Function of a transcriptional mediator complex subunit in cell competition and proliferation in drosophila

Le développement d'un organisme nécessite une régulation fine l'expression des gènes, afin qu'ils ne soient exprimés que dans les bonnes cellules et au bon moment. Une meilleure compréhension de cette régulation est capitale puisque leur dérégulation mène à de nombreuses maladies, notamment aux cancers. La régulation de l'expression des gènes a lieu en grande partie lors de leur transcription en ARN, qui implique de nombreux acteurs, dont le complexe Médiateur (MED). Ce complexe évolutivement conservé de 25 à 30 sous-unités permet de relier les facteurs de transcription spécifiques (FT) liés aux enhancers des gènes à la machinerie de transcription contenant l'ARN polymérase II (PolII). Ces dernières années, plusieurs sous-unités du MED ont été reliées au développement de tumeurs. C'est le cas de Med19 aussi appelée Lung Cancer Metastasis-Related protein 1 (LCMR1) chez l'Homme, qui est systématiquement surexprimée dans une majorité de cancers. La diminution de la croissance tumorale observée en perte de fonction pour Med19 fait de cette protéine une cible thérapeutique potentielle. Cependant, l'absence de mutations perte de fonction connues pour Med19 chez les mammifères, a jusqu'à présent empêché d'accéder à son mode d'action, et de déterminer si sa surexpression est une cause ou une conséquence de l'état tumoral des cellules. Le premier mutant métazoaire de Med19 a été isolé au laboratoire chez la Drosophile, organisme modèle offrant des outils génétiques puissants (Boube et al 2014). Ma thèse a été consacrée à l'étude fonctionnelle et structurale de cette sous-unité MED chez la Drosophile dans les processus de prolifération et de différentiation des tissus. Dans un contexte où il avait été montré que Med19 sert de cofacteur au Facteurs de transcription de la famille HOX, nous avons établi au cours de ma thèse que Med19 collabore également avec Med1 au cours de l'hématopoïèse et de la formation du thorax pour réguler l'activité des facteurs de transcription de la famille GATA (Immarigeon et al. 2019, Immarigeon et al. 2020) Des interactions directes entre Med19 et les facteurs GATA, indiquent un rôle de cofacteur spécifique pour Med19 qui permettrait ainsi le recrutement du MED et de la PolII au niveau de leurs gènes cibles. L'équipe a montré que Med19 est requise ou pas pour la viabilité cellulaire en fonction du contexte tissulaire suggérant un rôle de Med19 dans la compétition cellulaire. Ce processus naturel de communication cellulaire permet l'élimination des cellules malades par les cellules saines environnantes. L'analyse des cellules mutantes pour Med19 m'a permis de confirmer qu'elles sont éliminées par compétition cellulaire.Proper development of a living organism requires fine regulation of gene expression, in order to insure that genes are expressed in the appropriate cells and at the proper time point. Dysregulation of gene expression leads to many human diseases, notably cancer. Regulation of gene expression occurs in large part during transcription of genes into RNA. This process requires many proteins, including the Mediator Complex (MED). This evolutionarily-conserved 25-30 multi-subunit complex acts as a bridge between DNA-linked transcription factors (TFs) and the transcription machinery including RNA polymerase II (Pol II). During the past few years, many MED subunits have been linked to tumour development. For example, Med19, also known as Lung Cancer Metastasis-related Protein 1 (LCMR1) in human, is overexpressed in a majority of cancer types, correlating with poor prognosis. Reduced tumour growth was observed under Med19 depletion in xenografts, making Med19 a potential therapeutic target. However, the lack of Med19 loss-of-function mutants in mammals impedes further analysis of Med19 mode of action and determining whether Med19 overexpression is a cause or consequence of tumorigenesis. In the lab, we isolated the first metazoan mutant for Med19 in the Drosophila model, that offers a large genetic and molecular toolbox. My PhD project focused on the functional and molecular analysis of the Drosophila Med19 Mediator subunit during proliferation and differentiation processes. Our group has already shown that a Med19 cofactor plays a role with transcription factors of the HOX family. During my PhD, we found that during haematopoiesis and thorax formation, Med19 is required, in collaboration with the Med1 subunit, for the target gene expression of another TF family, the GATA-type TFs (Immarigeon et al. 2019, Immarigeon et al. 2020). Direct interactions between Med19 and GATA TFs indicate that Med19 plays a role as a specific cofactor, allowing MED and Pol II recruitment to GATA target genes. In the group, Med19 has been shown to be required for cell viability depending on the tissular context, suggesting a Med19 function in "cell competition". This natural process of cell-cell communication allows elimination and replacement of unfit cells by their neighbouring better-fit cells. My analysis of Med19 mutant cell behaviour confirms its involvement in cell competition processes. Indeed, Med19-/- loser cells die through apoptosis, express the competition marker Azot, and are rescued by blocking competition mechanisms. Our data also demonstrate a more general role for Med19 in proliferation, apoptosis and in the regulation of the Myc proto-oncogene

Fonction d'une sous-unité du complexe médiateur dans la compétition et la prolifération cellulaire chez la drosophile

Le développement d'un organisme nécessite une régulation fine l'expression des gènes, afin qu'ils ne soient exprimés que dans les bonnes cellules et au bon moment. Une meilleure compréhension de cette régulation est capitale puisque leur dérégulation mène à de nombreuses maladies, notamment aux cancers. La régulation de l'expression des gènes a lieu en grande partie lors de leur transcription en ARN, qui implique de nombreux acteurs, dont le complexe Médiateur (MED). Ce complexe évolutivement conservé de 25 à 30 sous-unités permet de relier les facteurs de transcription spécifiques (FT) liés aux enhancers des gènes à la machinerie de transcription contenant l'ARN polymérase II (PolII). Ces dernières années, plusieurs sous-unités du MED ont été reliées au développement de tumeurs. C'est le cas de Med19 aussi appelée Lung Cancer Metastasis-Related protein 1 (LCMR1) chez l'Homme, qui est systématiquement surexprimée dans une majorité de cancers. La diminution de la croissance tumorale observée en perte de fonction pour Med19 fait de cette protéine une cible thérapeutique potentielle. Cependant, l'absence de mutations perte de fonction connues pour Med19 chez les mammifères, a jusqu'à présent empêché d'accéder à son mode d'action, et de déterminer si sa surexpression est une cause ou une conséquence de l'état tumoral des cellules. Le premier mutant métazoaire de Med19 a été isolé au laboratoire chez la Drosophile, organisme modèle offrant des outils génétiques puissants (Boube et al 2014). Ma thèse a été consacrée à l'étude fonctionnelle et structurale de cette sous-unité MED chez la Drosophile dans les processus de prolifération et de différentiation des tissus. Dans un contexte où il avait été montré que Med19 sert de cofacteur au Facteurs de transcription de la famille HOX, nous avons établi au cours de ma thèse que Med19 collabore également avec Med1 au cours de l'hématopoïèse et de la formation du thorax pour réguler l'activité des facteurs de transcription de la famille GATA (Immarigeon et al. 2019, Immarigeon et al. 2020) Des interactions directes entre Med19 et les facteurs GATA, indiquent un rôle de cofacteur spécifique pour Med19 qui permettrait ainsi le recrutement du MED et de la PolII au niveau de leurs gènes cibles. L'équipe a montré que Med19 est requise ou pas pour la viabilité cellulaire en fonction du contexte tissulaire suggérant un rôle de Med19 dans la compétition cellulaire. Ce processus naturel de communication cellulaire permet l'élimination des cellules malades par les cellules saines environnantes. L'analyse des cellules mutantes pour Med19 m'a permis de confirmer qu'elles sont éliminées par compétition cellulaire. En effet, les cellules Med19-/- meurent par apoptose, expriment le marqueur de compétition cellulaire Azot et sont sauvées lorsque l'on bloque le mécanisme de compétition. Nos données indiquent également que Med19 joue un rôle plus général dans la prolifération, l'apoptose et la régulation du proto-oncogène Myc. Une expérience de RNA-seq en condition de perte de fonction pour Med19 in vivo implique Med19 dans la réparation des dommages à l'ADN, ainsi que dans la réponse au stress oxydatif. Par ailleurs, une analyse structure-fonction de la protéine Med19, m'a permis d'identifier son domaine conservé CORE comme étant celui requis pour les fonctions de Med19 dans la prolifération et la survie cellulaire. Mes travaux combinant des approches expérimentales multidisciplinaires révèlent de nouvelles fonctions de Med19 dans le contrôle de la prolifération, la compétition, la survie des cellules, ainsi que dans la réponse au stress oxydatif et aux dommages à l'ADN. Par ailleurs, le lien que j'ai établi entre Med19 et le processus de compétition cellulaire ouvre de nouvelles pistes dans la compréhension du rôle de Med19 dans le développement des cancers puisqu'il a été proposé que les cellules cancéreuses utilisent la compétition cellulaire de manière précoce pour envahir les tissus sains lors de la formation de tumeur.Proper development of a living organism requires fine regulation of gene expression, in order to insure that genes are expressed in the appropriate cells and at the proper time point. Dysregulation of gene expression leads to many human diseases, notably cancer. Regulation of gene expression occurs in large part during transcription of genes into RNA. This process requires many proteins, including the Mediator Complex (MED). This evolutionarily-conserved 25-30 multi-subunit complex acts as a bridge between DNA-linked transcription factors (TFs) and the transcription machinery including RNA polymerase II (Pol II). During the past few years, many MED subunits have been linked to tumour development. For example, Med19, also known as Lung Cancer Metastasis-related Protein 1 (LCMR1) in human, is overexpressed in a majority of cancer types, correlating with poor prognosis. Reduced tumour growth was observed under Med19 depletion in xenografts, making Med19 a potential therapeutic target. However, the lack of Med19 loss-of-function mutants in mammals impedes further analysis of Med19 mode of action and determining whether Med19 overexpression is a cause or consequence of tumorigenesis. In the lab, we isolated the first metazoan mutant for Med19 in the Drosophila model, that offers a large genetic and molecular toolbox. My PhD project focused on the functional and molecular analysis of the Drosophila Med19 Mediator subunit during proliferation and differentiation processes. Our group has already shown that a Med19 cofactor plays a role with transcription factors of the HOX family. During my PhD, we found that during haematopoiesis and thorax formation, Med19 is required, in collaboration with the Med1 subunit, for the target gene expression of another TF family, the GATA-type TFs (Immarigeon et al. 2019, Immarigeon et al. 2020). Direct interactions between Med19 and GATA TFs indicate that Med19 plays a role as a specific cofactor, allowing MED and Pol II recruitment to GATA target genes. In the group, Med19 has been shown to be required for cell viability depending on the tissular context, suggesting a Med19 function in "cell competition". This natural process of cell-cell communication allows elimination and replacement of unfit cells by their neighbouring better-fit cells. My analysis of Med19 mutant cell behaviour confirms its involvement in cell competition processes. Indeed, Med19-/- loser cells die through apoptosis, express the competition marker Azot, and are rescued by blocking competition mechanisms. Our data also demonstrate a more general role for Med19 in proliferation, apoptosis and in the regulation of the Myc proto-oncogene. Finally, RNA-Seq analysis of imaginal discs bearing Med19 partial loss of function reveals a Med19 involvement in DNA damage and oxidative stress responses. Taking together, our data explain the elimination of Med19 mutant clones by cell competition. Furthermore, structure-function analysis of Med19 protein demonstrates the implication of the evolutionarily conserved CORE domain of Med19 in proliferation and apoptosis. We show that this domain is also required for Med19 integration into the MED complex. This project resulting from multiple experimental approaches reveals new functions of Med19 in cell competition, proliferation and survival that can be explained, at least in part by its involvement in oxidative stress and DNA Damage response. In addition, Med19 involvement in cell competition opens new insights for a better understanding of the link between the Med19 human counterpart and tumour development. Hence, it has been proposed that cancer cells have coopted cell competition in the early stages of healthy tissue invasion. This work thus paves the way for Med19 use as an early tumor marker as well as a new therapeutic target

Inducible degradation of the Drosophila Mediator subunit Med19 reveals its role in regulating developmental but not constitutively-expressed genes

The multi-subunit Mediator complex plays a critical role in gene expression by bridging enhancer-bound transcription factors and the RNA polymerase II machinery. Although experimental case studies suggest differential roles of Mediator subunits, a comprehensive view of the specific set of genes regulated by individual subunits in a developing tissue is still missing. Here we address this fundamental question by focusing on the Med19 subunit and using the Drosophila wing imaginal disc as a developmental model. By coupling auxin-inducible degradation of endogenous Med19 in vivo with RNA-seq, we got access to the early consequences of Med19 elimination on gene expression. Differential gene expression analysis reveals that Med19 is not globally required for mRNA transcription but specifically regulates positively or negatively less than a quarter of the expressed genes. By crossing our transcriptomic data with those of Drosophila gene expression profile database, we found that Med19-dependent genes are highly enriched with spatially-regulated genes while the expression of most constitutively expressed genes is not affected upon Med19 loss. Whereas globally downregulation does not exceed upregulation, we identified a functional class of genes encoding spatially-regulated transcription factors, and more generally developmental regulators, responding unidirectionally to Med19 loss with an expression collapse. Moreover, we show in vivo that the Notch-responsive wingless and the E(spl)-C genes require Med19 for their expression. Combined with experimental evidences suggesting that Med19 could function as a direct transcriptional effector of Notch signaling, our data support a model in which Med19 plays a critical role in the transcriptional activation of developmental genes in response to cell signaling pathways

The expression of <i>achaete</i> (<i>ac</i>) and <i>wingless</i> (<i>wg</i>) is impaired specifically in the domain of the wing imaginal disc where Med19AID is degraded.

(A) Confocal images of ap>TIR1; Med19AID wing imaginal disc immunostained for Ac and GFP (Med19AID detection). Upper row: Control wing disc in which Med19AID degradation did not occur (no driver). Bottom row: Wing disc in which Med19 degradation was induced for 3 hours in the dorsal compartment, using an apterous driver. Right column: Magnification in the anterior wing pouch Ac staining pattern emphasizing the loss of Ac expression in the dorsal row of cells of the anterior wing margin when Med19AID degradation is triggered in the dorsal compartment of the wing disc. (B) en>TIR1; Med19AID wing imaginal discs immunostained for Wg and GFP (Med19AID), in which the degradation of Med19AID was operated with the en> driver for 3 hours (bottom row), or not triggered (control, upper row). (TIF)</p

Original uncropped and unadjusted images for blots or gels from Figs 1A and 5D.

(TIF)</p

Med19^AID removal results in the deregulation a limited part of the wing imaginal disc transcriptome.

(A) Scheme depicting the experimental setup used to produce wing imaginal discs from ub>TIR1 Med19AID larvae in which Med19AID degradation has been triggered, or not (no Auxin control- see GFP signal), upstream of the RNA-seq analysis. (B) Differential gene expression analysis volcano plot showing the expression fold change after Med19AID degradation and associated adjusted p-values. 8753 genes found expressed in the wing imaginal disc are depicted. Genes with significative fold change (adjusted p-value 2FC 2FC >0,5).</p

The expression of most of canonical housekeeping (HK) genes is not affected by Med19AID depletion.

Scatter plot analysis of the expression fold change (Log2FC) of genes belonging to several families of housekeeping functions (x axis, list detailed in S3 Table). The red dashed lines mark Log2FC = +/ - 0.5. (TIF)</p

Scheme depicting the CRISPR/Cas9-based strategy used to generate <i>Med19^AID</i>, a <i>Med19</i> degradable and fluorescent allele.

The donner construct (middle) highlights the nature of the homology arms used to introduce the AID-GFP cassette by homologous recombination. Position of the PCR primers used to characterize the wt vs 19AID allele is shown. (TIF)</p

Degradation of Med19AID in the posterior compartment of the wing imaginal disc using the <i>engrailed</i> driver (<i>en</i>>).

(A) Confocal images of wing discs dissected from en>TIR1 Med19AID larvae either fed for one hour with NAA (1H), or mock treated (no auxin). (B) Box plot showing the Med19AID depletion level calculated as the posterior to anterior GFP intensity ratio in the wing pouch of en>TIR1; Med19AID wing imaginal discs (n = 5) obtained and imaged as in (A). (TIF)</p