificação. Inicialmente, utilizou-se cromatografia de afinidade com arginina imobilizada para o isolamento da MBCOMT a partir de lisados de Pichia pastoris. Durante este processo, avaliou-se o efeito do pH, temperatura e a concentração da amostra injetada na adsorção e grau de purificação da enzima-alvo. Assim, a estratégia otimizada foi obtida a pH 7 e conduzida a 20ºC com uma amostra inicial mais concentrada, a partir da qual a MBCOMT foi recuperada num estado intermédio de purificação. Finalmente, desenvolveu-se uma metodologia para a purificação de uma forma recombinante da MBCOMT com um tag de 6 histidinas no terminal carboxilo por cromatografia de afinidade com iões metálicos imobilizados. Apesar deste trabalho ainda não estar concluído, o seu progresso permitiu avaliar o efeito do tag na atividade biológica da MBCOMT e verificou-se que a introdução de um local de clivagem para uma protease leva à perda total da atividade biológica, o que não se observou quando a enzima contém apenas o tag. Finalmente, testaram-se vários detergentes para a solubilização da MBCOMT e verificou-se que o dodecilmaltosídeo foi o mais adequado. De seguida, efetuaram-se vários ensaios para avaliar o comportamento cromatográfico da proteína-alvo com 6 histidinas em diferentes condições experimentais, nomeadamente com diferentes tampões cromatográficos e diferentes iões imobilizados na matriz, nomeadamente Níquel e Zinco. No entanto, para obter uma separação efetiva da enzima-alvo dos demais contaminantes, serão necessários testar gradientes por passos com diferentes concentrações de imidazol ou, alternativamente, testar outros métodos de eluição como a diminuição do pH e a competição com histidina. O progresso atingido com a elaboração deste trabalho permitiu de certa forma atingir os requisitos altamente exigentes necessários para a realização de diversas técnicas biofísicas, particularmente no que diz respeito à fase de produção e estabilização da COMT. De fato, com as estratégias anteriormente reportadas, foram obtidas quantidades moderadas a elevadas de ambas as isoformas da COMT num estado cataliticamente ativo. A estratégia aqui reportada para a isoforma solúvel permite a obtenção da proteína num estado de elevada pureza que quando associada a um passo de cromatografia de exclusão molecular poderá efetivamente cumprir os requisitos necessários para realizar estudos estruturais ou estudos de bio-interação com ligandos ou inibidores já comercializados. Em sentido inverso, as estratégias reportadas neste trabalho com sucesso para a purificação parcial da MBCOMT necessitam de ser melhoradas, particularmente para a cromatografia de afinidade com iões metálicos imobilizados. Visto que este tipo de cromatografia é geralmente caracterizado por apresentar elevada seletividade, é exequível que a realização de ensaios adicionais poderá levar à obtenção de frações com elevada pureza. Desta forma, com a elaboração destes ensaios adicionais, poder-se-á obter proteína-alvo em condições que cumpram os requisitos necessários para realizar estudos estruturais e de bio-interação utilizando a apoenzima ou a enzima complexada com diferentes ligandos tais como cofatores ou inibidores já disponíveis. Estes estudos poderão ser conduzidos por ressonância magnética nuclear, calorimetria de titulação isotérmica ou até experiências cristalográficas. Relativamente às perspetivas futuras, poderá vir a revelar-se útil desenvolver sistemas de expressão sem células, principalmente para a isoforma membranar da COMT visto que se poderá acoplar a sua reconstituição em sistemas não micelares tais como nanodiscos ou lipossomas, que poderá contribuir para a sua estabilização. Adicionalmente, tendo em vista a obtenção de frações purificadas com estas enzimas numa forma nativa, isto é, sem introdução de tags de histidinas por exemplo, poderá explorar-se a cromatografia de imunoafinidade. Através da imobilização de um anticorpo que reconheça um epítopo comum a ambas as isoformas, esta matriz poderá demonstrar elevada versatilidade e ser aplicada tanto para a purificação da COMT solúvel como da membranar

Biosynthesis, solubilization and purification of human membrane bound catechol-O-methyltransferase in brevibacillus choshinensis cells

As proteínas membranares constituem cerca de 20 a 30 % de todas as proteínas codificadas pelo genoma de vários organismos. Elevadas quantidades de proteínas num estado de elevada pureza são necessárias quer para estudos farmacológicos, quer para estudos cristalográficos, daí a imperativa necessidade de desenvolver novos sistemas para a sobre-expressão heteróloga de proteínas membranares. Especificamente, nós testámos a aplicação de Brevibacillus choshinensis para a biosíntese da isoforma membranar da catecol-Ometiltransferase humana. No que diz respeito ao processo de produção, obteve-se uma moderada a elevada expressão num meio complexo com um valor de 45 nmol/h/mg para a actividade biológica da hMBCOMT, atingida às 20 horas de cultura a 37 ºC e 250 rpm. No que diz respeito à solubilização da proteína alvo, a eficiência de reconstituição para a hMBCOMT é nula na presença de detergentes iónicos tais como o SDS. No entanto, a aplicação de baixas concentrações de detergentes não-iónicos parece ser ideal para solubilizar a fracção membranar visto que a hMBCOMT recombinante retém elevados valores para a actividade biológica. Dos detergentes testados, a digitonina a 0.5 % (m/v) parece ser o mais adequado. De facto, o método descrito nesta tese é simples e poder-se-á tornar muito útil se aplicado num diagrama global para o isolamento da MBCOMT tendo em vista a sua caracterização bioquímica ou biofísica, onde se destaca a determinação da sua estrutura por cristalografia de raios-X ou estudos de interacção da hMCOMT com inibidores

Endothelium Activation during Severe Yellow Fever Triggers an Intense Cytokine-Mediated Inflammatory Response in the Liver Parenchyma

Yellow fever (YF) is a pansystemic disease caused by the yellow fever virus (YFV), the prototype species of the family Flaviviridae and genus Flavivirus, and has a highly complex host-pathogen relationship, in which endothelial dysfunction reflects viral disease tropism. In this study, the in situ endothelial response was evaluated. Liver tissue samples were collected from 21 YFV-positive patients who died due to the disease and five flavivirus-negative controls who died of other causes and whose hepatic parenchyma architecture was preserved. Immunohistochemical analysis of tissues in the hepatic parenchyma of YF cases showed significantly higher expression of E-selectin, P-selectin, intercellular adhesion molecule-1, vascular cell adhesion molecule-1, and very late antigen-4 in YFV-positive cases than in flavivirus-negative controls. These results indicate that endothelium activation aggravates the inflammatory response by inducing the expression of adhesion molecules that contribute to the rolling, recruitment, migration, and construction of the inflammatory process in the hepatic parenchyma in fatal YF cases

Brazilian Flora 2020: Leveraging the power of a collaborative scientific network

International audienceThe shortage of reliable primary taxonomic data limits the description of biological taxa and the understanding of biodiversity patterns and processes, complicating biogeographical, ecological, and evolutionary studies. This deficit creates a significant taxonomic impediment to biodiversity research and conservation planning. The taxonomic impediment and the biodiversity crisis are widely recognized, highlighting the urgent need for reliable taxonomic data. Over the past decade, numerous countries worldwide have devoted considerable effort to Target 1 of the Global Strategy for Plant Conservation (GSPC), which called for the preparation of a working list of all known plant species by 2010 and an online world Flora by 2020. Brazil is a megadiverse country, home to more of the world's known plant species than any other country. Despite that, Flora Brasiliensis, concluded in 1906, was the last comprehensive treatment of the Brazilian flora. The lack of accurate estimates of the number of species of algae, fungi, and plants occurring in Brazil contributes to the prevailing taxonomic impediment and delays progress towards the GSPC targets. Over the past 12 years, a legion of taxonomists motivated to meet Target 1 of the GSPC, worked together to gather and integrate knowledge on the algal, plant, and fungal diversity of Brazil. Overall, a team of about 980 taxonomists joined efforts in a highly collaborative project that used cybertaxonomy to prepare an updated Flora of Brazil, showing the power of scientific collaboration to reach ambitious goals. This paper presents an overview of the Brazilian Flora 2020 and provides taxonomic and spatial updates on the algae, fungi, and plants found in one of the world's most biodiverse countries. We further identify collection gaps and summarize future goals that extend beyond 2020. Our results show that Brazil is home to 46,975 native species of algae, fungi, and plants, of which 19,669 are endemic to the country. The data compiled to date suggests that the Atlantic Rainforest might be the most diverse Brazilian domain for all plant groups except gymnosperms, which are most diverse in the Amazon. However, scientific knowledge of Brazilian diversity is still unequally distributed, with the Atlantic Rainforest and the Cerrado being the most intensively sampled and studied biomes in the country. In times of “scientific reductionism”, with botanical and mycological sciences suffering pervasive depreciation in recent decades, the first online Flora of Brazil 2020 significantly enhanced the quality and quantity of taxonomic data available for algae, fungi, and plants from Brazil. This project also made all the information freely available online, providing a firm foundation for future research and for the management, conservation, and sustainable use of the Brazilian funga and flora