Clonagem e expressão da celulase Xf-818 de Xylella Fastidiosa em Escherichia Coli

Xylella fastidiosa's genome was the first of a plant pathogen to be completely sequenced. Through comparative sequence analysis many genes were identified and, among them, several potentially involved in plant-pathogen interaction. However, the biological role of each gene should be assigned experimentally. On this regard, heterologous protein expression is a powerful tool to produce proteins from such genes, allowing their characterization. X. fastidiosa lives inside xylem vessels and eventually would degrade pit membranes from xylem cells to move radialy into the host. The identification of several putative plant cell wall degrading enzymes on X. fastidiosa genome prompted the assession of the function of such proteins. The open reading frame (ORF) Xf-818 was cloned into expression vector pET20b and E. coli cells harboring such plasmid exhibited cellulase activity. Using IPTG at 0.4 mmol L-1 with a 12 h incubation at 32°C are the best conditions to produce higher amounts of heterologous protein. The enzyme degrades cellulose confirming the endoglucanase activity of Xf-818.Xylella fastidiosa foi a primeira bactéria fitopatogênica que teve seu genoma completamente seqüenciado. A identificação de diversos genes, através de similaridade de seqüências, indicou os possíveis mecanismos de patogenicidade da bactéria. Entretanto, a determinação da função de um gene requer a confirmação experimental e, neste aspecto, a expressão heteróloga é uma poderosa ferramenta. X. fastidiosa coloniza somente o xilema das plantas hospedeiras e a identificação putativa de diversos genes semelhantes a enzimas que degradam a parede celular vegetal, estimularam o presente estudo de catacterização destas enzimas. A clonagem da ORF Xf-818 de X. fastidiosa no vetor de expressão pET20b possibilitou a produção da proteína heterologamente em E. coli. O emprego de IPTG a 0,4 mmol L-1 com 12 h a 32°C, possibilitou as melhores condições para E. coli produzir a proteína heteróloga. Clones de E. coli que expressam Xf-818, apresentam atividade celulásica, degradando eficientemente a celulose. A identificação de Xf-818 como uma endoglicanase foi assim confirmada

Use of Agaricus blazei and Lentinula edodes extracts for post-harvest control of gray mold in ‘Itália’ grape

En la protección de uva ‘Italia’ en postcosecha contra la Botrytis cinerea se evaluó in vivo los efectos directos e indirectos de los extractos acuosos de la seta Agaricus blazei y Lentinula edodes por el tratamiento de los racimos antes o después de la inoculación con el patógeno. Para ello se realizaron dos pruebas: 1) los racimos de uva fueron inoculados y, después de 4 h, rociados con diferentes concentraciones de los extractos de basidiocarpos (0.0, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 o 40 , 0%), 2) rácimos fueron o no, rociados con extractos de A. blazei (5,0%) 24, 48, 72 o 96 h antes de la inoculación del hongo. Para la inoculación, en cada racimo fueran heridos 10 bayas, haciéndose un hueco de ±2 mm de profundidad, procediendo a continuación, rociar la suspensión de conidios (105 conidios mL-1). Después del tratamiento, los grupos se mantuvieron a 25±1 º C/80-90% de humedad relativa y fue evaluado diariamente la incidencia y severidad de podredumbre. Lo efecto in vitro de extractos de A. blazei y L. edodes en el control del patógeno fue evaluado para determinar si estos agentes ejercen un efecto directo sobre el crecimiento micelial y la germinación de conidias de B. cinerea. Los resultados mostraron que los extractos de A. blazei y L edodes no pudieran controlar la pudrición causada por B. cinerea en uva ‘Italia’, cuando se aplica antes o después de la inoculación del hongo. In vitro, los extractos de los basidiocarpos estimulan la germinación de las esporas de B. cinerea en las concentraciones ensayadas; en relación a lo crecimiento del micelio, L. edodes se ha retrasado, mientras que A. blazei estimulado.Na proteção de uva ‘Itália’ pós-colheita contra Botrytis cinerea avaliou-se in vivo o efeito direto e indireto dos extratos aquosos dos cogumelos Agaricus blazei e Lentinula edodes através do tratamento dos cachos antes ou após a inoculação com o patógeno. Para tanto se realizaram dois ensaios: 1) cachos de uva foram inoculados e, após 4 h, aspergidos com diferentes concentrações dos extratos dos basidiocarpos (0,0; 2,5; 5,0; 10,0; 20,0 ou 40,0%); 2) cachos foram, ou não, aspergidos com extrato de A. blazei (5,0%) 24, 48, 72 ou 96 h antes da inoculação do fungo. Para inoculação, em cada cacho foram feridas 10 bagas, fazendo-se um furo por baga de ±2 mm de profundidade, procedendo-se em seguida, a aspersão da suspensão de conídios (±105 conídios mL-1). Após os tratamentos, os cachos foram mantidos a 25±1 ºC/80-90% UR e avaliados diariamente quanto à incidência e severidade da podridão. O efeito in vitro dos extratos de A. blazei e L. edodes no controle do patógeno foi avaliado com o intuito de verificar se tais agentes exercem efeito direto sobre o crescimento micelial e a germinação de conídios de B. cinerea. Os resultados mostraram que os extratos de A. blazei e L. edodes não controlaram a podridão causada por B. cinerea em uva ‘Itália’, quando aplicados antes ou após a inoculação do fungo. Nos ensaios in vitro, ambos os extratos dos basidiocarpos estimularam a germinação dos conídios de B. cinerea nas concentrações testadas; quanto ao crescimento micelial, L. edodes retardou, enquanto A. blazei estimulou.For protecting ‘Itália’ against Botrytis cinerea in the post harvest it was evaluated in vivo direct and indirect effect of water based extracts of Agaricus blazei and Lentinula edodes treating grape bunches before or after inoculating the pathogen. Two trials were performed: 1) grape bunches were inoculated before and after 4 h they were sprayed with different concentrations of extracts from basidiocarps (0.0; 2.5; 5.0; 10.0; 20.0 or 40.0%); 2) bunches were sprayed or not with A. blazei extracts (5,0%) 24, 48, 72 or 96 h before pathogen inoculation. For inoculation, in each bunch, 10 berries were injured with a ±2 mm deep sting and sprayed with a conidial suspension (±105 conidia mL-1). After treatment, bunches were kept at 25±1 ºC/80-90% RH and daily evaluated for incidence and severity of rottenness. The in vitro effect of A. blazei e L. edodes extracts for pathogen control were evaluated in order to verify if these agents have a direct effect over mycelia growth and B. cinerea conidia germination. Results show that A. blazei e L edodes extracts did not control rottenness caused by B. cinerea in ‘Italia’ grapes when sprayed before or after fungus inoculation. In the in vitro trials, both basidiocarps extracts stimulated B. cinerea conidia germination at the tested concentrations; regarding mycelia growth, L. edodes had negative, while A. blazei had positive effect

Fumigation of 'itália'grape with acetic acid for postharvest control of botrytis cinerea

Visando a avaliar o efeito do vapor de ácido acético (AA) como medida alternativa no controle pós-colheita do mofo-cinzento (Botrytis cinerea) em uva 'Itália', foram conduzidos dois ensaios in vivo onde se avaliou o efeito direto e indireto do AA através do tratamento dos cachos antes e após a inoculação do patógeno, sendo: 1) cachos de uva foram inoculados e, após 4 h, vaporizados com AA (0,0; 0,25; 0,5; 1,0 ou 2,0 mL 100 L-1 vol. de câmara) em tambores herméticos (200 L), a 25±1 ºC / 70-80 % UR, por 30 min; 2) cachos foram, ou não, vaporizados com AA (1 mL 100 L-1 vol. de câmara) e, após 24; 48; 72 ou 96 h, inoculados com B. cinerea. Para inoculação, em cada cacho, 10 por tratamento, foram feridas 10 bagas, fazendo-se um furo por baga de ±2 mm de profundidade, procedendo-se, em seguida, aspersão de suspensão de esporos (±105 conídios mL-1). Após os tratamentos, os cachos foram mantidos a 25±1 ºC / 80-90 % UR e avaliados diariamente quanto à incidência e severidade da podridão. O efeito in vitro do vapor de AA no controle do patógeno foi avaliado com o intuito de verificar se tal agente estaria exercendo efeito direto sobre o crescimento micelial e a germinação de conídios de B. cinerea. Nos ensaios in vivo, o vapor de AA controlou a podridão de B. cinerea em uva 'Itália', nos cachos inoculados antes ou após o tratamento com AA, sendo as uvas inoculadas 48 h após o tratamento, as que apresentaram menor índice de doença. In vitro, o AA exerce efeito direto sobre o crescimento micelial e a germinação de conídios de B. cinerea.Two in vivo trials were carried out in order to evaluate the effect of acetic acid vapor (AA) as an alternative for postharvest control of gray mold (Botrytis cinerea) in 'Itália' grapes. The direct and indirect effect of AA over treated bunches before and after pathogen inoculation was evaluated. In trial 1, grape bunches were inoculated and after 4 h submitted to AA vapors (0.0, 0.25, 0.5, 1.0 or 2.0 mL) in hermetic chambers (200 L), at 25±1 ºC / 70-80 % RH, for 30 min. In trial 2, grape bunches were vaporized or not with AA (1 mL 100 L-1) and after 24, 48, 72 or 96 h, inoculated with B. cinerea. For inoculation, in each bunch (10 per treatment) 10 berries were injured with a ±2 mm deep puncture and sprayed with a spore suspension (±105 conidia mL-1). After treatments, bunches were stored at 25±1 ºC / 80-90 % RH and daily evaluated regarding rot incidence and severity. The in vitro effect of AA vapor on pathogen control was evaluated in order to verify if this agent would directly affect mycelia growth and B. cinerea conidia germination. In the in vivo trials, AA vapor control B. cinerea rot in 'Itália' grape in bunches inoculated before and after treatment with AA. Grapes inoculated 48 h after treatment with AA showed the lowest disease incidence index. In vitro AA has a direct effect on mycelia growth and conidia germination of B. cinerea

Quitosana e fungicidas no controle pós-colheita de Guignardia citricarpa e na qualidade de laranjas 'Pêra Rio'

Citrus fruits are affected by the black spot disease caused by the fungus Guignardia citricarpa. Chitosan can be used as covering for fruits and may delay the ripening process and inhibit the growth of some fungi. Thus, the control of citrus black spot using chitosan and the fungicides thiabendazole and imazalil was assessed in addition to the physicochemical quality of 'Pêra Rio' oranges. The oranges were immersed into chitosan, thiabendazole or imazalil, and in chitosan mixed with both fungicides. The fruits were then stored at 25 °C, 80% RH, for 7 days and, after this storage period, subjected to physicochemical analyses. Chitosan in association with the fungicides reduced black spot in 'Pêra Rio' oranges and delayed the change in the orange skin colour from green to yellow during the postharvest storage. Total soluble solids, titratable acidity, pH, ascorbic acid content and ratio were not influenced by the treatments. Thus, chitosan applied with the fungicides thiabendazole and imazalil showed potential to control the development of black spot lesions on 'Pêra Rio' oranges during the postharvest period.Os frutos cítricos são afetados pela pinta preta dos citros, causada pelo fungo Guignardia citricarpa. A quitosana pode ser utilizada como revestimento de frutos, sendo capaz de atrasar o processo de maturação e inibir o crescimento de fungos. Dessa maneira, o controle da pinta preta utilizando quitosana e os fungicidas tiabendazole e imazalil foi avaliado, assim como a qualidade físico-química de laranjas 'Pêra Rio'. Frutos de laranja foram imersos em quitosana, tiabendazole ou imazalil, e em quitosana em mistura com ambos os fungicidas. Os frutos foram armazenados a 25°C, 80% UR, por 7 dias e após o período de armazenamento foram submetidos a análises fisico-químicas. Quitosana em associação com os fungicidas reduziu o aparecimento da pinta preta em laranjas 'Pêra Rio' e atrasou a alteração de verde para amarelo da cor da casca das laranjas durante o armazenamento pós-colheita. Os sólidos solúveis totais, a acidez titulável, o pH, o ácido ascórbico e o ratio não sofreram influência dos tratamentos. Deste modo, a quitosana em aplicação com os fungicidas tiabendazol e imazalil aumentou o potencial de controle da pinta preta em laranjas 'Pêra Rio' em pós-colheita, mantendo a qualidade dos frutos cítricos.Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq

Detection of fungi in brazilwood seeds (Caesalpinia echinata Lam.) collected during seed formation and dispersion

O pau-brasil é uma espécie florestal que tem imenso potencial de utilização, porém, atualmente, encontra-se enquadrada na categoria de extinção sendo importantes as ações que contribuírem para retirá-la desse contexto. As espécies florestais tropicais regeneram-se por vários mecanismos e, dentre estes, a semente é um dos principais, devendo-se atentar para sua qualidade sanitária e fisiológica. Existem poucos relatos sobre a ocorrência de fungos em sementes de pau-brasil e os trabalhos existentes não esclarecem em que momento da formação das sementes ocorre a incidência desses fungos. Objetivou-se através deste trabalho verificar a incidência de fungos durante o processo de formação e dispersão das sementes de pau-brasil. Foram analisadas, pelo método do papel de filtro, sementes coletadas em diferentes momentos da sua formação (após antese e após deiscência). Os principais fungos detectados foram Cladosporium cladosporioides, Pestalotiopsis maculans, Fusarium sp. e Epicoccum sp. Outros fungos encontrados em menor incidência foram Aspergillus spp., Nigrospora sp. e Penicillium sp. C. cladosporioides e Pestalotiopsismaculans estavam presentes nas sementes desde o início, na coleta aos 40 dias pós-antese, tendo a incidência aumentada ao longo do tempo, atingindo 100% nas sementes com um e dois dias de deiscência. Fusarium sp. foi detectado nas sementes coletadas após a deiscência, tendo sua incidência aumentada à medida que as sementes permaneceram no solo.Brazilwood, also known as Pau-Brasil or Pernambuco, (Caesalpinia echinata Lam. Syn. Guilandina echinata (Lam.) Spreng.) is a Brazilian forest tree species which has important commercial uses but is at present listed as an endangered species by the International Union for Conservation of Nature (IUCN). Removal of brazilwood from the IUCN endangered species list is important roe its continued comercial utilization. Tropical forest species are propagated by several mechanisms but seeds are one of the main processes, which means that the health and physiological quality of the seeds of such species are important factors in their propagation. Our objective was to verify the incidence of fungi during the formation and dispersion of C. Echinata seeds because there are few accounts regarding the incidence of fungi in C. Echinata seeds and the reports that do exist do not clarify the point in seed formation when fungal infection occurs. We used the health-test to analyze seeds collected at different seed formation stages (post-anthesis and dehiscence). The main fungi detected being Cladosporium cladosporioides, Pestalotiopsis maculans and Epicoccum sp, with a lower incidence of Aspergillus sp, Fusarium sp., Nigrospora sp. and Penicillium sp. We found that C. cladosporioides and P .maculans were present in seeds since the beginning of seed formation, at the 40 days post-anthesis collection, and that the incidence of fungi increased with time reaching 100% in seeds with one and two days of dehiscence. We detected Fusarium sp. in seeds collected after dehiscence and the incidence increased while the seeds remained in contact with soil.FAPES