Papel do fator de crescimento transformante-beta1 (TGF-B1) na proliferação celular e expressão de metaloproteinases de matriz e seus inibidores teciduais em fibroblastos gengivais humanos tratados com ciclosporina A

Orientadores: Ricardo Della Coletta, Oslei Paes de AlmeidaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Ciclosporina A é a principal droga imunossupressora utilizada na prevenção da rejeição de transplantes. Esta droga induz inúmeros efeitos colaterais, incluindo o aumento gengiva I observado em 8 a 70% dos pacientes em tratamento com a droga. Embora a patogênese dos aumentos gengivais seja desconhecida, recentemente foi demonstrado que ciclosporina A induz a expressão do fator de crescimento transformante-betal (TGF-Bl). O objetivo deste trabalho foi investigar o papel de TGF-Bl na patogênese do aumento gengiva I induzido por ciclosporina A, explorando um possivel efeito autócrino deste fator na proliferação celular e na expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) e seus inibidores teciduais (TIMPs). Para determinar o efeito de ciclosporina A na expressão e produção de TGF-Bl, culturas primárias de fibroblastos gengivais humanos normais foram tratadas com concentrações crescentes de ciclorporina A por 24 h, e os níveis de expressão e produção de TGF- (beta) 1 analizados por pelo método sem i-quantitativo da transcriptase reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e EUSA, respectivamente. Os efeitos de ciclorporina A e TGF - (beta)1 na proliferação de fibroblastos gengivais foram analisados através de 4 ensaios de proliferação celular, incluindo ensaio de crescimento celular, análise da incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU), quantificação da expressão imunohistoquímica do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e potencial mitótico. O efeito de ciclosporina A na expressão de MMP-l, MMP-2, TIMP-l e TIMP-2 foram determinados por RTPCR. Para determinar o efeito autócrino de TGF-Bl na proliferação celular e na expressão de MMPs e TIMPs, nós utilizamos oligonucleotides complementares a região de iniciação da tradução de TGF-Bl. Ciclosporina A, em níveis similares aos encontrados no sangue de pacientes em uso da droga, significantemente estimulou a expressão de produção de TGF-Bl. De uma maneira similar, ciclosporina A estimulou a proliferação celular e inibiu a expresao de MMP-l e MMP-2 por fibroblastos gengivais. Os níveis de TIMP-l e TIMP-2 foram inalterados pelo tratamento com ciclorporina A. O tratamento com ciclosporina A em combinação com o bloqueio na produção de TGF-(beta)1 por oligonucleotideos complementares reduziu os efeitos de ciclosporina A na proliferação celular e na expressão de MMP-l e MMP-2 por fibroblastos gengivais. Nossos resultados demonstram que ciclosporina A induz a expressão TGF-(beta)1 em fibroblastos gengivais, o qual de uma maneira autocrina exacerba a proliferação e reduz a expressão de MMPs em fibroblastos gengivais normaisAbstract: Cyclosporin A (CyA) is a widely used immunosuppressant which possesses significant side effects including gingival overgrowth. The pathogenesis of this condition is not ful/y understood. However, recent studies showed that CyA regulates the transcription of several cytokines including transforming growth fador-betal (TGF-(beta)l). The aim of this study was to analyze the potential role of TGF-Bl in the pathogenesis of CyA-induced gingival overgrowth. We hypothesize that TGF-(beta)1 is an important autocrine regulator of cel/ proliferation, synthesis of matrix metal/oproteinases (MMPs) and its tissue inhibitors TIMPS in the experimental settings of CyA induced gingivalovergrowth. To test these hypothesis gingival fibroblasts (GF) from normal gingival were incubated with increasing concentrations of CyA and the expression and production of TGF-Bl determined by RT-PCR and ELISA. Proliferative activity of CyA-treated GF was studied by growth curve (via cel/ counting), BrdU incorporation, quantification of PCNA and mitotic potential. MMPs expression levels were analyzed by RT-PCR. To determine the effects of TGF-Bl on the proliferation rate and on the expression of MMPs by GF under CyA treatment, the cells were incubated with CyA and antisense oligonucleotides (AON) against the TGF-Bl mRNA. CyA simultaneously stimulated TGF-Bl expression, increased proliferation and inhibited expression of MMP-l and MMP-2 with a slight effect on TIMP-l and TIMP-2 expressions. Both CyA and TGF-(beta)1 stimulated significantly the proliferation of GF in a dose-dependent manner. When TGF-Bl was inhibited using specific antisense oligonucleotides (AON) a reduced TGF(beta)1 production was noticed (demonstrated by EUSA) with no signifjcant effect on the mRNA levels. When cells were treated with AON simultaneously with CyA, the effects of CyA on proliferation and expression of MMPs were neutralized, the original proliferation rate and MMPs expression were restored. Our investigation of the molecular events that lead to CyA-induced gingival overgrowth showed that TGF-Bl in an autocrine fashion upregulates proliferation and downregulates expression of MMPs, which may underlie the clinical changes associated with CyA treatmentDoutoradoPatologiaDoutor em Estomatopatologi

A prevalência de casos de fibrose e cirrose hepática na população brasileira no período entre 2014 a 2018 / The prevalence of liver fibrosis and cirrhosis cases in the brazilian population from 2014 to 2018

A fibrose hepática é caracterizada por danos subsequentes no fígado gerando cicatriz. O estimulo nocivo leva a inflamação, promovendo desorganização da arquitetura tecidual, e por fim disfunção hepática. O diagnóstico é primordialmente morfológico, pela análise histológica da biópsia do fígado. O diagnóstico precoce mostrou-se importante, visto a melhor resposta terapêutica dos pacientes na fase inicial. O avanço da fibrose para cirrose hepática é dinâmico, tendo diversas etiologias e complicações associadas. Na clínica, a CH é dividida em compensada e descompensada, dependendo das complicações secundárias à hipertensão portal e insuficiência hepática. Na compensada, nota-se pouco ou nenhum sinal e sintoma e as principais manifestações são inespecíficas. Já a descompensada, apresenta complicações como hemorragia digestiva alta, encefalopatia hepática, ascite e peritonite bacteriana espontânea. Além destas complicações, também são consideradas síndrome hepatorrenal e carcinoma hepatocelular. Com base no DATASUS, foi possivel avaliar epidemiologicamente as alterações hepáticas na população brasileira, sendo possível destacar uma maior prevalência na região sudeste, e no sexo masculino, estando relacionado a fatores históricos e socioeconômico. Vale ressaltar que a frequência de casos se manteve nos anos seguintes. Neste sentido, o estudo visa contribuir para direcionar medidas políticas de promoção e prevenção das diferentes causas das alterações hepáticas analisadas

A prevalência de casos da doença de Crohn na população brasileira no período entre 2013 a 2017 / The prevalence of Crohn's disease cases in the brazilian population from 2013 to 2017

A doença de Crohn (DC) é uma alteração do trato gastrointestinal (TGI), de causa indeterminada, podendo acometer qualquer porção do trato digestório, sendo o íleo, cólon e região perianal as regiões mais comuns de ocorrer. É uma doença particularizada de qualquer outra doença digestiva, pelo local da lesão, distribuição e infiltração no epitélio intestinal. Sabe-se que mesmo tendo origem indeterminada, apresenta uma variação do equilíbrio dos microrganismos intestinais que levam ao aparecimento de autoanticorpo que provocam lesões e ulcerações. Por ser uma doença autoimune a DC é uma enfermidade que não apresenta cura, sendo seu tratamento dividido em primário, secundário, cirúrgico e nutricional. Objetivou-se descrever a situação epidemiológica de óbitos decorrentes da DC nos estados brasileiros, apresentando o número de mortes por DC, comparando os dados por sexo e por região do país no período de 2013 a 2017. Os dados foram obtidos por análise de informações no DATASUS do Ministério da Saúde. A partir das informações colhidas observou-se que o sexo influencia minimamente, mas as regiões mais desenvolvidas apresentam maiores índices de óbitos em função dos fatores externos, como presença de ambiente mais estressante, poluição, alimentação industrializada e presença de transgênicos, que desencadeiam a DC. Os dados coletados são condizentes apontando maior incidência da enfermidade na Região Sudeste. Em contrapartida observou-se que a região Norte é a que apresenta menor índice da DC, sendo esta a região menos industrializada do país. Com base neste estudo é possível identificar a influências de fatores externos no desenvolvimento da DC e permite determinar medidas para direcionar a promoção de saúde , reduzindo assim incidência e prevalência da comorbidade , por meio de fatores que influenciam

Analise histopatologica e estudo da expressão de PCNA, p53, AgNOR e de metaloproteinases de matriz no basaloide escamoso da cavidade oral

Orientador : Ricardo Della ColettaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Carcinoma Basalóide Escamoso (CBE) é uma variante pouco comum, porém muito agressiva do Carcinoma Espinocelular (CEC) que acomete preferencialmente o trato aerodigestivo superior. Relatamos 2 casos de CBE comparando seu potencial de proliferação e invasividade com CEC indiferenciados com igual localização e estado TNM, de pacientes com mesma idade e sexo. A classificação dos tumores foi feita pela análise das caracteristicas histopatológicas com auxilio das colorações de hematoxilina e eosina (HE), ácido periódico de schiff (PAS), alcian blue e reação de imunohistoquímica demonstrando a presença de laminina. A atividade de proliferação foi estudada pelos métodos quantitativos e morfológicos de AgNORs (região organizadora nucleolar arginofílica), análise imunohistoquímica da expressão de PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular) além da determinação do índice mitótico e o potencial de invasão foi avaliado pela reação em cadeia de polimerase - transcriptase reversa (RT -PCR) para metaloproteinases de matriz (MMPs). A presença de mutações de p53 foi também verificada por imunohistoquímica. As características histológicas foram semelhantes as previamente descritas. Os índices de AgNOR e PCNA foram significativamente mais altos nos casos de CBE comparando com os casos de CEC. Imunohistoquímica.para a proteína p53 mostrou uma maior quantidade de células positivas, além de uma coloração mais intensa nos CBEs que nos CECs. RT-PCR mostrou maior expressão de MMP-1, MMP-2 e MMP-9 nos CBEs. Esses resultados sugerem que os CBEs apresentam um comportamento mais agressivo que os CECs indiferenciadosAbstract: Basaloid squamous carcinoma (BSC) is an uncommon aggressive variant of squamous cell carcinoma (SCC) with a predilection for the head and neck. In the English literature, approximately 40 cases of BSC have been described in the oral cavity. In this study, clinicopathol99ic features of 2 cases of BSC affecting the buccal mucosa are discribed. Additionally, we compared the proliferative and invasive potential of BSC cells with poorly-differentiated SCC, matched for age, sex, site and TNM status. Proliferative activity was studied by the argyrophilic nuclear organizer region (AgNOR) method and immunohistochemical quantification of proliferating cell nuclear antigen (PCNA). The invasive potential was evaluated by semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) for matrix metalloproteinases (MMPs). Alterations of p53 and the presence of laminin were also investigated by immunohistochemistry. The tumors showed many clinical and histopathologic similarities to cases previously reported. The AgNOR and PCNA indices were significantly higher in both cases of BSC than in SCC. Immunostaining for the p53 protein showed a higher percent of positive cells, and more intense staining in the BSC than in the SCC tissues. RT-PCR studies clearly demonstrated that the expression of MMP-1, MMP-2, and MMP-9 were higher in cells from BSCs than from SCCs. Taken together, the data described here are compatible with the concept that BSC has a more aggressive biologic behavior than the conventional SCCMestradoMestre em Biologia e Patologia Buco-Denta

ATM and PRDM9 regulate SPO11-bound recombination intermediates during meiosis

Meiotic recombination is initiated by SPO11-induced double-strand breaks (DSBs). In most mammals, the methyltransferase PRDM9 guides SPO11 targeting, and the ATM kinase controls meiotic DSB numbers. Following MRE11 nuclease removal of SPO11, the DSB is resected and loaded with DMC1 filaments for homolog invasion. Here, we demonstrate the direct detection of meiotic DSBs and resection using END-seq on mouse spermatocytes with low sample input. We find that DMC1 limits both minimum and maximum resection lengths, whereas 53BP1, BRCA1 and EXO1 play surprisingly minimal roles. Through enzymatic modifications to END-seq, we identify a SPO11-bound meiotic recombination intermediate (SPO11-RI) present at all hotspots. We propose that SPO11-RI forms because chromatin-bound PRDM9 asymmetrically blocks MRE11 from releasing SPO11. In Atm–/– spermatocytes, trapped SPO11 cleavage complexes accumulate due to defective MRE11 initiation of resection. Thus, in addition to governing SPO11 breakage, ATM and PRDM9 are critical local regulators of mammalian SPO11 processing

Expression and Activity of Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) in the development of rat first molar tooth germ

Tooth germ development is associated with morphological and biochemical changes of the dental papilla and enamel organ. Enzymes with gelatinolytic activities were studied by semiquantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and enzymography in tooth germ of newborn to 15-day-old rats. Three major bands with gelatinolytic activity were detected at all periods and characterized as the latent and active forms of MMP-2 using their molecular weight and activity dependent on Zn++ and Ca++ ions as criteria. Expression and activity of MMP-2 increased progressively from 0 to 15 days after birth. Mechanical separation of the tooth germ from 10-day-old rats showed that the gelatinolytic activity was localized mainly in the dental papilla and not the dental organ. These data indicate that the expression and activity of MMP-2 varies during the development and maturation of rat first molar tooth germ

Expressão e atividade da metaloproteinase de matriz-2 (MMP-2) durante o desenvolvimento do germe dental do primeiro molar de ratos

Tooth germ development is associated with morphological and biochemical changes of the dental papilla and enamel organ. Enzymes with gelatinolytic activities were studied by semiquantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and enzymography in tooth germ of newborn to 15-day-old rats. Three major bands with gelatinolytic activity were detected at all periods and characterized as the latent and active forms of MMP-2 using their molecular weight and activity dependent on Zn++ and Ca++ ions as criteria. Expression and activity of MMP-2 increased progressively from 0 to 15 days after birth. Mechanical separation of the tooth germ from 10-day-old rats showed that the gelatinolytic activity was localized mainly in the dental papilla and not the dental organ. These data indicate that the expression and activity of MMP-2 varies during the development and maturation of rat first molar tooth germ.O desenvolvimento do germe dental está associado a alterações morfológicas e bioquímicas da papila dental e do órgão do esmalte. A expressão e atividade de enzimas com atividade gelatinolítica de germes dentais dos primeiros molares de ratos recém nascidos e com 1, 3, 5, 7 10 e 15 dias de vida foram analisadas pelo método semiquantitativo da transcriptase reversa-reação da polimerase em cadeia (RT-PCR) e por enzimografia. Três enzimas com atividade gelatinolítica foram detectadas em todos os períodos e caracterizadas como sendo as formas latente e ativa da metaloproteinase de matriz-2 (MMP-2), utilizando-se como critérios à massa molecular e a atividade dependente dos íons Zn++ e Ca++. A expressão e atividade de MMP-2 aumentaram progressivamente do nascimento até o 15º dia de vida. A separação mecânica do germe dental demonstrou que a expressão de MMP-2 é maior na região da papila dental quando comparada ao órgão dental. Estes resultados indicam que a expressão e atividade de MMP-2 se apresentam variáveis durante o desenvolvimento e maturação do germe dental do primeiro molar de ratos.9710