Aspectos moleculares relacionados ao diagnóstico e progressão da Doença de Fabry

A Doença de Fabry (DF) é uma doença rara com herança ligada ao X causada pela deficiência de atividade da hidrolase lisossomal α-galactosidase A (α-GAL), codificada pelo gene GLA. Este defeito enzimático leva ao acúmulo de glicoesfingolipídios, principalmente globotriaosilceramida (Gb3) pelo corpo. Pacientes com a forma clássica apresentam baixa atividade residual da enzima com início dos sintomas na infância e desenvolvimento de sintomas cardíacos, cerebrovasculares e/ou renais. Pacientes com apresentações não clássicas tem atividade enzimática residual maior, início tardio dos sintomas e podem ser mono ou oligo-sintomáticos. Características marcantes da DF são alta variabilidade alélica e fenotípica. Dessa forma, o objetivo desta tese foi investigar aspectos moleculares relacionados ao diagnóstico e progressão da Doença de Fabry na população brasileira. Para triagem bioquímica de pacientes do sexo feminino em populações de risco, foi proposta uma metodologia de uso combinado de atividade de α-GAL em leucócitos e plasma. Com o uso de valores de referência gênero-específicos, esta metodologia amplamente acessível pode reduzir o número de amostras que necessitam de triagem genética em 35%. Com relação à triagem molecular, foi descrito um protocolo com a técnica de HRM (high resolution melting) para amostras de sangue coletadas em EDTA. Todas as variantes analisadas neste estudo resultaram em perfis distintos dos controles normais. Além disso, com exceção das variantes localizadas no éxon 7, também foi possível a identificação de todos os genótipos diferentes analisados. A análise molecular do gene GLA por sequenciamento de Sanger foi realizada em 408 pacientes brasileiros, provenientes de 213 famílias, com histórico familiar ou suspeita clínica de DF. Conforme o esperado para uma doença com mutações privadas, a maioria destas variantes foi encontrada em famílias únicas. Das 26 variantes identificadas em regiões codificantes, cerca de 80% eram do tipo missense, o que está de acordo com a literatura. Em seguida, a existência de genes modificadores do fenótipo cardíaco foi avaliada por análise de exoma de pacientes com ou sem doença cardíaca. A frequência da variante rs3188055 gene inositol polifosfato 5- fosfatase (INPP5F) foi significativamente maior no grupo com doença cardíaca. Portanto; INPP5F, envolvido na maturação e reciclagem dos endossomos e regulação negativa da 11 hipertrofia cardíaca, é um possível modulador da doença cardíaca em DF. Finalmente, a variabilidade fenotípica vista em mulheres com DF foi analisada com o uso de transcriptomas de células sanguíneas. Foram obtidos perfis de expressão distintivos para pacientes com diferentes manifestações: exclusivamente cardíacas, exclusivamente renais ou ambas. Os genes com expressão diferencial validados (DEFA1, A1B, A3; CEACAM8, PRKXP1, IFI44, IFI44L, IFIT1, HERC5, EIF2AK2 e RSAD2), representam possíveis vias especificas das manifestações analisadas, envolvidas com a variabilidade vista em DF, que podem auxiliar no manejo clínico dos pacientes.Fabry disease (FD) is a rare X-linked disorder resulting from deficient activity of the lysosomal hydrolase α-galactosidase A (α-GAL), encoded by the GLA gene. This deficiency leads to the accumulation of glycosphingolipids, mainly globotriaosylceramide (Gb3), throughout the body. Patients with the classical form of the disease have low residual enzymatic activity with childhood onset of symptoms and development of cardiac, cerebrovascular and/or renal complications. Patients with non-classical phenotypes have higher residual activity, later onset of symptoms and are mono or oligo-symptomatic. Striking features of FD are high allelic and phenotypic variability. Thus, the aim of this thesis was to investigate molecular aspects related to the diagnosis and progression of Fabry disease in the Brazilian population. For biochemical screening of female patients in risk populations, a methodology of combined use of α-GAL activity in leukocytes and plasma was proposed. With the use of gender-specific reference values, this widely accessible methodology can reduce the number of samples that require genetic screening by 35%. Regarding molecular screening, a protocol with high resolution melting (HRM) technique for blood samples collected in EDTA was described. All the variants analyzed in this study displayed different profiles from normal controls. In addition, with the exception of variants located in exon 7, it was also possible to identify all the different genotypes analyzed. The molecular analysis of the GLA gene by Sanger sequencing was performed in 408 Brazilian patients, from 213 families, with family history or clinical suspicion of FD. As expected for a disease with private mutations, most of these variants were found in single families. Of the 26 variants identified in coding regions, about 80% were missense, which is in agreement with the literature. Then, the existence of cardiac phenotype modifier genes was evaluated by exome analysis of patients with and without heart disease. The frequency of variant rs3188055 variant in Inositol Polyphosphate-5-Phosphatase F gene (INPP5F) was significantly higher in the group with heart disease. Therefore, INPP5F, which is involved in the maturation and recycling of endosomes and negative regulation of cardiac hypertrophy, is a possible modulator of cardiac disease in FD. Finally, the phenotypic variability seen in women with FD was analyzed with the use of transcriptomes from whole blood. Distinctive expression profiles were obtained for patients with different 13 manifestations: exclusively cardiac, exclusively renal or both. The validated genes with differential expression (DEFA1, A1B, A3, CEACAM8, PRKXP1, IFI44, IFI44L, IFIT1, HERC5, EIF2AK2 and RSAD2) indicate possible disease specific pathways involved in phenotypic variability seen in FD, which might aid in patient management

Micro e pequenas empresas industriais brasileiras à luz da política industrial: evolução dos indicadores de emprego, produção e produtividade nos anos 2000

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação)O presente trabalho tem como base o estudo das políticas industriais implementadas no Brasil nos anos 2000, com o enfoque nos estímulos direcionados para as micro e pequenas empresas. Para a análise da evolução da participação das micro e pequenas empresas na indústria de transformação brasileira, o estudo baseou-se, principalmente, na base de dados da Pesquisa Industrial Anual (PIA/IBGE). Foram sistematizados os indicadores de produção, emprego e produtividade e realizada uma comparação entre as empresas de pequeno porte e as médias e grandes empresas, com a finalidade de mostrar quais mudanças ocorreram no setor industrial considerando-se o porte das empresas

Effects of gene therapy on cardiovascular symptoms of lysosomal storage diseases

Lysosomal storage diseases (LSDs) are inherited conditions caused by impaired lysosomal function and consequent substrate storage, leading to a range of clinical manifestations, including cardiovascular disease. This may lead to significant symptoms and even cardiac failure, which is an important cause of death among patients. Currently available treatments do not completely correct cardiac involvement in the LSDs. Gene therapy has been tested as a therapeutic alternative with promising results for the heart disease. In this review, we present the results of different approaches of gene therapy for LSDs, mainly in animal models, and its effects in the heart, focusing on protocols with cardiac functional analysis

Phenotype-oriented NGS panels for mucopolysaccharidoses : validation and potential use in the diagnostic flowchart

Mucopolysaccharidosis (MPS) are a group of rare genetic disorders caused by deficiency in the activity of specific lysosomal enzymes required for the degradation of glycosaminoglycans (GAGs). A defect in the activity of these enzymes will result in the abnormal accumulation of GAGs inside the lysosomes of most cells, inducing progressive cellular damage and multiple organ failure. DNA samples from 70 patients with biochemical diagnosis of different MPSs genotypes confirmed by Sanger sequencing were used to evaluate a Next Generation Sequencing (NGS) protocol. Eleven genes related to MPSs were divided into three different panels according to the clinical phenotype. This strategy led to the identification of several pathogenic mutations distributed across all exons of MPSs-related genes. We were able to identify 96% of all gene variants previously identified by Sanger sequencing, showing high sensitivity in detecting different types of mutations. Furthermore, new variants were not identified, representing 100% specificity of the NGS protocol. The use of this NGS approach for genotype identification in MPSs is an attractive option for diagnosis of patients. In addition, the MPS diagnosis workflow could be divided in a two-tier approach: NGS as a first-tier followed by biochemical confirmation as a second-tier

DETECÇÃO DE SANGUE POR KASTLE-MEYER EM DIFERENTES TECIDOS APÓS A LAVAGEM COM DETERGENTE CONTENDO OXIGÊNIO ATIVO

The Kastle-Meyer test (KM) is a presumptive test for blood detection, commonly utilized for orientation in expertise exams. At crime scenes, it is common that the criminals seek to remove the blood stains present at the scene, in an attempt to hide traces, being washing with detergent the most common. Already was evidenced that oxygen active detergents, with sodium percabonate in your composition can inactive the KM test, but it has not yet been tested if another oxygen active detergent without this compound could inactivate the test. In this sense, the present study aimed to analyze the result of the KM test in fabrics with blood washed with an oxygen active detergent, to verify a possible inactivation of the referred test. For this, were utilized different fabrics common in clothe confection, which were exposed to blood for different times. After the exposition time, the fabrics were washed with the oxygen active detergent Vantage and parallelly with the detergent Ariel, aiming to evidence possible differences in the hematic material detection by the reagent according to the type of detergent utilized. The results obtained in this study showed that the tested oxygen active detergent didn’t compromise the capacity of KM test in detect blood in visible stains. These data reinforce the validity of the KM test in the presumptive detection of blood, even after the washing of fabrics with detergent indicated for stain removal. La prueba de Kastle-Meyer (KM) es una prueba presuntiva para la detección de sangre, comúnmente utilizada para orientación sobre exámenes forenses. En las escenas del crimen, es común buscar eliminar las manchas presentes en el sitio, en un intento de ocultar rastros, siendo el lavado con detergente el más común. Se ha evidenciado que los detergentes de oxígeno activo con percarbonato de sodio en su composición son capaces de inactivar la prueba KM, pero aún no se había probado si otros detergentes de oxígeno activo, sin este componente, podrían inactivar la prueba. En este sentido, el presente estudio tuvo como objetivo analizar los resultados de la prueba km en tejidos sanguíneos lavados con un detergente de oxígeno activo, con el fin de verificar una posible inactivación de la prueba antes mencionada. Para ello, se utilizaron diferentes tejidos comunes en la fabricación de ropa, que fueron expuestos a la sangre durante diferentes épocas. Tras el tiempo de exposición, los tejidos se lavaron con el detergente de oxígeno activo Vantage y, en paralelo, con detergente ariel, con el fin de evidenciar posibles diferencias en la detección de material hemático por el reactivo según el tipo de detergente utilizado. Los resultados obtenidos en este estudio mostraron que el detergente con oxígeno activo probado no comprometió la capacidad de la prueba KM para detectar sangre en manchas visibles.O teste de Kastle-Meyer (KM) é um teste presuntivo para a detecção de sangue, comumente utilizado para a orientação em exames periciais. Em cenas de crime, é comum que busquem remover as manchas presentes no local, na tentativa de ocultar vestígios, sendo a lavagem com detergente a mais comum. Já foi evidenciado que detergentes oxigênio ativo, com percarbonato de sódio em sua composição são capazes de inativar o teste de KM, mas ainda não havia sido testado se outros detergentes oxigênio ativo, sem esse componente, poderiam inativar o teste. Nesse sentido, o presente estudo teve por objetivo analisar o resultado do teste de KM em tecidos com sangue, lavados com um detergente oxigênio ativo, a fim de verificar uma possível inativação do referido teste. Para isso, foram utilizados diferentes tecidos comuns na confecção de roupas, os quais ficaram expostos ao sangue por diferentes tempos. Após o tempo de exposição, os tecidos foram lavados com o detergente oxigênio ativo Vantage e, paralelamente, com o detergente Ariel, com o intuito de evidenciar possíveis diferenças na detecção de material hemático pelo reagente de acordo com o tipo de detergente utilizado. Os resultados obtidos nesse estudo mostraram que o detergente com oxigênio ativo testado não comprometeu a capacidade do teste KM em detectar sangue nas manchas visíveis. Esses dados reforçam a validade do teste de KM na detecção presuntiva de sangue, mesmo após a lavagem dos tecidos com detergente indicado para a remoção das manchas